實(shí)驗(yàn)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

1、實(shí)驗(yàn)五 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握考馬斯亮藍(lán)染色法定量測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理與方法2. 熟練分光光度計(jì)的使用和操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理考馬斯亮藍(lán)G250測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種，它與蛋白 質(zhì)的疏水微區(qū)相結(jié)合，這種結(jié)合具有高敏感性。它在酸性溶液中呈棕紅色, 最大光吸收峰在465nm,當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)，其最大吸收峰 改變?yōu)?95nmo考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白質(zhì)復(fù)合物呈藍(lán)色，在一定范圍內(nèi)， 595nm下光密度與蛋白質(zhì)含量呈線(xiàn)性關(guān)系，故可以用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。 考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的蛋白質(zhì)定量測(cè)定法，本方法具有操 作方便、快速、干擾因素少的特點(diǎn)。離

2、心機(jī)的使用說(shuō)明：1.要離心的離心管和管套要稱(chēng)重，重量不等時(shí) 將水加在管套里。2.離心管的放置是對(duì)角線(xiàn)放置，要求必須對(duì)稱(chēng)。3. 先將離心機(jī)轉(zhuǎn)速旋鈕恢復(fù)到零刻度后，再定時(shí)間，定好時(shí)間后緩慢旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 速旋鈕，使離心機(jī)均勻的提速到預(yù)定轉(zhuǎn)速。分光光度計(jì)的使用說(shuō)明：1接通電源開(kāi)關(guān)，預(yù)熱20min后，再選擇 須用的單色光波長(zhǎng)。2.放入已加入溶液的比色皿，蓋上樣品室蓋，推動(dòng) 試樣架拉手，使對(duì)照比色皿（溶液裝入4/5高度，置第一格）置于光路 上，調(diào)節(jié)100%透射比按鈕，使吸光度值A(chǔ)二0.00。 3.推動(dòng)試樣架拉手, 使樣品比色皿置于光路上，讀出吸光度值。4.測(cè)量完畢，取出比色皿， 洗凈后置于乙醇溶液中浸泡脫色。5

3、.電源開(kāi)關(guān)置于“關(guān)”，拔下電源插頭。三、試劑與器材：1試劑：(1) 0. 9%NaCl： 9g NaCl溶解在1L的容量瓶中。(2) 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)：稱(chēng)取50mg結(jié)晶牛血清蛋白定溶于50ml容量瓶電。(3) 染液：考馬斯亮藍(lán)G-250 0. 5g,溶于250mL95%乙醇，再加入500mL85% (W / V)磷酸，保存于棕色瓶中，稱(chēng)為母液。取150 mL然后加蒸館水定容 到lOOOmL,保存于棕色瓶中，備用。2.器材：試管；吸管lOmL、15mL> ImL、0. lmL； 722分光光度計(jì)四、操作方法1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備取6支試管，按下表加入各：管號(hào)012345標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液1)00.20.40.60.81.00. 9%NaCl溶液1)1.00.80.60.40.20待測(cè)樣品(ml)/考馬斯亮5.05.05.05.05.05.0藍(lán)試劑(ml)搖勻，放置5min,測(cè)吸光度值A(chǔ)595nm以各管相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量(mg)為橫坐標(biāo)、A595為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo) 準(zhǔn)曲線(xiàn)。2. 待測(cè)樣品測(cè)定中加蛋白質(zhì)樣品1. OmL ,再加入5. OmL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑,搖勻， 放置bmin后，在595nm波長(zhǎng)下吸光度值，記錄A595。根據(jù)所測(cè)A595從標(biāo) 準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得