靶向位于線粒體的circRNA SCAR通過減少mROS輸出緩解NASH

1、靶向位于線粒體的circRNA SCAR通過減少mROS輸出緩解NASH導讀在免疫代謝疾病中發(fā)揮核心作用的線粒體擁有自己的基因組。然而，由于缺乏特定的傳遞系統(tǒng)，線粒體定位的非編碼RNA的功能在很大程度上是未知的。通過對非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者的肝成纖維細胞中環(huán)狀RNA(circRNA)表達譜分析，研究發(fā)現(xiàn)，在NASH成纖維細胞中，下調的circRNA中大多數(shù)為線粒體circRNA。通過構建靶向線粒體的納米顆粒，研究觀察到，位于線粒體中的脂肪肝相關circRNA ATP5B調節(jié)因子(SCAR)抑制了線粒體ROS (mROS)的輸出和成纖維細胞的激活。circRNA SCAR由PGC-1

2、介導，與ATP5B結合，通過阻斷CypD-mPTP相互作用而關閉mPTP。過多脂質通過內質網(wǎng)(ER)應激誘導的CHOP而抑制PGC-1。在人體內，靶向circRNA SCAR可以減輕高脂肪飲食引起的肝硬化和胰島素抵抗。臨床上，circRNA SCAR與脂肪變性到NASH這一發(fā)展過程相關?？傊?，研究確定了一種線粒體circRNA，它促進代謝性炎癥并作為NASH的治療靶點。實驗設計結果1 脂質暴露的成纖維細胞的促炎性表型需要mROS成纖維細胞介導多種疾病的纖維化。其中，NAFLD影響了全球25%的人口。為了研究NAFLD患者成纖維細胞的線粒體代謝，本研究從NASH肝硬化和非NAFLD患者

3、的肝組織中分離出成纖維細胞。利用海馬細胞外通量分析儀，研究觀察到與正常成纖維細胞相比，NASH成纖維細胞中細胞外酸化速率(ECAR)和耗氧率(OCR)增加(圖1A)。然而，NASH成纖維細胞中ECAR/OCR比值顯著升高(圖1B)。同樣，棕櫚酸鹽處理的正常成纖維細胞的ECAR/OCR比值也明顯增加(圖1C)，這概述了體外脂質暴露。另外，棕櫚酸鹽處理略微增加了成纖維細胞的凋亡(圖S1A)。總之，這些數(shù)據(jù)表明，在脂質負擔下，成纖維細胞中ATP的產(chǎn)生從線粒體氧化磷酸化轉變?yōu)樘墙徒狻?#160;電子傳遞鏈的質子泵產(chǎn)生的線粒體膜電位(m)是產(chǎn)生ATP所必需的。因此，研究JC-1熒光評估了m，發(fā)現(xiàn)NASH

4、成纖維細胞的m明顯降低(圖1D和1E)。電鏡顯示m降低后伴有線粒體腫脹(圖1F)，提示線粒體應激。ROS經(jīng)常在線粒體應激中增加。因此，研究采用兩種方法，包括熒光染料Mito-SOX和DCFH-DA，評估了線粒體中ROS(mROS)和細胞質ROS(cROS)，以及分別用室間特異性ROS傳感器mitoORP和cytoORP進行轉導。抑制m同時，NASH成纖維細胞中mROS和cROS均顯著增加(圖1G-1J)。同樣，棕櫚酸鹽暴露顯著增加了mROS和cROS水平(圖S1B和S1C)。mROS可通過線粒體通透性轉換孔(mPTP)釋放到細胞質中，這是cROS的重要來源。同樣，mPTP抑制劑(環(huán)孢素A)顯著

5、降低了棕櫚酸鈉處理的NASH成纖維細胞和正常成纖維細胞的cROS水平(圖S1D和S1E)。這些數(shù)據(jù)表明，脂質暴露的成纖維細胞表現(xiàn)出線粒體應激，mROS產(chǎn)生升高，并向細胞質中外泄。 雖然ROS對多種免疫細胞的最佳活化是必需的，但ROS是否介導成纖維細胞激活仍不清楚。為了解決這個問題，研究用ROS抑制劑治療原發(fā)性NASH成纖維細胞，觀察到逆轉了收縮性(圖1K)、膠原合成和-SMA的表達(圖1L)。此外，抑制ROS抑制了炎癥細胞因子的分泌(圖1M)。同樣，抑制ROS消除了棕櫚酸鹽處理成纖維細胞的促纖維化和促炎癥的功能(圖S1F和S1G)。總的來說，這些結果表明脂質積累增加了mROS的輸出，

6、從而促進成纖維細胞的活化。圖1 脂質暴露的成纖維細胞的促炎性表型一定需要mROS。2 脂質暴露誘發(fā)成纖維細胞中線粒體circRNomics的不平衡環(huán)狀RNA(circRNAs)是多種細胞類型的關鍵信號調節(jié)因子。然而，circRNA在成纖維細胞中的作用尚不清楚。因此，研究比較了4例NASH肝硬化患者和4例非NAFLD患者分離的原代成纖維細胞的circRNA表達譜。15個和11個circRNA在NASH成纖維細胞中分別持續(xù)上調和下調(圖2A和S2A-S2C)。引人注目的是，盡管核circRNA在整個circRNomics中占大多數(shù)(圖S2D)，但很大一部分(11個circRNA中有4個)

7、下調的circRNA是由線粒體基因組編碼的(圖2B)。其中，NASH患者中3個線粒體circRNA(mito-circRNAs)的抑制通過qRT-PCR在另一個由18例NASH肝硬化患者和20例非NAFLD患者組成的隊列中得到驗證(圖2C)。分離實驗表明，這些circRNA主要定位于線粒體而不是細胞質中(圖2D)。擴增PCR和測序分析表明，這3個mito-circRNA都是由線粒體基因組通過“反向拼接”機制生成的(圖S2E)。盡管hsa_circ_0089763外顯子之間保留有一個內含子，但成熟轉錄本均含有外顯子序列。其中，hsa_circ_0089762和hsa_circ_0089763由m

8、ito-DNA的輕鏈產(chǎn)生，hsa_circ_0008882由重鏈產(chǎn)生(圖2E)。為了研究這些mito-circRNA，研究構建了線粒體靶向納米顆粒(mito-NP)。mito-NP含有一種核內體PH響應聚合物，可以在核內體酸性微環(huán)境下被質子化，從而在細胞攝取后從核內體釋放復合物。此外，它由包裹的circRNA表達載體和三苯膦(TPP)修飾的兩親性陽離子肽(TACP)組成，它們專門將包裹的載體傳遞到線粒體(圖2F)。采用動態(tài)光散射法測定mito-NP的大小和zeta電位，通過標記封裝在mito-NP中的載體檢測circRNA表達載體的包封率(EE%)為90.86%±3.24% (Tab

9、le S1)。免疫熒光顯微鏡顯示，當表達GFP的載體與lipo3000轉染成纖維細胞時，只有12.35%±2.35%的GFP信號與線粒體共定位(圖2G、2H和S2F)。相比之下，用mito-NP孵育成纖維細胞時，GFP信號與線粒體共定位90.84%±2.22%(圖2G、2H和S2F)，說明mito-NP靶向線粒體的特異能力。 使用這個線粒體靶向的納米顆粒，研究觀察到過表達hsa_circ_0089762(脂肪性肝炎相關的circRNA ATP5B調節(jié)因子SCAR)而不是hsa_circ_0008882顯著降低NASH成纖維細胞內的cROS(圖2I和S2G)。構建一

10、個線粒體特異性表達載體是當前線粒體靶向技術的一個常見障礙。因此，研究不能構建hsa_circ_0089763 mito-NP?？傊@些數(shù)據(jù)表明抑制mito-circRNA可能在NASH成纖維細胞的激活中發(fā)揮作用。圖2 脂質暴露誘發(fā)成纖維細胞中線粒體circRNomics的不平衡。3 位于線粒體中 circRNA SCAR抑制成纖維細胞的激活接下來，研究進一步探討了circRNA SCAR在成纖維細胞活化中的作用。使用特定探針檢測circBase中SCAR的圓形轉錄本，而不是已知的線性轉錄本(圖3A)，RNA熒光原位雜交(FISH)和免疫熒光共染色顯示，90.38%

11、7;2.56%的內源性circRNA SCAR信號在線粒體內共定位(圖3B)。研究分別使用檢測SCAR圓形和線性轉錄本的引物(圖3C)，進行了絕對qRT-PCR。研究的數(shù)據(jù)顯示，circRNA SCAR為966.37±114.68拷貝/每個正常成纖維細胞，明顯高于其線性版本(443.27±43.69) (圖3D和S3A)。NASH成纖維細胞中圓形和線性的SCAR顯著減少(圖3D)。在NASH成纖維細胞中，圓形SCAR和線性SCAR的比例進一步增加(圖S3B)。研究通過RNase R酶切分析證實circRNA SCAR為circRNA(圖3D)。 circRNA S

12、CAR起源于其宿主基因(JA760602)的第二個外顯子(圖2E)。研究將外顯子2插入到circRNA過表達載體中(圖3C)，并將其封裝在mito-NP中。circRNA SCAR的mito-NP顯著增加了circRNA SCAR(圖3E)，但對未剪接的前體或線性轉錄本無明顯影響(圖S3C)。抗RNase R的線粒體片段中的circRNA SCAR水平遠高于細胞質片段中的(圖3E)。此外，Northern blot分析表明，circRNA SCAR的mito-NP治療顯著增加抗RNase R的circRNA SCAR。相反，其對RNase R敏感的線性轉錄本保持不變(圖3)。此外，該載體RNA

13、產(chǎn)物的測序結果與內源性circRNA SCAR完全吻合(圖S3D)。 在功能上，線粒體特異性的circRNA SCAR過表達顯著降低了mROS和cROS水平(圖S3E)，逆轉了NASH成纖維細胞中m的抑制(圖3G)，研究發(fā)現(xiàn)對ECAR/OCR比率沒有明顯影響(圖S3F)。這些數(shù)據(jù)表明，circRNA SCAR在線粒體中抑制ROS的產(chǎn)生和m的降低。 考慮到脂質負擔導致mROS積累，研究想知道circRNA SCAR是否可以通過脂質治療來調節(jié)。事實上，研究觀察到棕櫚酸鹽顯著降低了circRNA SCAR的表達(圖3H)。更重要的是，circRNA SCAR的mito-NP的培養(yǎng)

14、消除了mROS和cROS的升高(圖3I)和m的降低(圖3J)，表明脂質抑制的circRNA SCAR調節(jié)了線粒體中ROS的釋放和m。 在棕櫚酸鹽處理的成纖維細胞中敲低circRNA SCAR進一步增加了mROS，降低了m (圖S3G-S3I)，這與過表達實驗結果相一致。然而，沉默circRNA SCAR對正常成纖維細胞無明顯影響(圖S3G、S3J、S3K)，暗示單純抑制circRNA SCAR對正常成纖維細胞ROS或m無顯著影響。 接下來，研究者研究了circRNA SCAR是否也調節(jié)成纖維細胞的促纖維化功能。circRNA SCAR過表達顯著降低了NASH成纖維細胞中膠原

15、和-SMA的表達(圖3K)、膠原收縮(圖3L)和細胞因子分泌(圖3M)。同樣，circRNA SCAR過表達也抑制棕櫚酸鹽處理成纖維細胞的活化(圖S3L和S3M)。此外，在棕櫚酸鹽處理的成纖維細胞中沉默circRNA SCAR進一步增強了其纖維化前的表型(圖S3N和S3O)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，脂質負荷抑制mito-circRNA SCAR，從而抑制ROS的升高和成纖維細胞的激活。圖3 circRNA SCAR位于線粒體中，抑制成纖維細胞激活。 4 circRNA SCAR直接與ATP5B結合接下來，研究者研究了circRNA SCAR形成的機制。雖然circRNA SCA

16、R預測了一個潛在的開放閱讀框(ORF)，但研究在其終止密碼子上游插入了一個33 FLAG-coding序列，在潛在的ORF序列中未檢測到標記蛋白(圖S4A)，表明circRNA SCAR可能是非編碼RNA。此外，研究確定了circRNA SCAR中幾種microRNA的假定結合位點(圖S4B)。然而，這些microRNA都沒有超過兩個結合位點的，也沒有被線粒體基因組轉錄，這表明circRNA SCAR并不是microRNA的基底。此外，研究沒有觀察到過表達circRNA SCAR導致其宿主基因(JA760602)發(fā)生明顯變化(圖S3C)，排除了調控JA760602轉錄本的機制。 RN

17、A結合蛋白在circRNA功能中起關鍵作用。使用RNA下拉實驗和質譜分析，研究鑒定了8個被circRNA SCAR特異性生物素化探針下拉的蛋白(圖S4C)。其中檢測到作為ATP5A和ATP5B調控因子的mPTP脫穎而出(圖4A)，western blotting進一步驗證了這一點(圖4B)。反之，RNA免疫沉淀(RIP)顯示circRNA SCAR由ATP5A或ATP5B特異性沉淀(圖4C)。由于ATP5A與ATP5B結合，那circRNA SCAR是否直接與ATP5A或/和ATP5B結合。為了解決這個問題，研究采用體外RNA/蛋白相互作用試驗，發(fā)現(xiàn)circRNA SCAR直接拉下了重組ATP

18、5B，而不是ATP5A。此外，circRNA SCAR只能在ATP5B存在的情況下檢索ATP5A(圖4D)。同樣，敲低內源性ATP5B基因使得circRNA SCAR與ATP5A的結合失效(圖4E)，而沉默ATP5A基因對circRNA SCAR-ATP5B的相互作用沒有明顯的影響(圖S4D)。 ATP5B固定在線粒體內膜的基質上。研究對外膜剝離的線粒體和有絲分裂體進行了純化，觀察到它們的circRNA SCAR水平具有可比性(圖S4E和S4F)，表明circRNA SCAR并不主要位于外膜或膜間空間。為了研究ATP5B、circRNA SCAR和mito-NP是否在同一個空間中，研

19、究采用了一種工程抗壞血酸過氧化物酶(APEX)標記方法來識別活細胞中RNA或蛋白質的特定線粒體區(qū)域。研究將以APEX為靶點的正常成纖維細胞轉染到不同的區(qū)域，并使用鏈霉親和素磁珠收獲不同的部分。ATP5B和circRNA SCAR主要存在于基質和面向基質的內膜(基質-APEX)中，而不存在于膜間空間(IMS-APEX)或外膜(OMM-APEX)中(圖4F-4H)。此外，研究將含有GFP表達載體的mito-NP應用于分別轉染3種不同的APEX表達質粒的成纖維細胞。在基質-APEX沉淀的部分中主要檢測到GFP(圖S4G)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明ATP5B、circRNA SCAR和mito-NP在同一亞

20、線粒體中。 本研究和其他人已經(jīng)證明，非編碼RNA通常通過莖環(huán)結構與蛋白質相互作用。因此，研究構建了一系列SCAR截斷片段，發(fā)現(xiàn)nt 100-182的SCAR (SCAR100-182)，形成雙鏈莖結構(圖S4H)，與ATP5B相互作用(圖4I)。此外，在circRNA SCAR表達的NASH成纖維細胞中，破壞配對區(qū)域的核苷酸突變消除了ATP5B RIP試驗中增強的SCAR富集(圖4J)和ROS抑制(圖4K和S4I)。 雖然缺乏關于ATP5B-RNA結合的報道，但研究在一個已發(fā)表的質譜數(shù)據(jù)庫中確定了ATP5B結構域(ILQDYK)是一個潛在的RNA結合區(qū)域。這6個氨基酸的突變

21、，而不是相鄰部分的突變，使得ATP5B不能與circRNA SCAR結合(圖4L)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明circRNA SCAR中的100-182 motif與ATP5B中的區(qū)域ILQDYK結合。 圖4 circRNA SCAR直接與ATP5B結合。 5 circRNA SCAR通過阻斷CypD-mPTP相互作用來關閉mPTP mPTP的開放降低了m，增加了mROS的生成和釋放。circRNA SCAR抑制ROS輸出和m的降低，可以直接結合ATP5B，ATP5B是mPTP調節(jié)器。為了評估circRNA SCAR是否阻礙mPTP開放，研究采用c

22、alcein釋放試驗，發(fā)現(xiàn)棕櫚酸鹽導致calcein熒光明顯下降，提示mPTP開放。更重要的是，circRNA SCAR過表達逆轉了棕櫚酸鹽誘導的mPTP開放(圖5A)。研究始終在NASH成纖維細胞中觀察到類似的結果(圖S5A)。探討circRNA SCAR對mPTP開放的影響是否依賴于其與ATP5B的結合，研究應用了含circRNA SCAR突變體的mito-NP，其與ATP5B的結合被消除(圖5B)。circRNA SCAR在calcein熒光上的過表達完全缺失(圖5A和S5A)，提示與ATP5B結合對于circRNA SCAR關閉mPTP是不可或缺的。 CypD是mPTP打開的

23、主要促進因子，與ATP合成酶結合，ATP5B位于ATP合成酶中。因此，circRNA SCAR是否會破壞CypD-mPTP的相互作用。免疫沉淀實驗顯示棕櫚酸鹽顯著增強了CypD與mPTP的結合，而這一作用被野生型circRNA SCAR的過表達而明顯抑制(圖5C)。沉默CypD(圖S5B)挽救了circRNA SCAR對棕櫚酸鹽處理過表達突變成纖維細胞mPTP開放的抑制作用(圖5D)。同樣，研究觀察到對m抑制(圖5D)、ROS生成(圖5E)、膠原蛋白收縮(圖5E)和細胞因子產(chǎn)生(圖5G)也有類似的效果。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明circRNA SCAR直接結合ATP5B，干擾CypD-mPTP交互

24、，阻止mPTP打開，減少mROS輸出。 圖5 circRNA SCAR通過阻斷CypD-mPTP相互作用來關閉mPTP。 6 脂質誘導的內質網(wǎng)應激通過CHOP抑制PGC-1介導circRNA SCAR表達 SCAR宿主基因所在的線粒體光鏈被轉錄為一個大的多順反子前體轉錄本，然后被加工成功能單位。核編碼剪接體的組成部分，包括eIF4A3和7個核內不均一核糖核蛋白(hnRNP)，調節(jié)線粒體RNA的生物發(fā)生。確定其中是否有circRNA SCAR參與生物發(fā)生過程，研究用相應的小干擾RNA (siRNA)轉染正常成纖維細胞。沉默hnRNPM，而不是其他(圖S6A

25、)，會增加circRNA SCAR水平和圓形/線形SCAR之間的比率(圖6A)。事實上，CLIP-seq數(shù)據(jù)顯示，SCAR 無拼接前體的外顯子和側翼內含子含有hnRNPM的結合位點(圖6B)，RIP和qRT-PCR實驗得到了驗證(圖6C)。此外，RNase L可以介導核circRNA的降解。有趣的是，雖然RNase L在線粒體中的分布遠小于在細胞質中的分布(圖6D)，沉默RNase L增加了poly(I:C)處理成纖維細胞的circRNA SCAR水平(圖6E和S6B)?？偟膩碚f，這些結果表明mito-circRNAs不是隨機的轉錄錯誤，而是在其形成和降解過程中受到調控。 脂質對ci

26、rcRNA SCAR的下調促使研究探索其表達機制。生物信息學分析確定了一個假定的PGC-1位點，位于25 18bp的光鏈啟動子，負責線粒體基因組中的circRNA SCAR轉錄(圖6F)。ChIP實驗顯示抗PGC-1抗體沉淀了此基序(圖6G)。與circRNA SCAR表達一致的是，棕櫚酸鹽顯著減少PGC-1(圖6H)及其與線粒體中假定基序的結合(圖6G)。此外，沉默PGC-1顯著降低circRNA SCAR表達(圖6I 和S6C)，表明PGC-1調控circRNA SCAR轉錄。 脂質超載導致內質網(wǎng)應激。事實上，研究發(fā)現(xiàn)棕櫚酸鹽處理的成纖維細胞(圖6J)和原發(fā)性NASH成纖維細胞(

27、圖6K)中內質網(wǎng)應激標志物上調。內質網(wǎng)應激的中介物CHOP可以抑制PGC-1。為了研究CHOP是否抑制成纖維細胞中的PGC-1，研究沉默了CHOP，觀察到棕櫚酸鹽處理的成纖維細胞中PGC-1的表達恢復到了與未處理成纖維細胞相當?shù)乃?圖6L)。PGC-1表達同時敲低CHOP也減輕了棕櫚酸鹽誘導的circRNA SCAR抑制(圖6M)。同樣，研究在NASH成纖維細胞中觀察到類似的效果(圖S6D和S6E)?？偟膩碚f，這些結果表明脂質誘導的內質網(wǎng)應激拮抗劑PGC-1依賴于CHOP的circRNA SCAR表達。 圖6 脂質誘導的內質網(wǎng)應激通過CHOP抑制PGC-1介導circRNA SCA

28、R表達。 7 circRNA SCAR減輕高脂飲食誘導的小鼠肝硬化 雖然研究沒有鑒定出circRNA SCAR的小鼠同源物，ATP5B的蛋白序列在人和小鼠中高度保守(96.22%)。使用人類非編碼RNA與小鼠蛋白相互作用的治療策略已經(jīng)被證明。的確，人類circRNA SCAR可以與小鼠ATP5B結合(圖S7A)。circRNA SCAR過表達抑制小鼠成纖維細胞中mPTP開放(圖S7B)、cROS釋放(圖S7C)和膠原收縮(圖S7D)。 為了評估m(xù)ito-NP是否能在體內有效地導入肝成纖維細胞的線粒體，研究用Cy5熒光標記了circRNA表達載體

29、。空載體或經(jīng)mito-NP包封載體經(jīng)尾靜脈注射至小鼠體內。與空載體相比，mito-NP在主要器官中表現(xiàn)出更高的熒光信號。其中，肝臟mito-NP積累最高(圖7A和圖S7E)。為了調查細胞中mito-NP攝取的百分比，研究從肝臟中分離成纖維細胞。注入空載體和mito-NP后，成纖維細胞Cy5+的比例分別為20.32%±3.67%和74.12%±7.05%(圖7B和S7F)。為了量化線粒體中mito-NP的積累，研究對細胞器進行了分離，觀察到線粒體中mito-NP的富集量是細胞質的10倍以上(圖7C和S7G)。 為了研究體內circRNA SCAR的治療潛力，研究將含有mito-NP的circRNA SCAR過表達載體或空載體尾靜脈注入小鼠，且每3天喂食高脂肪食物。研究沒有觀察到mito-NP對小鼠的明