感受態(tài)細(xì)胞的制備方法

1、感受態(tài)細(xì)胞的制備方法1、感受態(tài)定義、作用、常用制備方法及原理2、感受態(tài)細(xì)胞不好用的原因3、影響轉(zhuǎn)化效率的原因4、為何要低溫環(huán)境制備1. 感受態(tài)定義：細(xì)胞能夠從周圍環(huán)境中攝取 DNA分子，并且不易被細(xì)胞內(nèi) 的限制性核酸內(nèi)切酶分解時(shí)所處的一種特殊生理狀態(tài)稱感受態(tài)(compete nee)。作用：如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一一 種短暫的感受態(tài)以攝取外源 DNA感受態(tài)的目的是增加細(xì)胞的通 透性，以便外源基因進(jìn)入宿主細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的目的。優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞膜通透性增大，方便大分子的進(jìn)入。意義是實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)移外源DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞，完成實(shí)驗(yàn)。常用制備方法：細(xì)菌感受態(tài)少量制備法(CaCb法)、細(xì)

2、菌感受態(tài) 大量制備法、細(xì)菌電轉(zhuǎn)化法等詳見基因工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)p153-157.2. 感受態(tài)細(xì)胞做得不好的原因一. 菌液0D直偏大或偏小二. 原始菌株不好三. 試劑超純程度不夠四操作時(shí)對菌體傷害過大3. 影響轉(zhuǎn)化效率的原因1細(xì)菌的生長狀態(tài)： 實(shí)驗(yàn)中應(yīng)密切注視細(xì)菌的生長狀態(tài)和密度 , 盡量使用對數(shù)生長期的細(xì)胞（一般通過檢測OD600 來控制 .DH5a菌株 OD600為0.5時(shí)細(xì)胞密度是 5X 107/ml ）;2所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行；3經(jīng) CaCl2 處理的細(xì)胞 , 在低溫條件下 , 一定的時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨 時(shí)間的推移而增加 ,24 小時(shí)達(dá)到最高 , 之后轉(zhuǎn)化率再下降（這是 由于總的活菌數(shù)

3、隨時(shí)間延長而減少造成的）；4. 化合物及無機(jī)離子的影響：在Ca2啲基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價(jià)金 屬離子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使 轉(zhuǎn)化效率大大提高（ 100-1000 倍）；5. 所使用的器皿必須干凈 . 跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在 可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率；6. 質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響： 用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺旋的 DNA；7. 定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與外源 DNA的濃度呈正比；4.為何要低溫環(huán)境制備在制備過程中 , 細(xì)胞膜通透性增大而變得脆弱 , 低溫能提高感受 態(tài)細(xì)胞存活率 . 所以在制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)要保持低溫和不能劇烈 震蕩 .如果放于-20 C保存，時(shí)

4、間長了細(xì)胞內(nèi)部液化度較高的情況下，細(xì)胞會由于流動性的原因造成不可逆損傷， 甚至死亡。 所以要放 于-80攝氏度。原理：利用化學(xué)法CaCb處理對數(shù)生長期的 DH5x大腸桿菌或TG1 大腸桿菌(-為何選擇這兩種菌、兩種菌的不同處、生長曲線的 不同處)，使其對外源DNA通透性增加，從而達(dá)到外源 DNA分子 進(jìn)入細(xì)菌的目的。BL21 一般用于外源基因的原核表達(dá)，DH5a TG1和HB2151 般用于重組質(zhì)粒的克隆和擴(kuò)增。TG1長得慢，菌落較小，轉(zhuǎn)化效率高，用于普通的克隆測序， BL21(DE3)長的快，菌落較大，轉(zhuǎn)化效率低點(diǎn)，主要用于原核表 達(dá)。DH5況是擴(kuò)增菌，BL21是表達(dá)菌DH5況可以使質(zhì)粒高拷

5、貝數(shù)擴(kuò)增，BL21利于蛋白的表達(dá)，另外表 達(dá)菌還有很多，ps系列，roset系列等DH5況大腸桿菌：此種大腸桿菌，是一種誘變菌株，主要表現(xiàn)對 外源DNA的免疫缺乏。是用于基因工程的菌種， 相比于正常菌種 缺少了一定的免疫機(jī)制。試劑：(1) DH5x E.coli 菌株E.coliK-12 衍生菌(2) 80mM( mmol/L) CaCb (滅菌)(0.44g f 50mL,搖勻； 0.88gCaCI 2 1OOmLHO)(3) 液體LB培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)室直接購買現(xiàn)成的，不需要配制)(- 濃度是如何確定的這個(gè)查查看我沒查過看看濃度是否有影響)取250mL三角瓶x 2,洗凈2.5g lOOmLddH

6、O并搖勻使其溶解后，按1:1000比例加入100卩L1mol/L( 1M)NaOH調(diào)節(jié)至PH7.0(4) 甘油(100沂油，10mL或 20mL) 15mL/管x 2高溫滅菌121 C, 20min對于E.coli菌株用8種不同濃度的CaCl2制備感受態(tài)細(xì)胞，然后 轉(zhuǎn)化各濃度的感受態(tài)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 ，不同濃度CaCl2溶液 處理所得到的感受態(tài)細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化效率有很大的不同。隨著CaCI2 濃度增高，轉(zhuǎn)化效率也隨之提高，在80mmol/L100mmol/L時(shí)達(dá) 到峰值，進(jìn)一步提高CaCl2的濃度，轉(zhuǎn)化效率急劇下降。(CaCl2濃度對感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響王友如(湖北師范學(xué)院生物系，湖北黃石4

7、35002) 滅菌的準(zhǔn)備及試劑配置(1) CaCl2, 100mL分裝于2個(gè)50mL管中，滅菌備用。(2) 甘油，10mL備用滅菌(3) 1個(gè)Amp LB固體培養(yǎng)基平板(用于劃線，挑去單克隆菌株)(4) 100mLAmp培 養(yǎng)基(5) 1020個(gè)10mL離心管48個(gè)50mL離心管感受態(tài)細(xì)胞的制備(化學(xué)CaCl2法)-實(shí)驗(yàn)操作中嚴(yán)格滅菌、低溫、速度 DH5a菌株在Amp LB固體培養(yǎng)基平板上劃線，37C培養(yǎng)12 16h，至其長出單克隆菌株。（-劃線作用、培養(yǎng)時(shí)間作用） TG1菌株生長速度比 DH5a快，只需37 C培養(yǎng)8 12h 劃線作用用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面通過分區(qū)劃線而達(dá)到純化分離微生物的

8、一種方法。是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點(diǎn)到線”稀釋而達(dá)到分離的目的。用于目的微生物的分離，便于得到目的性狀的單克隆。培養(yǎng)時(shí)間從圖1可以看出，重組大腸桿菌DH5a生長的4個(gè)時(shí)期區(qū)分非常明顯。03h為遲緩期，重組大腸桿菌適應(yīng)新的環(huán)境，繁殖的 速度很慢；49h為對數(shù)生長期，此時(shí)營養(yǎng)物質(zhì)很充分，重組大 腸桿菌呈對數(shù)快速增長；1016h為穩(wěn)定期,由于培養(yǎng)基中的營 養(yǎng)物質(zhì)不斷地被消耗掉，重組大腸桿菌新陳代謝產(chǎn)生的毒性 物質(zhì)的積累以及 pH值下降等因素的影響，重組大腸桿菌繁殖 的速度逐漸下降，而死亡的細(xì)菌數(shù)開始逐漸增加，增殖數(shù)與死 亡數(shù)漸趨平衡，細(xì)菌總數(shù)處于穩(wěn)定的狀態(tài)；1720h為衰亡期， 由于

9、營養(yǎng)物質(zhì)逐漸減少，而毒性物質(zhì)越來越多，重組大腸桿菌 的繁殖速度就逐漸減緩，死亡菌數(shù)明顯增多，衰亡的速度超過 繁殖的速度，細(xì)菌總數(shù)就呈現(xiàn)下降趨勢。所以選擇培養(yǎng)時(shí)間為1216小時(shí)。 Amp LB平板上挑取單菌落，輕移至ImLLBAmf液體培養(yǎng)基中（2mL離心管）,37C 220rpm/min，搖床37 C培養(yǎng)8h左右。 取1mLX 2的空白培養(yǎng)基做對照暫存于 4度，將1mL活化菌液全部轉(zhuǎn)移至 100mLLBAmp液體培養(yǎng)基中，37C, 220rpm/min培養(yǎng)2h3h,使其ODo。約等于0.40.6 （處于對數(shù)生長期）（- 培養(yǎng)時(shí)間可否延長，OD直為何測OD60。其數(shù)值可否超過0.6 , 原因什么

10、）注：測OD值準(zhǔn)備-槍、槍頭、菌液、空白培養(yǎng)基、ddH2O紙巾空白對照：第三步去除的空白培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)組：搖菌后的菌 進(jìn)行第四步之前準(zhǔn)備冰、冰盒、 10ml管、菌液全部埋于冰中。2ml或1.5ml空管放-20 C預(yù)冷。培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)該不能延長，死亡細(xì)菌數(shù)量會增多，造成細(xì)菌總量下 降。OD600實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長密度和生長期，多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測推斷細(xì)菌的生長密度。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn)，需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn) 確測定細(xì)菌細(xì)胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的 標(biāo)準(zhǔn)方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。測量細(xì)菌培養(yǎng)液在600nm處的吸光值，得到的OD600的數(shù)值如 果在0.

11、6-0.8 之間，表明細(xì)菌處于旺盛生長的對數(shù)生長期， OD600>3表明細(xì)菌已經(jīng)飽和等。細(xì)菌的生長情況，可以通過測OD600來監(jiān)測。細(xì)菌的生長比較好的時(shí)期是在 OD600為1時(shí)，此 時(shí)可以進(jìn)行轉(zhuǎn)代等研究.在細(xì)菌的培養(yǎng)中,OD600超過0.8就要稀 釋培養(yǎng)液。不同的菌種的 OD600的標(biāo)準(zhǔn)可能不同，對于 DH5x而言，OD600 值為0.40.6為對數(shù)生長期。如果超過0.6的話，細(xì)菌的繁殖速 度開始下降、生長力下降，一些細(xì)菌會老化死亡。 將培養(yǎng)液置于冰上10mi n，然后，將菌液分裝至 10mL管中， 3000rpm或4000rpm4度離心4min6min，收集細(xì)菌沉淀。 棄上清（把剩余菌

12、液吸掉?。┯妙A(yù)冷的80mmol/LCaCb輕輕重懸細(xì)菌（輕輕吹打，10次左右），每20mL培養(yǎng)液可用2mLCaC2 重懸，然后，置于冰上冰浴 40 60min，3000 4000rpm4度 離心6min 10min，棄上清，保留菌體沉淀。（-CaCI2作用） 每100mL液體培養(yǎng)基對應(yīng) 5 6mLCaC2/甘油重懸每管1mL或2mL都可CaCl2/甘油溶液為<甘油：CaCl2 （80mM >=<1:4>=<1mL:4mL>（-為何用CaCl2/甘油溶液=1:4保菌有什么說法） 感受態(tài)細(xì)胞置于-80 C或-40 C冰箱保存?zhèn)溆?。?2mL離心管 或1.5ml離心管（之前已提前預(yù)冷）分裝好，離心管要提前置 于-20 C預(yù)冷。注：TG1菌株（8h）比DH5x菌株（16h）生長速度快近一倍。CaCl2作用：增加細(xì)胞的通透性細(xì)菌處于0 c ,CaCI2的低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混 合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表 面，經(jīng)42 C短時(shí)間熱沖擊處理，促使細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物. 鈣離子的作用是結(jié)合于細(xì)胞膜上 , 是細(xì)胞膜呈現(xiàn)一種液晶態(tài) . 在 冷熱變化刺激下液晶態(tài)的細(xì)胞膜表面會產(chǎn)生裂隙，使外源DNA進(jìn) 入.甘油作用：保菌一、冷凍保存時(shí)菌液會被凍起來，內(nèi)部產(chǎn)生的“冰晶”會使細(xì)