分子生物學(xué)+第5章+分子生物學(xué)研究法

1、分子生物學(xué)研究法分子生物學(xué)n基因操作基因操作nDNA分子的切割與連接n核酸分子雜交n凝膠電泳n細(xì)胞轉(zhuǎn)化n核酸序列分析以及基因的人工合成n定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等n基因工程基因工程n是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子中，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)。 是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)基因操作基因操作 重組DNA技術(shù)史上的主要事件重組DNA實(shí)驗(yàn)中常見的主要工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶I(大腸桿菌)反轉(zhuǎn)錄酶多核苷酸激酶末端轉(zhuǎn)移酶DNA外切酶噬菌體DNA外切酶堿性磷酸酯酶n識別并在特定位點(diǎn)切開DNAn通過磷酸二酯鍵把兩個(gè)

2、或多個(gè)DNA片段連接成一個(gè)DNA分子n按5到3方向加入新的按苷酸，補(bǔ)平DNA雙鏈中的缺口n按照RNA分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則合成DNA鏈n把磷酸基團(tuán)加到多聚核苷酸鏈的5OH末端(進(jìn)行末端標(biāo)記實(shí)驗(yàn)或用來進(jìn)行DNA的連接) n在雙鏈核酸的3末端加上多聚單核苷酸n從DNA鏈的3末端逐個(gè)切除單核苷酸n從DNA鏈的5末端逐個(gè)切除單核苷酸n切除位于DNA鏈5或3末端的磷酸基團(tuán) DNA連接酶DNA的粘性末端 DNA的平末端 化學(xué)合成的具有Eco R I粘性末端的DNA片段 重組DNA 操作過程外源DNA導(dǎo)入的實(shí)驗(yàn)證明 (1)像pSCl01這樣的質(zhì)粒DNA分子可以作為基因克隆的載體，從而把外源DNA

3、導(dǎo)人寄主細(xì)胞；(2)像非洲爪蟾這樣的高等生物的基因也可以被成功地轉(zhuǎn)移到原核細(xì)胞中并實(shí)現(xiàn)其功能表達(dá)；(3)質(zhì)粒DNA大腸桿菌細(xì)胞作為一種成功的基因克隆體系，有可能在重組DNA或基因工程研究中發(fā)揮重要作用。主要DNA操作技術(shù) n核酸的凝膠電泳n核酸的分子雜交n細(xì)菌轉(zhuǎn)化n核苷酸序列分析n基因擴(kuò)增nDNA與蛋白質(zhì)相互作用研究核酸的凝膠電泳n原理n一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。n這種電泳分子在電場作用下的遷移速度電泳的遷移率。 n電泳的遷移率影響因素n凈電荷n分子大小 n分子構(gòu)型 核酸的凝膠電泳核酸的分子雜交細(xì)菌轉(zhuǎn)化核苷酸序列分析基因擴(kuò)增DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究核酸的凝膠電

4、泳n核酸主要電泳方法n瓊脂糖凝膠電泳n分辨率 分辨范圍0.250kbn聚丙烯酰胺凝膠 n分辨率 分辨范圍11000bpn脈沖電場凝膠電泳n分辨率 分辨范圍107bp核酸的凝膠電泳核酸的分子雜交細(xì)菌轉(zhuǎn)化核苷酸序列分析基因擴(kuò)增DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究核酸的凝膠電泳核酸的分子雜交細(xì)菌轉(zhuǎn)化核苷酸序列分析基因擴(kuò)增DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究EB 溴乙錠檢測核酸原理核酸的凝膠電泳核酸的分子雜交細(xì)菌轉(zhuǎn)化核苷酸序列分析基因擴(kuò)增DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究DNA脈沖電場凝膠電泳示意圖 核酸的凝膠電泳核酸的分子雜交細(xì)菌轉(zhuǎn)化核苷酸序列分析基因擴(kuò)增DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究核酸的分子雜交n將帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單

5、鏈DNA或RNA混合在一起，其相應(yīng)的同源區(qū)段就會退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。n如果退火的核酸來自不同的生物有機(jī)體，所形成的雙鏈分子就被稱為雜種核酸分子。 核酸的凝膠電泳核酸的分子雜交細(xì)菌轉(zhuǎn)化核苷酸序列分析基因擴(kuò)增DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究Southern Blotting核酸的凝膠電泳核酸的分子雜交細(xì)菌轉(zhuǎn)化核苷酸序列分析基因擴(kuò)增DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究核酸的分子雜交核酸的凝膠電泳核酸的分子雜交細(xì)菌轉(zhuǎn)化核苷酸序列分析基因擴(kuò)增DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究基因芯片核酸的凝膠電泳核酸的分子雜交細(xì)菌轉(zhuǎn)化核苷酸序列分析基因擴(kuò)增DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究細(xì)菌轉(zhuǎn)化n一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自另一種細(xì)菌菌株的DNA而導(dǎo)致

6、性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程n提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫作供體菌株n接受轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)菌菌株則被稱為受體菌株核酸的凝膠電泳核酸的分子雜交細(xì)菌轉(zhuǎn)化核苷酸序列分析基因擴(kuò)增DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究核苷酸序列分析nSanger雙脫氧鏈終止法 nMaxamGilbert化學(xué)修飾法 nDNA序列分析的自動化nDNA雜交測序法(SBH) 核酸的凝膠電泳核酸的分子雜交細(xì)菌轉(zhuǎn)化核苷酸序列分析基因擴(kuò)增DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究Sanger雙脫氧鏈終止法DNA序列分析的自動化 DNA雜交測序法(SBH)DNA雜交測序法(SBH) 基因擴(kuò)增nPCR flashn反向PCR 核酸的凝膠電泳核酸的分子雜交細(xì)菌轉(zhuǎn)化核苷酸序

7、列分析基因擴(kuò)增DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究反向PCR(a)用一種在靶序列上沒有切點(diǎn)的限制性核酸內(nèi)切酶消化大相對分子質(zhì)量DNA(b)產(chǎn)生大小不同的線性DNA片段群體，其中靶DNA區(qū)段的DNA分子長度不超過2-3kb，經(jīng)連接后重新環(huán)化；(c)按靶序列設(shè)計(jì)的一對引物與互補(bǔ)序列退火結(jié)合，其延伸方向如箭頭所指；(d)經(jīng)PCB擴(kuò)增產(chǎn)生的主要是線性雙鏈DNA分子，它是由左側(cè)序列和右側(cè)序列首尾連接而成，其接點(diǎn)是(a)中所用的限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究n凝膠阻滯試驗(yàn)nDNase I足跡試驗(yàn) n基因芯片技術(shù) 核酸的凝膠電泳核酸的分子雜交細(xì)菌轉(zhuǎn)化核苷酸序列分析基因擴(kuò)增DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究基

8、因芯片半位點(diǎn)法基因工程基因工程載體基因克隆的主要載體系統(tǒng) n質(zhì)粒DNA分離純化n載體系統(tǒng)n常用Vectors pUC18 DNA pUC19 DNA pUC118 DNA pUC119 DNA pUC118 EcoR I / BAP pUC118 BamH I / BAP pUC118 Hinc II / BAP pUC118 Pst I / BAP pUC118 Hind III / BAP pBR322 DNA n SiRNA表達(dá)用載體 pSINsi Vector Series pSINsi Primer Set pBAsi Vector Series n PCR產(chǎn)物克隆用載體 pMD18

9、-T Vector pMD19-T Vector pMD18-T Simple Vector pMD19-T Simple Vector pSIMPLE-18 EcoR V/BAP Vector pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector n Sequencing Primers M13 Primers BcaBESTTM Sequencing Primers gt10/11 Primers SP6 Promoter Primer n Oligo dT Primers Oligo d(T)15 Oligo d(T)18 n Random Primers Hexadeoxyribo

10、nucleotide mixture; pd (N)6 Nonadeoxyribonucleotide mixture; pd (N)9 n Linkers Phosphorylated Linkers Nonphosphorylated Linkers n Adaptors Adaptors EcoR I - Not I - BamH I Adaptor 氯化銫密度梯度離心法 基因的分離與鑒定基因克隆n四個(gè)基本步驟：(1)用于基因克隆的DNA材料的選擇以及DNA分子的片段化；(2)外源DNA片段與載體分子的體外連接反應(yīng)；(3)將人工重組的DNA分子導(dǎo)人它們能夠進(jìn)行正常復(fù)制的寄主細(xì)胞；(4)重

11、組體分子的轉(zhuǎn)化子克隆的選擇或篩選。DNA片段的產(chǎn)生與分離 n鳥槍法(shotgun approach) n局部雙酶消化法 重組體DNA分子的構(gòu)建 n外源DNA片段定向定向插入載體分子 重組體分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的途徑n將外源重組體分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的主要途徑包括:n轉(zhuǎn)化(或轉(zhuǎn)染)n轉(zhuǎn)導(dǎo)n顯微注射n電穿孔等。 cDNA基因克隆 n高等生物一般具有35萬種左右不同的基因 n在一定時(shí)間階段的單個(gè)細(xì)胞或組織中，僅有15左右的基因得以表達(dá) ?分離到目的基因片段?如何實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量mRNA的制備 ?克隆基因的分離 n應(yīng)用核酸探針分離n應(yīng)用mRNA差別顯示技術(shù)分離n應(yīng)用cDNA差示分析法(representational difference analysis，RDA) n應(yīng)用酵母雙雜交體系(twohybrid system) n基因的圖位克隆法(mapbas