抗氧化酶SODPODCAT活性測定方法

1、抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性測定方法一、 超氧化物歧化酶(SOD )活性測定(氮藍四唑光化還原法)1試劑的配制(1) 0.05mol/L 磷酸緩沖液(PBS，pH7.8):A 母液：0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液：取 Na2HPO4 12H2O (分子量 358.14) 71.7g；B 母液：0.2mol/L 磷酸二氫鈉溶液：取 NaH2PO42H2O (分子量 156.01) 31.2g。分別用蒸餾水定容到 1000ml。0.05mol/L PBS ( pH7.8 )的配制：分別取 A 母液(W2HPO4) 228.75ml , B 母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸餾

2、水定容至 1000ml。參考文獻：李合生主編：植物生理生化實驗原理和技術(shù)高等教育出版社，2000： 267268。(2) 14.5mM甲硫氨酸溶液：取 2.1637g Met用磷酸緩沖液(pH7.8)定容至1000ml。(3) 30卩M EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na 2用磷酸緩沖液定容至 100ml。(4) 60卩M核黃素溶液：取0.0023g核黃素用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存。(5) 2.25mM 氮藍四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。酶液制備：取0.2g(可視情況調(diào)整)樣品(新鮮葉片或根系)洗凈后置于預(yù)冷的研缽中

3、， 加入1.6ml 50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液(pH7.8 )在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在 4C、 12000g下離心20min，上清液即為酶液。2、酶活性測定(1) 反應(yīng)混合液配制(以60個樣為準(zhǔn))：分別取Met溶液162ml, EDTA-Na 2溶液0.6ml, 磷酸緩沖液5.4ml , NBT溶液6ml，核黃素溶液6ml,混合后搖勻；(2) 分別取3ml反應(yīng)混合液和30 d酶液于試管中(3) 將試管置于光照培養(yǎng)箱中在4000 lux光照下反應(yīng)20min ;同時做兩支對照管，其中1支試管取3ml反應(yīng)混合液加入 30 d PBS (不加酶液)照光后測定作為最大光還原管，另 1支只

4、加緩沖液置于暗中測定時用于調(diào)零。(4) 以不照光的對照管(只有緩沖液并置于暗處)調(diào)零后，避光測OD560(出現(xiàn)顏色即 可測定)。（5）酶活性計算：SOD活性單位以抑制 NBT光化還原50%所需酶量（測的樣品值要在最大管的一半左右才合適，否則要調(diào)整酶量）為1個酶活單位（u）。SOD 總活性= （Ack-AE ）刃/ （1/2AckXWK Vt）SOD比活力=SOD總活性/蛋白質(zhì)含量SOD總活性以鮮重酶單位每克表示（u/g FW）;比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示；Ack為照光對照管的吸光度；Ae為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積（ml,1.6ml ,加入PBS 的體積）;Vt為測定時的酶液用量（

5、ml, 30ul）; W為樣品鮮重（g,測定時應(yīng)換算為葉綠體 的質(zhì)量mg）;蛋白質(zhì)含量單位為mg/g。二、POD、CAT酶活性的測定粗酶液制備同SOD。1、過氧化物酶（POD ）活性測定（愈創(chuàng)木酚法）（1）試劑配制：0.2mol/L 磷酸緩沖液（pH6.0）:分別取 A 母液（W2HPO4） 123ml 和 B 母液（NaH2PO4） 877ml 混勻即為 1000ml PBS（0.2M , pH6.0）;（2）反應(yīng)混合液配制（以 60個樣為準(zhǔn)）：取200ml PBS（0.2M , pH6.0），加入0.076ml液體（原液）愈創(chuàng)木酚（2-甲氧基酚）加熱 攪拌溶解，冷卻后加入 0.112ml

6、30 %的H2O2，混勻后保存于冰箱中備用。（3）樣品測定：取3ml反應(yīng)液并加入30卩酶液，以PBS為對照調(diào)零，而后測定OD470值（測定40秒）。 （邊加樣邊測定，測定前等待5秒，動作要快，如果慢的話，要保證每個樣品從加好樣到開始記時的時間相差不大）（4） 酶活性計算：以每 min OD值變化（升高）0.01為1個酶活性單位（u）。POD= （ A470 x Vt / （W Vs >0.01（u/g min） A47Q為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重（g）; t為反應(yīng)時間（min） ; Vt為提取酶液總體積（ml, （1.6ml）; Vs為測定時取用酶液體積（ml, 30ul）。

7、2、過氧化氫酶（CAT ）活性測定（1）試劑配制:0.15mol/L 磷酸緩沖液(pH7.0):取 A 母液(Na2HPO4)457.5 ml 和 B 母液(NaH2PO4)292.5 ml混合后用蒸餾水定容至 1000ml。(2) 反應(yīng)液配制：取 200ml PBS (0.15M , pH7.0),加入 0.3092ml 30% 的 H2O2 (原液) 搖勻即可。(3) 樣品測定：取3ml反應(yīng)液加入0.1ml (可視情況調(diào)整)酶液，以PBS為對照調(diào)零， 測定OD240 (紫外)(測定40s)。(4) 酶活性計算：以每 min OD值減少0.01為1個酶活性單位(u)。CAT= A240 x

8、Vt ( W Vs >0.01 妙 (u/g min) A24Q為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g); t為反應(yīng)時間(min) ; Vt為提取酶液總體積(ml, 1.6ml); Vs為測定時取用酶液體積(ml, 0.1ml )。四、超氧陰離子自由基(O2.-)產(chǎn)生速率的測定(羥胺氧化法)1、試劑的配制(1) 1mM鹽酸羥胺溶液：稱取 0.02085g鹽酸羥胺用蒸餾水定容至300ml;(2) 17mM對氨基苯磺酸溶液：稱取1.1776g對氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液(冰 醋酸：水=1： 3配制)加熱溶解后定容至 400ml;(3) 7mia -萘胺溶液：稱取0.4008g a-萘胺

9、用冰醋酸水溶液(冰醋酸：水=3: 1配制) 定容至400ml。2、02.-含量的測定(1) 樣品液提取方法同 SOD測定；(2) 取0.5ml提取液(酶液)(可視情況調(diào)整用量)中加入0.5ml PBS (0.05M , pH7.8), 1ml 1mM鹽酸羥胺溶液后搖勻。(3) 在25 C下保溫1小時；(4) 依次先加入1ml 17mM對氨基苯磺酸，再加入1ml 7mM a -萘胺，混合后快速搖勻；(5) 在25C下保溫20min后在3000Xg下離心3min后馬上進行測定(或置于冰箱待測)；(6) 以對照管調(diào)零(用水調(diào)零)，取粉紅色水相液測定 OD530值(測定)；(7) 02.-含量的計算：

10、由測得的OD530，查NO2-標(biāo)準(zhǔn)曲線得到NO2-;根據(jù)羥胺與02.-的反應(yīng)式：NH2OH + 2O2.+ H+NO2-+ H2O2 + H2O 計算O2.-，即NO2- >=02.-;再。2.-產(chǎn)生速率(以 nmol min-1mg-1根據(jù)樣品與羥胺反應(yīng)的時間和樣品中的蛋白質(zhì)含量，求得 蛋白表示，也可以 nmol min -1g-1 鮮重表示)。02.-產(chǎn)生速率=(CXV) / (t >W)(nmol min-1g-1 鮮重)C 為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的濃度 (umol/L) ； V 為測定時所取提取液用量 (葉綠體稀釋后的體積)；t為反應(yīng)時間(60min) ； W為樣品鮮重(葉綠體實

11、際質(zhì)量g)參考文獻：王愛國，羅廣華.植物生理學(xué)通訊，1990, (6) : 5557五、丙二醛含量的測定1 、試劑配制：10%TCA 100g 三氯乙酸t(yī) 1L0.67%TBA 3.35g 硫代巴比妥酸 t 500ml 10%TCA (避光)2、測定步驟 :0.2 樣品 +1.6ml 10%TCA 研磨t 12000g 離心 10min t上清 1.5ml +1.5 0.67% TBA t沸水煮30min t冷卻，離心t上清 Ok。，OD32, OD003、計算組織中MDA含量：MDA濃度 C (umol/L)=6.45(0D532-0D600)-0.560D450MDA含量(umol/g F

12、W)=C > V/W式中V為提取液體積(1.6ml) , W為樣品鮮重(0.2g)。六、植物細胞質(zhì)膜透性的測定(電導(dǎo)儀法)(1 )取新鮮葉片或根系(不能萎蔫) 0.3g ，用自來水沖洗表面污漬，再用去離子水沖洗幾 遍后用吸水紙吸干水分；(2) 樣品剪碎(也可打孔取樣)放入試管(或15ml 大離心管)中，加 10ml 去離子水，在室溫下放置3h使葉片充分吸水后測定溶液電導(dǎo)率(R1);(3) 再放入恒溫水浴鍋中在100 C沸水浴中煮 20min以殺死葉片組織，用冷水冷卻到室溫 后測定溶液電導(dǎo)率 (R2)；(4) 用公式計算質(zhì)膜相對透性(用相對電導(dǎo)率表示)：相對電導(dǎo)率( %) =R1/R2&g

13、t; 100%還可以計算植株傷害程度：傷害率 =(處理電導(dǎo)率對照電導(dǎo)率) /(煮沸電導(dǎo)率對照電導(dǎo)率)> 100%七、可溶性蛋白含量的測定(考馬斯亮藍染色法)1 、試劑的配制(1)考馬斯亮藍溶液配制：稱取100 mg 考馬斯亮藍，溶于 50 ml 90乙醇中，加入100 ml 85 %( W/V )的磷酸，再用蒸餾水定容到1L。在過夜后過濾并貯于棕色瓶中，常溫可在暗中保存一個月。（2）100卩g/ml牛血清蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取25mg BSA加水溶解后定容至 100 ml, 再從中吸取 40ml用蒸餾水定容至 100 ml （也可取10mg BSA定容至100ml即為100卩g/ml 標(biāo)準(zhǔn) BSA 溶液）。2、樣品可溶性蛋白含量的測定（1）樣品可溶性蛋白含量測定：取20卩提取液（酶液）加入 80門0.05M