DNA受重離子輻射后的結(jié)構(gòu)變化和碎片長度分布ppt課件

1、DNA受重離子輻射后的結(jié)構(gòu)變化和碎片長度分布趙趙 葵葵 隋隋 麗麗 倪嵋楠倪嵋楠 郭繼宇郭繼宇 梅俊平梅俊平 孔福全孔福全 路秀琴路秀琴 周周 平平原子能院核物理所原子能院核物理所第十次全國核結(jié)構(gòu)討論會第十次全國核結(jié)構(gòu)討論會脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸DNADNA）腺嘌呤腺嘌呤腺嘧啶腺嘧啶鳥嘌呤鳥嘌呤胞嘧啶胞嘧啶脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸DNA）n在輻射生物學(xué)和放射醫(yī)學(xué)中，DNA是電離輻射引致細胞殺傷或轉(zhuǎn)化的主要靶分子。nDNA的輻射損傷是輻射所致生物效應(yīng)中最基本和最關(guān)鍵的一環(huán)。電離輻射致電離輻射致DNADNA的損傷的損傷n 電離輻射損傷DNA途徑:n直接作用n 指射線直接作用于DNA分子，通過電離

2、和激發(fā)使DNA受到損傷。n間接作用n 指射線與DNA周圍其它原子或分子特別是水分子作用，產(chǎn)生具有很高活性的自由基如OH，H和eaq-）進而損傷DNA。堿基變化堿基變化 脫氧核糖變化脫氧核糖變化DNADNA鏈斷裂鏈斷裂 單鏈斷裂單鏈斷裂SSBSSB） 雙鏈斷裂雙鏈斷裂DSBDSB）交聯(lián)交聯(lián) DNA DNA鏈交聯(lián)鏈交聯(lián) DNA-DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)蛋白質(zhì)交聯(lián) 其中其中DSBDSB是輻射所致生物學(xué)效應(yīng)是輻射所致生物學(xué)效應(yīng)中最重要的原初損傷，而非重接性的中最重要的原初損傷，而非重接性的DSBDSB則被認為是細胞殺傷效應(yīng)的最重要則被認為是細胞殺傷效應(yīng)的最重要的損傷。的損傷。電離輻射致電離輻射致DNADNA

3、分子的變化分子的變化DNA鏈斷裂示意圖鏈斷裂示意圖單鏈斷裂雙鏈斷裂單鏈斷裂：是單鏈斷裂：是DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中一條鏈斷裂。雙螺旋結(jié)構(gòu)中一條鏈斷裂。雙鏈斷裂：是雙鏈斷裂：是DNA的兩條互補鏈于同一對應(yīng)處或相鄰處同時斷裂。的兩條互補鏈于同一對應(yīng)處或相鄰處同時斷裂。n是具有高傳能線密度是具有高傳能線密度LETLET的的電離輻射，它所引起的能量沉積電離輻射，它所引起的能量沉積密集，局部劑量大。密集，局部劑量大。n 與低與低LETLET輻射輻射( (如如 X X、 射線射線和電子束等和電子束等) )相比，通過物質(zhì)時相比，通過物質(zhì)時有完全不同結(jié)構(gòu)的電離徑跡，所有完全不同結(jié)構(gòu)的電離徑跡，所引起的損傷機制也極為

4、復(fù)雜。引起的損傷機制也極為復(fù)雜。重離子的特征質(zhì)子和碳離子在水中徑跡比較國內(nèi)外的研究DSB的方法n中性梯度沉降中性梯度沉降n中性過濾淘析中性過濾淘析n凝膠電泳凝膠電泳n早期染色體凝縮早期染色體凝縮n電子顯微鏡電子顯微鏡n原子力顯微鏡原子力顯微鏡這幾種方法都有一定這幾種方法都有一定的適用范圍和局限性，的適用范圍和局限性，不同程度地存在著靈不同程度地存在著靈敏性差、物理基礎(chǔ)不敏性差、物理基礎(chǔ)不清楚及操作復(fù)雜等缺清楚及操作復(fù)雜等缺點。近來的一些研究點。近來的一些研究證實，這些方法低估證實，這些方法低估了了DSBs的產(chǎn)額。的產(chǎn)額。原子力顯微鏡原子力顯微鏡(AFM)(AFM)原理原理 具有可達幾納米的高分

5、辨具有可達幾納米的高分辨本領(lǐng)，可以研究包括絕緣體和本領(lǐng)，可以研究包括絕緣體和導(dǎo)體在內(nèi)的許多不同材料的表導(dǎo)體在內(nèi)的許多不同材料的表面原子結(jié)構(gòu)和組織形態(tài)，還可面原子結(jié)構(gòu)和組織形態(tài)，還可以用于有機分子和生物樣品的以用于有機分子和生物樣品的研究。因而有更加廣泛的應(yīng)用研究。因而有更加廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。領(lǐng)域。 原子力顯微鏡原子力顯微鏡(AFM)(AFM)特點特點利用利用AFM研究研究DSB狀況狀況 利用AFM觀測電離輻射致DNA雙鏈斷裂在國外從2019年起僅有的幾個實驗研究中，所用的電離輻射源是電子、X射線、射線和粒子，給出了輻照后DNA分子的結(jié)構(gòu)變化。利用利用AFM研究研究DSB狀況狀況 (1)2019

6、(1)2019年美國喬治華盛頓大年美國喬治華盛頓大學(xué)的學(xué)的D.PANGD.PANG等人用等人用AFMAFM在水溶在水溶液中測量輻射液中測量輻射( (電子電子) )引起的引起的DNADNA雙鏈斷裂的第一個實驗。雙鏈斷裂的第一個實驗。 （D.Pang et al. D.Pang et al. Scan.Microsc.Scan.Microsc. 10(2019)1105-111010(2019)1105-1110）(B) 50 Gy，750-850nm占88，平均長度790nm(C)100 Gy，750-850nm占67，143-750nm占23，平均長度690nm(D)150 Gy，最多碎片20

7、0nm長，占40，平均長度400nm(E)200 Gy，50-150nm占36，150-250nm占32，平均長度200nm利用利用AFM研究研究DSB狀況狀況 (2)2019 (2)2019年年D.Pang D.Pang 等人又用同樣等人又用同樣方法測量了中子引起的方法測量了中子引起的DNADNA損傷。損傷。 （D.Pang et D.Pang et al., Radiation al., Radiation Research Research 150(2019)612-618150(2019)612-618） 中子對中子對DNADNA的輻射，導(dǎo)致了許的輻射，導(dǎo)致了許多短碎片的產(chǎn)生，多短碎片

8、的產(chǎn)生，DSBsDSBs的分布的分布更局部、更密集。為成團的更局部、更密集。為成團的DNADNA雙鏈斷裂提供了實驗證據(jù)。雙鏈斷裂提供了實驗證據(jù)。（3 320002000年，日本輻射生年，日本輻射生物科學(xué)研究所的一個小物科學(xué)研究所的一個小組用組用AFMAFM研究了研究了60Co60Co的的射線誘發(fā)的射線誘發(fā)的DNADNA損傷。觀損傷。觀測到了閉環(huán)完整測到了閉環(huán)完整DNADNA分分子）、開環(huán)單鏈斷裂子）、開環(huán)單鏈斷裂和線性雙鏈斷裂三和線性雙鏈斷裂三種形態(tài)的質(zhì)粒種形態(tài)的質(zhì)粒DNADNA及它們及它們隨劑量的變化情況。隨劑量的變化情況。利用利用AFM研究研究DSB狀況狀況利用利用AFM研究研究DSB狀況

9、狀況 利用利用AFMAFM直接觀測重離子誘發(fā)的直接觀測重離子誘發(fā)的DNADNA鏈鏈斷裂的實驗則未見正式報道。斷裂的實驗則未見正式報道。 我們采用加速器輻照技術(shù)與先進的原我們采用加速器輻照技術(shù)與先進的原子力顯微鏡技術(shù)相結(jié)合的研究方法，以生子力顯微鏡技術(shù)相結(jié)合的研究方法，以生物大分子物大分子DNADNA為切入點，在分子水平上研為切入點，在分子水平上研究重離子誘發(fā)的究重離子誘發(fā)的DNADNA雙鏈斷裂。雙鏈斷裂。 HI-13 HI-13 串列加速器平面圖串列加速器平面圖HI-13串列加速器可加速的重離子串列加速器可加速的重離子 及其在生物及其在生物(水水)中的特性中的特性離離子子種種類類 能能量量(M

10、eV) (MeV/A) LET(keV/m) R(m) 4He 36 9.0 20 1000 18 4.5 30 290 7Li 48 6.8 56 500 22 3.1 100 130 12C 60 5.0 282 130 72 6.0 245 176 16O 104 6.5 400 164 40 2.5 750 40 19F 76 4.0 686 80 31P 117 3.77 1580 57 35Cl 118 3.37 1900 50 75 2.14 2400 30 56Fe 140 2.5 4300 40 79Br 130 1.65 5700 30 107Ag 180 1.68 900

11、0 30 127I 200 1.57 10000 35實驗設(shè)施的其它優(yōu)勢w 重離子掃描輻照裝置，可以在重離子掃描輻照裝置，可以在3 330cm30cm范圍內(nèi)提供均勻的束流；范圍內(nèi)提供均勻的束流；w 北京北京Q3DQ3D磁譜儀可提供均勻的、磁譜儀可提供均勻的、 無無輻射、低本底輻射源；輻射、低本底輻射源；w 串列加速器已經(jīng)加速了碳的微串列加速器已經(jīng)加速了碳的微集團束；集團束；w 微束裝置；微束裝置；w 原子力顯微鏡。原子力顯微鏡。重離子掃描裝置重離子掃描裝置北京Q3D磁譜儀Q3D磁譜儀結(jié)構(gòu)示意圖AJ-AJ-型掃描探針顯微鏡型掃描探針顯微鏡AJ型掃描探針顯微鏡 的技術(shù)指標w 樣品臺大小樣品臺大小

12、10mm10mmw 掃描范圍掃描范圍 6 66 6m mmaxmax）w 分辨率分辨率 w STM: x,y STM: x,y 0.1nm ,z0.1nm ,z0.01nm0.01nmw AFM: x,y AFM: x,y 1.0nm, z 1.0nm, z0.1nm0.1nmw 電子學(xué)為電子學(xué)為DSPDSP控制控制 實驗研究進展 1、利用HI-13串列加速器產(chǎn)生的的7Li和12C重離子，以不同的劑量1，2，4，6，8，10Gy對純化的pGEMT1質(zhì)粒DNA水溶液進行了輻照； 2、利用原子力顯微鏡對輻照后的DNA進行了觀測，給出DNA形態(tài)隨劑量的變化； 3、得到不同劑量下DNA碎片長度的分布函

13、數(shù)，并用Tsallis熵統(tǒng)計理論對實驗結(jié)果進行了擬合。 重離子輻射致DNA鏈斷裂碎片的AFM觀測重離子種類束流能量（MeV）LET（keV/m）射程（m）7Li2612490.812C84242185.7n 輻照用重離子種類及相應(yīng)物理參數(shù)輻照用重離子種類及相應(yīng)物理參數(shù)n 輻照用輻照用DNA樣品樣品n pGEMT-1質(zhì)粒質(zhì)粒DNA水溶液）水溶液）,形態(tài)為超螺旋和開環(huán)形態(tài)為超螺旋和開環(huán) 注：注：LET值為在水中的值為在水中的LET值值未輻照pGEMT-1質(zhì)粒DNA7Li7Li離子輻射致離子輻射致DNADNA斷裂斷裂碎片的碎片的AFMAFM觀測觀測(AJ-(AJ-型型AFM)AFM)（A）輻照劑量為

14、輻照劑量為1.0Gy（B）輻照劑量為輻照劑量為6.2Gy7Li7Li離子輻射致離子輻射致DNADNA斷裂斷裂碎片的碎片的AFMAFM觀測觀測(AJ-(AJ-型型AFM)AFM)（A）劑量為劑量為4.1Gy（B）劑量略大于劑量略大于10Gy7Li離子輻照后DNA分子三種形態(tài)所占比例與劑量的關(guān)系 SC: 超螺旋超螺旋OC: 開開 環(huán)環(huán) L: 線線 性性02468100.00.20.40.60.81.0SCOC L FractionDose (Gy)7Li7Li離子輻射致離子輻射致DNADNA斷裂碎片斷裂碎片長度的分布長度的分布020040060080010001200140016000.000.0

15、20.040.060.080.100.120.140.160.180.20 Fraction of fragmentsFragment length (nm)020040060080010001200140016000.000.020.040.060.080.100.120.140.160.180.20 Fraction of fragmentsFragment length (nm)（A）劑量為2.1Gy（B）劑量為劑量為4.1Gy020040060080010001200140016000.000.020.040.060.080.100.120.140.160.180.20 Fractio

16、n of fragmentsFragment length (nm)020040060080010001200140016000.000.020.040.060.080.100.120.140.160.180.20 Fracion of fragmentsFragment length (nm)020040060080010001200140016000.000.020.040.060.080.100.120.140.160.180.20 Fraction of fragmentsFragment length (nm)（C）劑量為劑量為6.2Gy（D）劑量為劑量為8.2Gy（E）劑量劑量l略

17、大于略大于10Gy12C12C離子輻射致離子輻射致DNADNA斷裂斷裂碎片的碎片的AFMAFM觀測觀測（A）輻照劑量為輻照劑量為1.1Gy（B）輻照劑量為輻照劑量為8.1Gy12C12C和和7Li7Li離子輻射致離子輻射致DNADNA斷裂斷裂碎片長度分布的比較碎片長度分布的比較020040060080010001200140016000.000.020.040.060.080.100.120.140.160.180.20 Fraction of fragmentsFragment length (nm)020040060080010001200140016000.000.020.040.060

18、.080.100.120.140.160.180.20 Fracion of fragmentsFragment length (nm)8.1Gy的的12C離子離子8.2Gy的的7Li離子離子DNA雙鏈斷裂的統(tǒng)計模型分析借用Tsallis熵擬合實驗數(shù)據(jù)11(2)( )1(1) qqp lql其中其中為拉格朗日乘子，為拉格朗日乘子，q q為實數(shù)。為實數(shù)。 由于由于DNADNA的雙鏈斷裂在空間上是有的雙鏈斷裂在空間上是有關(guān)聯(lián)的，因此，用關(guān)聯(lián)的，因此，用TsallisTsallis熵來研究這熵來研究這種帶有關(guān)聯(lián)的種帶有關(guān)聯(lián)的DNADNA雙鏈斷裂。利用雙鏈斷裂。利用TsallisTsallis熵宏觀統(tǒng)

19、計理論推導(dǎo)出的熵宏觀統(tǒng)計理論推導(dǎo)出的DNADNA雙鏈斷裂的分布函數(shù)如下：雙鏈斷裂的分布函數(shù)如下：Tsallis熵擬合0.00.20.40.60.81.00.000.050.100.150.20 FractionRelative length0.00.20.40.60.81.00.000.050.100.150.200.250.300.35 FractionRelative length8.2Gy的的7Li離子離子8.1Gy的的12C離子離子 實驗數(shù)據(jù) 擬合曲線 實驗數(shù)據(jù) 擬合曲線 AFM顯微技術(shù)，是在分子水平上研究輻射所致DNA損傷的有力工具。 與傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)相比，AFM能夠區(qū)分DNA分子的各種形態(tài)，并能實現(xiàn)對重離子輻照誘發(fā)的DNA較小片段的測量。 結(jié) 論 一n 在同一在同一LETLET值下，隨著劑量的增加，值下，隨著劑量的增加，DNADNA分子的分子的形態(tài)由形態(tài)由SCSC型逐漸向型逐漸向OCOC型或型或L L型變化，且碎片的長型變化，且碎片的長度逐漸縮短；度