PCR_技術的種類及其應用

1、PCR 技術的種類及其應用1 PCR技術的基本原理PCR 技術是在模板 DNA、引物和四種 dNTP 等存在的條件下，依賴于 DNA 聚合酶(T aq 酶)的酶 促合成反應。其具體反應分三步：變性、退火、聚合。以上三步為一個循環(huán)，每一循環(huán)的產物DNA 又可以作為下一個循環(huán)模板，數(shù)小時后，介于兩個引物之間的目的 DNA 得到了大量的復制，經(jīng) 2530次循環(huán) DNA 數(shù)量可達 2X10*7拷貝數(shù)。2PCR 技術的種類2.1反向 PCR( Inverse PCR, IPCR)技術原理：反向 PCR是克隆已知序列旁側序列的一種方法.主要原理是用一種在已知序列中無切點 的限制性內切酶消化基因組 I)NA

2、 .后酶切片段自身環(huán)化.以環(huán)化的DNA 作為模板，用一對與已知序列兩端特異性結合的引物，擴增夾在中間的未知序列。該擴增產物是線性的DNA片段，大小取決于上述限制性內切酶在已知基閑側翼DNA 序列內部的酶切位點分布情況。用不同的限制性內切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通過反向 PCR 獲得未知片段。該方法的不足是：需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進行酶切才能得到合理大小的DNA 片段。這種選擇不能在非酶切位點切斷靶DNA。大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復序列，而在YAC 或 Cosmid 中的未知功能序列中有時也會有這些序列，這樣，通過反向PCR 得到的探針就

3、有可能與多個基因序列雜交。2.2錨定 PCR(Anchored PCR, APCR)技術用酶法在一通用引物反轉錄 cDNA3 -末端加上一段已知序列，然后以此序列為引物結合位點對 該 cDNA 進行擴增，稱為 APCR。應用：它可用于擴增未知或全知序列，如未知 cDNA 的制備及低豐度 cDNA 文庫的構建。2.3不對稱 PCR(asymmetric PCR)技術兩種引物濃度比例相差較大的PCR 技術稱不對稱 PCR。在擴增循環(huán)中引入不同的引物濃度，常用50100 日比例。在最初的 1015個循環(huán)中主要產物還是雙鏈 DNA,但當?shù)蜐舛纫锉幌谋M后 高濃度引物介導的 PCR反應就會產生大量單鏈

4、 DNA。應用：可制備單鏈 DNA 片段用于序列分析或核酸雜交的探針。2.4反轉錄 PCR(reverse transcription, RT- PCR)技術當擴增模板為 RNA時，需先通過反轉錄酶將其反轉錄為cDNA 才能進行擴增。RT - PCR應用非常廣泛，無論是分子生物學還是臨床檢驗等都經(jīng)常采用。2.5修飾引物 PCR技術為達到某些特殊應用目的，如定向克隆、定點突變、體外轉錄及序列分析等，可在引物的 5-端加上酶切位點、突變序列、轉錄啟動子及序列分析結合位點等。2.6巢式 PCR(NEST PCR)技術先用一對靶序列的外引物擴增以提高模板量，然后再用一對內引物擴增以得到特異的PCR 帶

5、，此為巢式 PCR。若用一條外引物作內引物則稱之為半巢式PCR。為減少巢式 PCR的操作步驟可將外引物設計得比內引物長些，且用量較少，同時在第一次 PCR時采用較高的退火溫度而第二次采用較低的退火溫度，這樣在第一次 PCR時，由于較高退火溫度下內引物不能與模板結合,故只有外引物擴增產物，經(jīng)過若干次循環(huán)，待外引物基本消耗盡，無需取出第一次 PCR產物，只需 降低退火即可直接進行 PCR擴增。這不僅減少操作步驟 ，同時也降低了交叉污染的機會。這種 PCR 稱中途進退式PCR( drop-in, drop-out PCR)。上述三種方法主要用于極少量 DNA 模板的擴增。2.7等位基因特異性 PCR

6、(Allele- specificPCR, ASPCR)技術ASPCR依賴于引物 3-端的一個堿基錯配，不僅減少多聚酶的延伸效率 ，而且降低引物-模板復合 物的熱穩(wěn)定性。這樣有點突變的模板進行 PCR擴增后檢測不到擴增產物，可用于檢測基因點突變。2.8單鏈構型多態(tài)性 PCR(single- strandconformational polymorphism PCR, SSCPPCR)技術 SSCP- PCR 是根據(jù)形成不同構象的等長 DNA 單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率變化來檢測基因變異。在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中，單鏈 DNA遷移率除與 DNA長度有關外，更主要取決于 DN

7、A單鏈所形成的空間構象,相同長度的單鏈 DNA 因其順序不同或單個堿基差異 所形成的構象就會不同，PCR 產物經(jīng)變性后進行單鏈 DNA 凝膠電泳時,每條單鏈處于一定的位谿 靶 DNA 中若發(fā)生堿基缺失、插入或單個堿基谿換時，就會出現(xiàn)泳動變位，從而提示該片段有基因變異存在。2. 9 低嚴格單鏈特異性引物 PCR (Lowstringencysingle specific primer PCR, LSSP- PCR) 技術 LSSP - PCR是建立在 PCR基礎上的又一種新型基因突變檢測技術。要求是 土高一低”高濃度的單鏈引物(5 -端/3-端引物均可),約 4. 8Lmol,高濃度的 Taq

8、酶(16Lmol/ 100ml),低退火溫 度(30 C)，所用的模板必須是純化的 DNA 片段。在這種低嚴格條件下 ，引物與模板間發(fā)生不同程 度的錯配，形成多種大小不同的擴增產物 ，經(jīng)電泳分離后形成不同的帶型。對同一目的基因而言所形成的帶型是固定的，因而稱之為 基因標簽”。這是一種檢測基因突變或進行遺傳鑒定的快速 敏感方法。2.10復合 PCR(multiplex PCR)技術在同一反應中用多組引物同時擴增幾種基因片段，如果基因的某一區(qū)段有缺失，則相應的電泳譜上這一區(qū)帶就會消失。復合PCR 主要用于同一病原體的分型及同時檢測多種病原體、多個點突變的分子病的診斷。2.11重組 PCR 技術重組

9、 PCR技術是在兩個 PCR擴增體系中，兩對引物分別由其中之一在其 5-端和 3-端引物上帶上 一段互補的序列，混合兩種 PCR擴增產物，經(jīng)變性和復性，兩組 PCR產物互補序列發(fā)生粘連，其中一 條重組雜合鏈能在 PCR條件下發(fā)生聚合延伸反應，產生一個包含兩個不同基因的雜合基因。2.12隨機引物擴增技術 (arbitrary primedPCR, AP- PCR)AP-PCR 技術通過隨意設計或選擇一個非特異性引物，在 PCR反應體系中，首先在不嚴格條件下使引物與模板中許多序列通過錯配而復性。如果在兩條單鏈上相距一定距離有反向復性引物存在 則可經(jīng) Taq酶的作用使引物延伸而發(fā)生 DNA 片段的擴

10、增，經(jīng)一至數(shù)輪不嚴格條件下的 PCR循環(huán) 后,再于嚴格條件下進行擴增。擴增的產物經(jīng)DNA 測序凝膠電泳分離后，經(jīng)放射性自顯影或熒光顯示即可得到 DNA指紋圖。AP-PCR 用于腫瘤的抑制基因、癌基因的分離；菌種、菌株及不同 物種的鑒定；遺傳作圖；不同分化程度或某些不同狀態(tài)下的組織的基因表達差異等方面的研究。2.13差示 PCR (differential PCR, d -PCR)技術d-PCR 可以定量檢測標本靶基因的拷貝數(shù)。它是將目的基因和一個單拷貝的參照基因谿于一個試管中進行 PCR擴增。電泳分離后呈兩條區(qū)帶，比較兩條區(qū)帶的豐度，或在引物 5-端標記上放射性核素后，通過檢測兩條區(qū)帶放射性強

11、度即可測出目的基因的拷貝數(shù)。2.14定量 PCR(quantitative PCR, qPCR)技術qPCR技術是用合成的 RNA 作為內標來檢測 PCR 擴增目的 mRNA 的量，涉及目的 mRNA 和內標用 相同的引物共同擴增，但擴增出不同大小片段的產物 ，可容易地電泳分離。一種內標可用于定量多 種不同目的mRNA。qPCR可用于研究基因表達，能提供特定 DNA 基因表達水平的變化，在癌癥、 代謝紊亂及自身免疫性疾病的診斷和分析中很有價值。2.15競爭性 PCR(competitive PCR, c-PCR)技術c-PCR技術是競爭 cDNA模板與目的 cDNA同時擴增， 使用同樣的引物，

12、 但一經(jīng)擴增后， 能從這些 目的 cDNA區(qū)別開來。通常使用突變性競爭 cDNA 模板,其序列與目的 cDNA 序列相同，不過模板中 僅有一個新內切位點或缺少內切位點，突變性的 cDNA 模板可用適當?shù)膬惹忻杆?，并用分光?測定其濃度。cDNA 目的序列和競爭模板相對應的含量，可用漠化乙錠染色，電泳膠直接掃描進行 測定，或摻入放射性同位素標記的方法測定。競爭模板開始時的濃度是已知的，則 cDNA 目的序列的最初濃度就能測定。這種方法能精確測定mRNA中 cDNA 靶序列，可用于幾個到 10個細胞中mRNA 的定量。2.16半定量 PCR(semiquantitative PCR,sq- PC

13、R)技術sq-PCR不同于 c-PCR 的是參照物 ERCC-2 的 PCR產物與目的 DNA的 PCR產物相似，并分別在試管 中擴增。sq-PCR的流程為樣品和內參照 RNA 分別經(jīng)反轉錄為 cDNA，然后樣品 cDNA 和一系列不同量參照 cDNA 分別在不同管進行擴增，PCR產物在瓊脂糖凝膠上電泳拍照，光密度計掃描，作出 標準曲線，通過回歸公式便可定量表達的基因量。雖然管與管之間的擴增效率難以控制，但由 PCR擴增的所有樣本和參照物在不同的實驗中差異很小。這種敏感的技術可用于其他低表達的基因2.17原位 PCR( in situ PCR)技術原位 PCR綜合了 PCR 和原位雜交(Ins

14、itu hybridization, ISH) 的優(yōu)點，是一種在組織切片或細胞涂片上原位對特定的 DNA或 RNA進行擴增，再用特異性的探針原位雜交檢測。原位 PCR標本一般需先經(jīng)化學固定，以保持組織細胞的良好形態(tài)結構。細胞膜和核膜有一定的通透性 ,PCR 擴增所需的各種成分可進入細胞內或核內，在原位對特定的 DNA或 RNA進行擴增。擴增產物由于分子量較大或互相交織，不易透過細胞膜向外彌散，故保留在原位。這樣就很容易應用 ISH將其檢出，同時還 可對目的 DNA序列的組織細胞進行形態(tài)學分析。2.18免疫 PCR(immuno PCR)技術抗原-抗體反應與 PCR技術的結合產生了免疫 PCR,

15、是目前為止最為敏感的檢測方法，理論上可測到一個抗原分子的存在。通過用一個具有對 DNA和抗體雙重結合活性的連接分子，使作為標記物 的 DNA分子特異地結合到 Ag- Ab 復合物上，從而形成 Ag- Ab- DNA 復合物，附著的 DNA 標記物 可用適宜的引物進行 PCR 擴增。特異性 PCR產物的存在證明 DNA 標記物分子特異地附著于 Ag - Ab 復合物上，進而證明有 Ag 存在。吳自榮等將 Ab 通過化學交聯(lián)劑直接連接到分子上構建成 Ab-DNA探針，組成免疫 PCR 檢測新模式，具有高度靈敏和特異性。免疫PCR可對流行性傳染病(如肝炎、愛滋病等)進行檢測，檢測體液中致癌基因和癌基

16、因表達的微量蛋白等。2.19長片段 PCR(long-PCR)技術長片段 PCR是用高質量模板 DNA 保證其完整性，引物應較長(2134bp),使用高的退火溫度及錯 配率更低的酶，將無 3-5外切酶活性的 DNA 聚合酶和低濃度有 3-5外切酶活性的 DNA 聚合酶組 合使用，緩沖體系通過提高 Tris的濃度或改用 Tricine緩沖液以增強緩沖能力，并調高體系的pH。熱循環(huán)參數(shù)總的來說需增加延伸時間，一般1kb/ min，同時采用熱啟動。長片段 PCR在限制性片段多態(tài)性及單體型分析、染色體基因步移、DNA序列分析及基因突變的鑒定等方面得到應用。3PCR技術的應用3.1 PCR技術在農業(yè)中的

17、應用3.1.1PCR在轉基因產品檢測中的應用目前，相關研究人員已經(jīng)利用PCR技術成功建立了檢測轉基因馬鈴薯、大豆和玉米的技術路線，對轉基因大豆和玉米的檢測低限分別到達了1%和 0.1%。3.1.2PCR在研究植作物生長發(fā)育方面的作用植物的生長、發(fā)育、分化和衰老都涉及許多基因的時空順序表達，因此研究這個過程中基因表達的變化是揭示生長發(fā)育機理的重要手段。定量 RT-PCR 是研究植物基因表達水平變化的一項重要技術。通過研究不同植物或同意植物不同發(fā)育時期的基因表達水平來揭示植物生長發(fā)育 的機理。3.1.3PCR在作物抗病性基因分析、定位中的應用在作物病害研究中，作物抗病性及其機制研究一直是當今作物病

18、理學和作物抗病育種中的 熱點和焦點問題。而我們現(xiàn)在已經(jīng)知道作物對病原物的抗性是由相對的基因所控制的，即被廣 泛認可的基因對基因理論。因此，尋找與作物抗病性緊密連鎖的基因標記，即將抗病性基因進 行定位的研究中具有十分重要的理論意義和實踐意義。利用 PCR和 RAPD 技術能夠找到與抗性緊密連鎖的分子標記，并將其進行定位。3.2PCR 技術在食品科學中的應用PCR技術在食品科學中主要用于對食品中微生物含量的檢測。應用PCR技術，只需數(shù)小時，就可以用電泳法檢測出來 0.1mgDNA 中僅含數(shù)個拷貝的模板序列；用PCR 擴增細菌中保守的DNA 片段，還可對那些人工無法培養(yǎng)的微生物進行檢測。3.3PCR 技術在醫(yī)學中的應用目前，全世界利用 PCR技術診斷感染性疾病每年達幾千萬人次，可見其巨大的市場潛力。PCR 技術主要用于腫瘤、遺傳病和感染性疾病的診斷。3.3.1PCR 在腫瘤診斷上的應用遺傳學改變主要是引起癌基因激活和抑癌基因的失活，使基因發(fā)生突變、缺失、增加和易 位等而導致了細胞癌變。PCR 不但能有效地檢測基因的突變、重排、易位等，而且能準確檢測癌基因表達量，可據(jù)此進行腫瘤早期診斷、鑒別、分型、分期、治療及預后評估等