無菌檢查操作規(guī)程2015(1)

1、無菌檢查操作規(guī)程1. 目的建立無菌檢查標準操作規(guī)程，確保檢查結果準確、可靠。2. 使用范圍本公司無菌產(chǎn)品的無菌檢查3. 職責質(zhì)量部QC4. 依據(jù)2015版中國藥典通則1101GB/T 19973.2-2005（ISO11737-2:1998） 療器械的滅菌 微生物學方法 第 2部分：確認滅菌過程的無菌試驗GB/T 14233.2-2005 醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法 第 2部分：生物學試驗方法5. 內(nèi)容5.1. 無菌檢查環(huán)境保障5.1.1. 無菌檢査的所有操作均需在嚴格控制微生物污染的環(huán)境下進行，即無菌檢査應在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進行

2、。5.1.2. 操作環(huán)境的無菌保障程度將直接影響無菌檢查結果，為了保證無菌檢查用潔凈室（區(qū)）環(huán)境的穩(wěn)定性，確保檢查結果的可靠性，對潔凈室（區(qū)）的環(huán)境定期監(jiān)測并采取合理的措施保證潔凈環(huán)境符合要求。5.1.3. 無菌檢查全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止微生物污染。5.1.4. 潔凈區(qū)的溫度、濕度等參數(shù)必須符合相應潔凈級別的要求。5.1.5. 無菌檢查操作還需要對檢查環(huán)境進行監(jiān)控，5.2. 培養(yǎng)基、稀釋液、緩沖液5.2.1. 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，市售培養(yǎng)基干粉。除另有規(guī)定，接種后應置3035培養(yǎng)。5.2.2. 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，市售培養(yǎng)基干粉。接種后應置2035培養(yǎng)。5.2.3. 中和或滅活用

3、培養(yǎng)基，按上述硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的處方及制法，在培養(yǎng)基滅菌或使用前加入適宜的中和劑、滅活劑或表面活性劑，其用量同方法適用性試驗。5.2.4. 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，市售培養(yǎng)基干粉。5.2.5. 沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，市售培養(yǎng)基干粉。5.2.6. 沙式葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，市售培養(yǎng)基干粉。5.2.7. PH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液，市售培養(yǎng)基干粉。5.2.8. 0.9%無菌氯化鈉溶液。5.2.9. 培養(yǎng)基使用性檢查 無菌檢査用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基等應符培養(yǎng)基的無菌性檢査及靈敏度檢査的要求。本檢查可在供試品的無菌檢査或與供試品的無菌檢査同時進行。5.2.

4、9.1. 無菌性檢查：每批培養(yǎng)基隨機取5支（瓶），按各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度下培養(yǎng)14天，應無菌生長。5.2.9.2. 靈敏度檢查5.2.9.2.1. 菌種：培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代數(shù)不得超過5代(從菌種存中心獲得的干菌種第0代），并采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以證試驗菌株的生物學特性 。 金黃色葡萄球菌CMCC(B)26 003 銅綠假單胞菌CMCC(B)10 104 枯草芽孢桿菌CMCC(B)63 501 生孢梭菌CMCC(B)64 941 白色念珠菌CMCC(F)98 001 黑曲霉CMCC(F)98 0035.2.9.2.2. 菌液制備：接種金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽孢桿菌的

5、培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)1824小時；接種白色念珠菌的培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，2025培養(yǎng)2448小時，上述培養(yǎng)后的新鮮培養(yǎng)物用PH7.0無菌化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌化鈉溶液制成每lml菌數(shù)小于100cfu(菌落形成）的菌懸液。接種黑曲霉的培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂面培養(yǎng)基上，2025培養(yǎng)57天，加人35 ml 0.05%(ml/ml) 聚山梨酯80的pH7.0無菌化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用0

6、.05% (ml/ml)聚山梨醋80的pH7.0無菌化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成每lml孢子數(shù)量小于100cfu的孢子懸液。菌懸液若在室溫下放置，應在2小時內(nèi)使用；若保存在28 在24h 內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液存在28，在驗證過的貯存期內(nèi)用。5.2.9.2.3. 培養(yǎng)基接種：取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7支，分別接種小于100cfu的色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)3天；取每管裝量為9ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支，分別接種小于100cfu的草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)5天。逐日觀察

7、結。5.2.9.2.4. 結果判定：空白管應無菌生長，加菌的管生長良好，說明該培養(yǎng)基靈敏度符合規(guī)定。5.3. 方法試用性試驗進行產(chǎn)品無菌檢查時，應進行方法適用性試驗，以確認所采用的方法適合于產(chǎn)品的無菌檢查。若檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生化可能影響檢驗結果時，應重新進行方法適用性試驗。方法適用性試驗按“5.4供試品的無菌檢查”的規(guī)定及下列要求進行操作。對每一試驗菌應逐一進行方法。5.3.1. 菌種及菌液的制備：大腸埃希菌CMCC(B)44 102外，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌株及菌液制同“5.2.9.2培養(yǎng)基靈敏度檢查”。大腸埃希菌的菌液制同金黃色葡萄球菌。5.3.2.

8、 薄膜過濾法：每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu試驗菌，過濾。加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。置規(guī)定溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不得超過5天，各試驗菌同法作。5.3.3. 直接接種法：取符直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基6管，分別接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各2管，取符直接接種法培養(yǎng)基用量要求的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基6管，分別接入小于100cfu的枯草芽孢桿菌 、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接

9、種量，另1管作對照，置規(guī)定的溫度培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不得超過5天。5.3.4. 結果判斷：與對照管比較，如供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的檢驗量在檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢査方法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。如供試品的任一容器中的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的檢驗量在檢驗條件下有抑菌作用，應采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的用量、用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法適用性試驗。 方法適用性試驗與供試品的無菌檢查同時進行。5.4. 供試品無菌檢查無菌檢査法括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性質(zhì)允許，應采用薄膜過

10、濾法。供試品無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗條件應與方法適用性試驗確認的方法相同。無菌試驗過程中，若需用面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應證明其有效性，且對微生物無毒性。5.4.1. 檢驗數(shù)量：除另有規(guī)定外，按表1規(guī)定。5.4.2. 檢驗量：即接種量，除另有規(guī)定外，按表2規(guī)定。5.4.3. 陽性對照：應根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌：無抑菌作用及抗革蘭氏陽性菌為主的供試品，以金色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭氏陰性菌為主的供試品，以大腸埃希菌為對照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對照菌；抗真菌的供試品，以白色珠菌為對照菌。陽性對照試驗的菌液制同“5.2.9.2培養(yǎng)基靈敏度檢查”，加菌量小于100cfu

11、，供試品用量同供試品無菌檢查時每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對照管培養(yǎng)72小時內(nèi)應生長良好。5.4.4. 陰性對照：供試品無菌檢查時，應取相應溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。5.4.5. 供試品的處理及接種培養(yǎng)基操作時，用適宜的消毒液對供試品容器面進行徹消毒，如供試品容器內(nèi)有一定的真空度，可用適宜的無菌器材(如帶有除菌過濾的針頭向容器內(nèi)導入無菌空氣，再按無菌操作啟開容器取出內(nèi)物。5.4.5.1. 薄膜過濾法：薄膜過濾法一般應采用封閉式薄膜過濾。無菌檢査用的濾膜孔徑應不大于0.45um，直徑約50mm。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。使用時，應保證濾膜在過濾

12、前后的完整性。 5.4.5.1.1. 水溶性供試品：水溶性供試液過濾前應先將少量的沖洗液過濾，以潤濕濾膜。取規(guī)定量，直接過濾，或混至含不少于100ml適宜的稀釋液的無菌容器中，混勻，立即過濾。如供試品有抑菌作用，須用沖洗液沖洗濾膜，沖洗數(shù)一般不少于3次（每濾膜每次沖洗量一般為100ml，且沖洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷），所用的沖洗量、沖洗方法同方法適用性試驗中確定的。除生物制品外，一般樣品沖洗后，1份濾器中加人100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，1份濾器中加入100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。5.4.5.1.2. 非水溶性供試品：取規(guī)定量，直接過濾；或混合溶于適量含聚山梨酯

13、80或其他適宜乳化劑的稀釋液中，充分混合，立即過濾。用含0.1%1 %聚山梨酯80的沖洗液沖洗濾膜至少3次。加入含或不含聚山梨酯80的培養(yǎng)基。接種培養(yǎng)基照水溶液供試品項下的方法作。5.4.5.1.3. 具有導管的醫(yī)療器具（輸血、輸液袋等）供試品：取規(guī)定量，每個最小裝用50100ml沖洗液分別沖洗內(nèi)壁，收集沖洗液于無菌容器中，然后照水溶液供試品項下方法作。同時應采用直接接種法進行裝中所配帶的針頭、針管的無菌檢査。5.4.5.2. 直接接種法：直接接種法適用于無法用薄膜過濾法進行無菌檢査的供試品，即取規(guī)定量供試品分別等量接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。除生物制品外，一般樣品無菌

14、檢查時兩種培養(yǎng)基接種的瓶或支數(shù)相同。除另有規(guī)定外，每個容器中培養(yǎng)基的用量不得大于接種到該容器中的供試品體積的10倍，同時，硫乙醇酸流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml，胰大豆胨液體培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。供試品檢査時，培養(yǎng)基的用量和髙度同方法適用性試驗中確定的。5.4.5.2.1. 滅菌醫(yī)用器具供試品：取規(guī)定量，必要時應將其拆散或切成小碎段，等量接種于各管以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。5.4.6. 培養(yǎng)及觀察：將上述接種供試品后的培養(yǎng)基容器分別按各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天；培養(yǎng)期間應逐日觀察并記錄是有菌生長。如在加入供試品后或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微

15、生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。5.4.7. 結果判斷5.4.7.1. 陽性對照管應生長良好 ，陰性對照管無菌生長，供試品管都無菌生長，則供試品符合規(guī)定。5.4.7.2. 陽性對照管應生長良好 ，陰性對照管無菌生長，供試品管中有任意一管有菌生長，則供試品不符合規(guī)定。5.4.7.3. 陽性對照管應生長良好 ，陰性對照管無菌生長，供試品管渾濁，經(jīng)確鑿無菌生長，則供試品符合規(guī)定；經(jīng)確證有菌生長，則供試品不符合規(guī)定。5.4.7.4. 有以下情況的，判試驗無效。5.4.7.4.1. 無菌檢查試驗

16、所用的設備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結果不符合無菌檢查法的要求。5.4.7.4.2. 回顧無菌試驗過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素，并且已經(jīng)確證。5.4.7.4.3. 供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無菌試驗中所用的物品和（或)無菌操作技術不當引起的。5.4.7.5. 試驗若經(jīng)確認無效，則應重試。重試時，重新取同量供試品，依法檢查，若無菌生長，判供試品符規(guī)定；若有菌生長，判供試品不符規(guī)定。6. 相關文件潔凈區(qū)塵埃粒子監(jiān)測操作規(guī)程潔凈區(qū)沉降菌監(jiān)測操作規(guī)程實驗室潔凈區(qū)清潔、消毒操作規(guī)程潔凈區(qū)環(huán)境監(jiān)測管理規(guī)程ZW型集菌儀使用、維護操作規(guī)程SPX-150型生化培養(yǎng)箱使用、維護操作規(guī)程MJK-150

17、型霉菌培養(yǎng)箱使用、維護操作規(guī)程SW-CJ系列潔凈工作臺使用、維護規(guī)程陽性菌種管理規(guī)程7. 記錄無菌檢查原始記錄附表：表1：批出廠產(chǎn)品的最少檢驗數(shù)量供試品批產(chǎn)量接種每種培養(yǎng)基的最少檢驗數(shù)量醫(yī)療器具10010%或4件（取較多者）100<N50010件5002%或20件（取較少者）注：表中最少檢驗數(shù)量不包括陽性對照用的供試品數(shù)量表2：供試品的最少檢驗量供試品供試品裝量每支供試品接入每種培養(yǎng)基的最少量醫(yī)療器具外科用敷料棉花及紗布取100mg或1×3cm縫合線、一次性醫(yī)用材料整個材料（注）帶導管的一次醫(yī)療器具二分之一內(nèi)表面積其他醫(yī)療器具整個器具（注）（切碎或拆散開）注：如果醫(yī)療器械體積過

18、大，培養(yǎng)基用量可再2000ml以上，將其整個完全浸沒。無菌檢查原始記錄（薄膜過濾法） 檢驗編號：產(chǎn)品名稱型號規(guī)格產(chǎn)品數(shù)量產(chǎn)品批號滅菌批號滅菌有效期來源檢品數(shù)量檢驗日期年 月 日完成日期年 月 日檢驗依據(jù)無菌檢查標準操作規(guī)程檢驗結果培養(yǎng)基： 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 配制批號： 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基 配制批號： 稀釋液、沖洗液：0.1%蛋白胨水溶液 PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液 0.9%無菌氯化鈉溶液 其他 配制批號： 陽性對照菌菌液：取對照菌新鮮培養(yǎng)物，接種至適量的0.9%無菌氯化鈉溶液中，取1ml進行10倍系列稀釋，取稀釋液作為對照菌液。對照菌名稱： 代數(shù)： 計數(shù)結果： cfu/ml儀器設備：

19、ZW-808A型集菌儀 儀器編號： MJX-150霉菌培養(yǎng)箱 （2025） 儀器編號： SPX-150生化培養(yǎng)箱 （3035） 儀器編號： 無菌集菌器：批號： 生產(chǎn)廠家： 凈化工作臺環(huán)境監(jiān)測 溫度： 濕度： % 沉降菌標準（培養(yǎng)溫度：3035）：<1cfu/皿 碟號培養(yǎng)時間 123結果判斷培養(yǎng)48h菌落數(shù) 培養(yǎng)天數(shù)培養(yǎng)基 1234567891011121314硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（3035）樣品陽性陰性胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（2025）樣品陰性注：逐日觀察，集菌器中有菌生長則填“+”，無菌生長則填“-”結果判定：本品按無菌檢查標準操作規(guī)程依法檢查，結果檢驗人/日期： 復核人/日期：無菌檢查原始記錄（直接接種法） 檢驗編號：產(chǎn)品名稱型號規(guī)格產(chǎn)品數(shù)量產(chǎn)品批號滅菌批號滅菌有效期來源檢品數(shù)量檢驗日期年 月 日完成日期年 月 日檢驗依據(jù)無菌檢查標準操作規(guī)程