抗腫瘤藥效學(xué)指導(dǎo)原則

1、抗腫瘤藥物藥效學(xué)指導(dǎo)原那么(討論稿)1根本原那么抗腫瘤藥物可分為：(1)細(xì)胞蠹類藥物(cytotoxic agent)：包括干擾核酸和蛋 白質(zhì)合成、抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶及作用丁微管系統(tǒng)的藥物等；(2)生物反響調(diào)節(jié)劑(biological response modifier)； (3)腫瘤而寸藥逆轉(zhuǎn)劑(resistance reversal agent) (4)腫瘤治療增敏劑(oncotherapy sensitizer)；(5)腫瘤血管生成 抑制劑(tumor angiogenesisinhibitor)； (6)分化誘導(dǎo)劑(differentiation inducing agent); (7)生

2、長因 子抑制劑(growthfactor inhibitor)；(8)反義寡核苜酸(antisense oligonucleotide抻。 抗腫瘤藥物的藥效學(xué)包括體內(nèi)外抗腫瘤試驗，評價藥物的抗癌活性時，以體內(nèi)試驗結(jié)果為主，同時參考體外試驗結(jié)果以做出正確的結(jié)論。I類抗腫瘤新藥應(yīng)進行藥物作用機制的初步研究。2體外抗腫瘤活性試驗2.1試驗?zāi)康?1)對候選化合物進行初步篩選；(2)了解候選化合物的抗瘤譜；(3)為隨后進行的體內(nèi)抗腫瘤試驗提供參考，如劑量范圍、腫瘤類別等。2.2試驗方法 選用10-15株人癌細(xì)胞株，根據(jù)試驗?zāi)康暮退x用的方法選擇相 應(yīng)的細(xì)胞系及適量的細(xì)胞接種濃度，按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法進行培養(yǎng)

3、；推薦使用四氮 口坐鹽3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, MTT復(fù)原法、XTT2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulphonyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazoliumhydroxide復(fù)原法、磺酰羅丹明B(sulforhodamine B,SRB)染色法、或51Cr釋放試 驗、集落形成法等測定藥物的抗癌作用。藥物與細(xì)胞共培養(yǎng)的時間一般為48-72小時，貼壁細(xì)胞需先貼壁24小時后再給藥。試驗應(yīng)設(shè)陽性及陰性對照組，陽性 對照用一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗腫瘤藥，陰性對照為

4、溶媒對照。2.3評價標(biāo)準(zhǔn)以同一樣品的不同濃度對腫瘤細(xì)胞抑制率作圖可得到劑量效應(yīng) 曲線，然后采用Logit法計算半數(shù)有效濃度(IC50值或EC50值)。體外試驗至少重 復(fù)一次。3體內(nèi)抗腫瘤試驗體內(nèi)抗腫瘤試驗結(jié)果是評價候選抗腫瘤化合物有效性的最重要指標(biāo)。體內(nèi)抗腫瘤試驗必須選用三種以上腫瘤模型，其中至少一種為人癌裸小鼠移植瘤模型 或其它人癌小鼠模型。試驗結(jié)果三種模型均為有效，再重復(fù)一次也為有效，評定 該化合物對這些實驗性腫瘤具有治療作用。鼓勵使用人癌裸小鼠移植瘤模型和多 種類的移植瘤模型，以較正確和全面地評價候選化合物的抗瘤活性和抗瘤譜。鼓勵使用原位接種模型和中空纖維測定hollow-fiber a

5、ssay痔先進的抗腫瘤作用評 價方法。3.1動物 動物要求健康，符合等級動物要求，有實驗動物合格證。 雌雄均可， 但同一批實驗中動物性別必須相同。 小鼠鼠齡為5-6周，體重為18-22克。評價 同一物質(zhì)的活性時，不同批次的實驗必須采用同一品系的小鼠。3.2腫瘤模型3.2.1小鼠腫瘤模型 可應(yīng)用的小鼠腫瘤模型包括淋巴細(xì)胞白血病腹水瘤L1210和P388、白血病L-615、宮頸癌U14、肝癌H22、Lewis肺癌、黑色素瘤B16、 網(wǎng)織細(xì)胞瘤M5076、腸癌26、腸腺癌38、乳腺癌CD8F1、艾氏腹水瘤EAC、肉瘤-180等，以及以上各種小鼠腫瘤的業(yè)型和耐藥瘤等。3.2.2人癌裸小鼠移植瘤模型應(yīng)選

6、用體外試驗敏感細(xì)胞株進行體內(nèi)抗人癌移植瘤試驗。模型的建立和使用請注意以下幾點：1移植瘤一般由相應(yīng)的細(xì)胞株移植而建立， 對細(xì)胞株和移植瘤的化療敏感 性應(yīng)予了解。2移植瘤復(fù)蘇后一般應(yīng)傳2-3代后再用丁體內(nèi)抗腫瘤試驗。3對模型生長情況應(yīng)全面了解，尤其是生長快的模型。4為了保持移植瘤的生物學(xué)特性和遺傳特性，復(fù)蘇后移植瘤體內(nèi)傳代應(yīng)少15-20代。3.3試驗過程3.3.1接種 腫瘤接種方法主要有皮下接種、腹腔接種和原位接種。皮下瘤模型：選擇腫瘤生長旺盛且無潰破的荷瘤小鼠，頸椎脫臼處死， 在無菌條件下超凈臺或接種罩,用碘灑、灑精或新潔爾滅消蠹動物皮膚，切 開皮膚，剝離腫瘤。將瘤組織剪成1.5 mm3左右，用

7、套管針接種丁動物一側(cè)或雙 側(cè)腋窩皮下；或制成細(xì)胞懸液，然后按一定比例參加無菌生理鹽水，一般每只小鼠接種腫瘤細(xì)胞數(shù)量為1-5 X 106。腹水瘤模型：無菌條件下，消蠹動物皮膚，吸取生長良好的動物腹水， 以生理鹽水按一定比例稀釋后接種丁動物腹腔，接種細(xì)胞數(shù)量一般為1-5 X106。原位接種模型：原位接種是指將來源丁某臟器的腫瘤接種在動物的某臟 器，如將人肝癌接種在裸小鼠的肝臟。原位接種不是常規(guī)的方法，但有其優(yōu)越性， 是鼓勵使用的方法。主要有肺、肝、胃、腸、乳腺、顱內(nèi)等原位接種方法。3.3.2分組和劑量設(shè)谿分組：試驗分陰性對照組、陽性對照組、治療組。治療組設(shè)高、中、低 三個劑量組。小鼠腫瘤和腹水瘤接

8、種后次日將動物隨機分組， 裸小鼠移植瘤用游 標(biāo)卡尺測量移植瘤直徑，待腫瘤生長至100300mm3后將動物隨機分組。治療 組動物數(shù)普通小鼠每組至少10只，裸小鼠至少6只。陰性對照組動物數(shù)為治療 組動物數(shù)七試驗組數(shù)。劑量設(shè)谿：治療組設(shè)高、中、低劑量治療組，一般按4:2:1設(shè)谿，高劑量使用最大耐受量或LDi0的劑量。陰性對照組給予相應(yīng)的溶劑；陽性對照藥選 用對該動物敏感的、臨床應(yīng)用的抗腫瘤藥物，如試驗化合物為一抗癌藥物的衍生 物或類似物時，必須選用該抗癌藥物作為陽性對照藥。陽性對照藥選擇原那么為：(1)療效確切；(2)與被試物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)類似；(3)與被試物質(zhì)有類似的作用 機理。3.3.3藥物配制，給

9、藥時間和給藥途徑藥物配制：溶丁水的藥物，用生理鹽水或蒸僻水配制；如用酸、堿溶解者， 可先用小量酸(0.1-0.5NHCl)或堿(NaHCO3、W2CO3、NaOH)溶解， 調(diào)節(jié)pH在4.5-9.0的范圍內(nèi)。用乙醇、丙二醇、吐溫80、DMSO助溶的藥物，或用吐溫60、吐溫80、2-3%淀粉、淀粉、0.5%埃埃甲基纖維素制成混懸:液的藥物，可腹腔注射或 口服，但必須設(shè)相同濃度的溶劑對照組。用注射用花生油配制的溶液或乳劑可口 服、服、皮下或肌肉注射。給藥時間和給藥途徑：分組當(dāng)日開始給藥，根據(jù)不同藥物的代謝動力學(xué) 和蠹性反響等確定給藥方案。給藥途徑應(yīng)與推薦臨床用藥的途徑相同。靜脈給藥 和口服給藥是較為

10、理想的給藥途徑。 給藥次數(shù)較多，或被試物質(zhì)溶解性較差，靜 脈給藥有困難時，可考慮使用腹腔給藥，但在評價藥效時要注意這兩種給藥途徑 是有差異的。特殊情況下根據(jù)藥物作用特點和推薦臨床給藥方法可采取瘤周、瘤內(nèi)、肌肉、皮下給藥途徑。腹水瘤試驗時一般不能應(yīng)用腹腔給藥途徑。不可采用 從飲水中給藥的方式。3.4評價標(biāo)準(zhǔn)3.4.1腹水瘤模型接種給藥后，觀察和記錄動物死亡時間，計算生存天數(shù)。如陰性對照組20%動物存活時間超過4周，說明腹水瘤生長不良，實驗作廢。采用中位生存時間(即mediansurvival time, MST)來評價每組生存時間，其計算公式為：每組鼠數(shù)的中間數(shù)-中間生存天數(shù)前 死亡的鼠數(shù)MST

11、 =(中間生存大數(shù)-0.5) +中間生存天數(shù)死亡的鼠數(shù)治療組與對照組的比擬，采用T/C(%)來表示。計算公式為:TMSTT/C %= -X 100%CMSTTMST:治療組MST ; CMST:陰性對照組MST評價的標(biāo)準(zhǔn)那么以125%為界，當(dāng)T/C%125%時，視為有效，反之那么無效 報告格式見表1。表 1 1 XXXXXX 對腹水瘤 XXXXXX 的實驗治療作用。組別劑量給藥動物數(shù)開始體重(克)中位生存時間T/C方式只x二SD%陰性對照陽性對照治療組高劑量中劑量低劑量3.4.2裸小鼠移植瘤模型推薦使用測量瘤徑的方法，動態(tài)觀察被試物抗腫瘤的效應(yīng)。腫瘤直徑的測 量次數(shù)根據(jù)移植瘤的生長情況而定，一

12、般為每周2-3次，每次測量同時還需稱鼠 重。腫瘤體積(tumor volume,TV)的計算公式為：V = 1/2X ax b2或兀/6x ax bx c其中a、b、c分別表示長寬高。由丁此兩公式的相關(guān)性極好，可采用任一 公式。根據(jù)測量的結(jié)果計算出相對腫瘤體積(relative tumor volume, RTV),計 算公式為：RTV= Vt/ VQ0其中Vo為分籠給藥時(即do)測量所得腫瘤體積，Vt為每一次測量時的腫瘤體積。抗腫瘤活性的評價指標(biāo)為相對腫瘤增殖率T/C(%),計算公式如下：TRTVT/C % = -X 100%CRTVTRTV:治療組RTV ; CRTV:陰性對照組RTV。

13、療效評價標(biāo)準(zhǔn)：T/C %60 %為無效；T/C% 60%,并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理P0.05為有效。報告格式見圖1和表2;并應(yīng)提供相應(yīng)照片。表 2 2 XXXXXX 對人癌裸小鼠移植瘤 XXXXXX 的實驗治療作用。組別劑量給藥動物數(shù)平均體重克TV(x士SD)RTVT/CP值方式d0 dnd0dnd0dn(x士SD)(%)陰性對照陽性對照治療組高劑量中劑量低劑量d0:d0:分籠給藥時間；dn:dn:實際治療療效最正確的時間。注：圖中為示意曲線。圖 1 1 XXXXXX 對人癌裸小鼠移植瘤 XXXXXX 的生長抑制作用。3.4.3小鼠腫瘤模型生長較慢的小鼠腫瘤采用與裸小鼠移植瘤同樣的量瘤徑的評價方法。 生

14、 長較快的小鼠腫瘤可采用稱瘤重的方法評價。 試驗結(jié)束后處死動物，稱體重，解 剖剝離瘤塊，稱瘤重。陰性對照組腫瘤平均瘤重小丁1克，或20%腫瘤重量小丁400毫克，表示腫瘤生長不良，試驗作廢。療效評價公式：給藥組平均瘤重-陰性對照組 平均瘤重腫瘤生長抑制率100%陰性對照組平均瘤重評價標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤生長抑制率40%為無效；腫瘤生長抑制率?40%并經(jīng)統(tǒng)計 學(xué)處理P50%;細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：可在光學(xué)顯微鏡與電鏡下觀察候選化合物作用后細(xì)胞的 形態(tài)學(xué)變化，對照組的早幼粒細(xì)胞應(yīng)90%-95%,候選化合物組細(xì)胞分化，成熟 粒細(xì)胞占比例越高，說明該化合物的分化效果越好；吞噬功能測定：對照組吞噬陽性細(xì)胞50%。實體瘤的

15、分化誘導(dǎo)常用細(xì)胞株、試驗方法及評價標(biāo)準(zhǔn)如下：人肝癌HepG2、SMMC7721細(xì)胞分化誘導(dǎo)試驗 主要測定細(xì)胞的甲 胎蛋白(AFP)、白蛋白含量，Y-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶(丫-Glutmyl transferase,丫-GT)、 酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(tyrosine alpha-ketoglutarate transaminase, TAT )活性及觀察細(xì)胞 形態(tài)。分化細(xì)胞的AFP含量、TAT和丫-GT活性明顯降低，白蛋白含量增加， 細(xì)胞胞質(zhì)增加、核縮小。 人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞分化誘導(dǎo)試驗該細(xì)胞可被分化為成熟的腺細(xì)胞，主要檢測細(xì)胞粘液分泌，計算粘液分泌細(xì)胞白分率；測定其堿性磷酸酶活性；并 觀察形態(tài)變化，分化

16、細(xì)胞形成平坦?fàn)睢Ｈ缯骋悍置诩?xì)胞50%,堿性磷酸酶活性增加100%,那么該候選化合物有效。 小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞分化誘導(dǎo)試驗 一般進行細(xì)胞的黑色素含量、酪氨 酸酶活力測定和形態(tài)觀察。有效的候選化合物可使細(xì)胞體積變大，多數(shù)細(xì)胞有樹 突狀(dendrite )結(jié)構(gòu)；黑色素含量增加2倍以上，酪氨酸酶活力增加1倍以上。4.5.2體內(nèi)試驗 常用人癌細(xì)胞小鼠腎囊膜下移植試驗、小鼠髓單核細(xì)胞白血病 試驗和人癌細(xì)胞裸小鼠移植瘤模型等。 可選兩種模型，根據(jù)腫瘤鼠生存時間、腫 瘤的體積及形態(tài)變化，從整體水平觀察分化誘導(dǎo)效果。重復(fù)試驗一次。4.6腫瘤治療增敏劑腫瘤治療增敏劑主要是指放射治療增敏劑，能增加臨床上惡性腫

17、瘤放射治 療或其它治療的療效及降低治療后的復(fù)發(fā)率。其藥效學(xué)試驗分為體外和體內(nèi)試 驗：4.6.1體外試驗 分別選擇對放射、化療藥物具有中、低度敏感的人腫瘤細(xì)胞株， 采用MTT、SRB或細(xì)胞集落形成方法進行化合物的細(xì)胞蠹性試驗，以IC50值作為評價指標(biāo)。多細(xì)胞球體(multicell spheroids)培養(yǎng)實驗技術(shù)在研究增敏作用， 以及這些化合物的擴散和對乏氧細(xì)胞或休止期細(xì)胞的作用方面很有價值?？蓱?yīng)用離體培養(yǎng)細(xì)胞的乏氧照射技術(shù)制作乏氧模型，評價增敏效果。氧增比(Oxygenenhancement ratio, OEFR可反映乏氧模型模擬腫瘤的缺氧情況，OER值達(dá)2.5-3.0即符合乏氧要求。乏氧

18、條件下不給藥組細(xì)胞存活曲線的DO值OER= -一一 有氧條件下不給藥組細(xì)胞存活曲線的DO值*DO值是殺傷 63%63%細(xì)胞所需的濃度。增敏比Sensitivity enhancement ratio, SER及Ci.6作為評價被試藥物增敏 效果的指標(biāo)。乏氧條件下對照組的DO值SER=-乏氧條件下給藥組的DO值CI.6即SER=1.6時所需的藥物濃度。C1.6mmol/L的值越小，說明藥物的 增效作用就越強。一般C1.61.4認(rèn)為有明顯的增效作用。4.6.2體內(nèi)試驗選用對射線及化療藥物敏感性較小的三種實體瘤模型進行試 驗，其中至少有一種是人癌裸小鼠移植瘤模型。放射治療增敏劑的試驗中一般用低LET

19、X或V射線照射，也可用高LET中子、質(zhì)子照射。由強致癌物或病蠹等 因素誘發(fā)的腫瘤，或者不是在同一品系動物身上移植傳代的腫瘤往往會出現(xiàn)免疫 反響， 因此都不能用丁腫瘤治療增敏劑的研究。 療效評價除參照本章“體內(nèi)抗腫 瘤試驗局部，尚可觀察50%月中瘤控制劑量TCD50,即50%荷瘤動物的腫瘤 得到控制或治愈所需的照射劑量；2半數(shù)有效劑量ED50，對50%的動物有效 的照射劑量能使腫瘤的生長被抑制60%以上視為有效;生長延緩growthdelay天數(shù)，即腫瘤受照后從一個特定大小A生長到某一特定大小B所需的時問Tx,然后與對照組Tc相比擬，TXATC為有效；4增敏比，SER=照射對照組DO值/給藥組D

20、O值;還應(yīng)觀察被試藥物對正常組織是否也有影響，可進行治療增 益系數(shù)Therapentic Gain Factor, TGF。TGF指某種因子引起腫瘤組織細(xì)胞的損 傷與正常組織細(xì)胞的損傷之比，即TGF =腫瘤組織SER /正常組織SER。參考文獻(xiàn)1.DeGeorge JJ, et al. Regulatory considerations for preclinical development ofanticancer drugs. Cancer Chemother Pharmacol 1998;41:173-85.2.Page M, et al. In vitro methods. In: T

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