從細(xì)胞中提取RNA的方法

1、從細(xì)胞中提取RNA勺方法1 .加入800ul的Trizol將細(xì)胞懸浮起來，在室溫下（15-30 °C）用手 搖均，放置5分鐘以上；2 .渦旋30秒后，將樣品輕離至底部，加入160ul的氯仿，再渦旋30 秒，室溫放置2-5分鐘；3,用4°C離心機(jī)，13000rpm離心15分鐘，使樣品分層；4 .將最上面的水相溶液層轉(zhuǎn)移到新的1.7ml離心管中，加入2ul的 糖原 Glucogen;5 .再加入400ul冰上預(yù)冷的異丙醇Isopropanol ,搖均。-20 °C放置 1小時(shí)或過夜；6 .用4 °C離心機(jī)，13000rpm離心15分鐘，棄上清；7 .力口 2

2、00ul 75% 無RNase酶的酒精洗 RNA 13000rpm離心15分鐘；8 .棄上清，盡量不要碰到 RNA Pillet ;9 .在超凈臺(tái)上，干燥大約8分鐘；10 .用無RNase酶的去離子水或是 DEPC Water溶解RNA在室溫下 靜置10分鐘，待RNA全溶解，保存在-80 °C （或是立刻做RT-PCR 翻轉(zhuǎn)成cDN琳存在-20 ）。注：In 1ml Trizol5-10 x 10八6 cells ;1 x 10八7 bacterial cells.At RT, lysis 5 mins.特點(diǎn)Trizol試劑可以快速提取人、動(dòng)物、植物、細(xì)菌不同組織的總RNA該方法對(duì)少

3、量的組織(50-100 mg)?口細(xì)胞(5X106)以及大量的組織(>1 g)和細(xì)胞(>107)均有 較好的分離效果。TRIZOL試劑操作上的簡(jiǎn)單性允許同時(shí)處理多個(gè)的樣品。所有 的操作可以在一小時(shí)內(nèi)完成。TRIZOL抽提白總RNAtt夠避免DNAffi蛋白的污染。 故而能夠作RNA印跡分析、斑點(diǎn)雜交、poly(A)+選擇、體外翻譯、RNAB保護(hù) 分析和分子克隆。如果是用于 PCR當(dāng)兩條引物位于單一外顯子內(nèi)時(shí)，建議用級(jí) 聯(lián)擴(kuò)大的DNase I(Cat. No. 18068) 來處理抽提的總 RNA并且利用DNA RNA 和蛋白質(zhì)在不同溶液中的溶解性質(zhì)，可以通過分層分別將不同層中的RN

4、A(上層)、DNA(中層)、蛋白質(zhì)(下層)分離純化出來，效率極好。Trizol試劑能促進(jìn)不同種屬不同分子量大小的多種RNA勺析出。例如，從大鼠肝臟抽提的RNAS脂糖凝膠電泳 并用澳化乙噬染色,可見許多介于7 kb和15 kb 之間不連續(xù)的高分子量條帶，(mRNA口 hnRN峨分)兩條優(yōu)勢(shì)核糖體 RNA帶 位于 5 kb (28S)和2 kb (18S),低分子量 RNg于 0.1 和 0.3 kb 之間(tRNA, 5S)。當(dāng)抽提的RNAffl TE稀釋時(shí)其A260/A280比伯> 1.8折疊編輯本段使用方法1 .樣品的制備 當(dāng)樣品富含蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或是細(xì)胞外物質(zhì)例如肌肉，脂肪 組織

5、和植物的塊莖部分時(shí)可能需要一額外的分離步驟。勻漿化后在28° C的條件下以12,000 Xg的離心力離心10分鐘，移除勻漿中不溶解的物質(zhì)，余下的沉 淀中包含有細(xì)胞外膜，多糖，以及高分子量DNA而上層的超浮游物含有 RNA在來自于脂肪組織的樣品中，大量的脂肪漂在最上層因而應(yīng)該除掉。 在每一個(gè)個(gè) 案中，將清亮的勻漿溶液轉(zhuǎn)移到一干凈的試管中加入氯仿并繼續(xù)進(jìn)行下述的分離 步驟。2 .分離階段 將勻漿樣品在1530。C條件下孵育5分鐘以使核蛋白體完全分 解。每1 ml TRIZOL加0.2 ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管 15秒并 將其在30° C下孵育23分鐘。在28&#

6、176; C下以不超過12,000Xg的離心力高 速冷凍離心15分鐘。離心后混合物分成三層：下層紅色的苯酚-氯仿層，中間層， 上層無色的水樣層。RNA®一例外地存在于水樣層當(dāng)中。水樣層的容量大約為所 力口 TRIZOL容量的60%3 . RNA勺沉淀將水樣層轉(zhuǎn)移到一干凈的試管中，如果希望分離 DNAffi蛋白，有 機(jī)層同樣要予以保留。通過將水樣層和異丙醇混合來沉淀 RNA最初均化時(shí)的每1 ml TRIZOL對(duì)應(yīng)0.5 ml異丙醇。將混合的樣品在15 30° C條件下孵育10分 鐘并在28° C下以不超過12,000 Xg的離心力高速冷凍離心10分鐘。RNAK 淀在

7、離心前通常不可見，形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。4 .RNA的洗脫 移去上層懸液。用75%勺乙醇洗滌RNAC淀一次，每1 ml的TRIZOL 至少加1 ml的75%S醇。旋渦振蕩?M合樣品并在 28° C下以不超過7,500 X g 的離心力高速冷凍離心5分鐘。5 . RNA勺再溶解 在操作的最后，簡(jiǎn)單干燥RNAM淀（空氣干燥或真空干燥5-10 分鐘）不要在真空管里離心干燥 RNA尤為重要的是，不能讓RNAK淀完全干燥 那樣會(huì)極大地降低它的可溶性。部分溶解的 RNA羊品其A260/280比值 1.6。用 移液管尖分幾次移取無RNAB的水或0.5% SDS容液來溶解RNA并在5

8、560° C 下孵育10分鐘（當(dāng)RNAW后要用于酶切反應(yīng)時(shí)，避免使用 SDS ） RNAa能被 100%3酰胺（除去離子）再?§解并保存在-70° Co折疊編輯本段使用TRIzol注意事項(xiàng)TRIzol對(duì)人體有害，使用時(shí)應(yīng)戴一次性手套，注意防止濺出。L樣品的制備當(dāng)樣品富含蛋白質(zhì)， 脂肪，多糖或是細(xì)胞外物質(zhì)例如肌肉，脂肪組 織和植物的塊莖部分時(shí)可能需要一額外的分離步驟。勻漿化后在28° C的條件下以12,000Xg的離心力離心10分鐘，移除勻漿中不溶解的物質(zhì)，余下的沉淀 中包含有細(xì)胞外膜，多糖，以及高分子量 DNA而上層的超浮游物含有 RNA在 來自于脂肪組

9、織的樣品中，大量的脂肪漂在最上層因而應(yīng)該除掉。 在每一個(gè)個(gè)案 中，將清亮的勻漿溶液轉(zhuǎn)移到一干凈的試管中加入氯仿并繼續(xù)進(jìn)行下述的分離步 驟。2.分離階段將勻漿樣品在15-30° C條件下孵育5分鐘以使核蛋白體完全分解。 每1mlTRIZOL加0.2ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管 15秒并將其在 30° C下孵育23分鐘。在28° C下以不超過12,000 Xg的離心力高速冷凍 離心15分鐘。離心后混合物分成三層：下層紅色的苯酚-氯仿層，中間層，上層 無色的水樣層。RNA5一例外地存在于水樣層當(dāng)中。水樣層的容量大約為所加 TRIZOL容量的60%3 . RN

10、A勺沉淀將水樣層轉(zhuǎn)移到一干凈的試管中，如果希望分離DNAffi蛋白，有機(jī)層同樣要予以保留。通過將水樣層和異丙醇混合來沉淀RNA最初均化時(shí)的每1mlTRIZOLM應(yīng)0.5ml異丙醇。將混合的樣品在15-30° C條件下孵育10分鐘 并在28° C下以不超過12,000Xg的離心力高速冷凍離心10分鐘。RNAK淀 在離心前通常不可見，形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。4 .RNA的洗脫移去上層懸液。用75%勺乙醇洗滌RNAK淀一次，每1ml的TRIZOL 至少加1ml的75叱醇。旋渦振蕩混合樣品并在 28° C下以不超過7,500 X g 的離心力高速冷凍離心5分

11、鐘。5. RNA勺再溶解在操作的最后，簡(jiǎn)單干燥 RNAK淀（空氣干燥或真空干燥 5-10 分鐘）不要在真空管里離心干燥 RNA尤為重要的是，不能讓RNAK淀完全干燥 那樣會(huì)極大地降低它的可溶性。部分溶解的 RNA羊品其A260/280比值1.6。用 移液管尖分幾次移取無 RNAB的水或0.5%SDS§液來溶解RNA并在55-60° C 下孵育10分鐘（當(dāng)RNAZ后要用于酶切反應(yīng)時(shí)，避免使用 SDS ） RNAS能被 100%3酰胺（除去離子）再溶解并保存在-70° CoRNAt提注意事項(xiàng)1 .從少量的組織（110 mg）或細(xì)胞（102 104）中分離RNA樣品：往組織或細(xì)胞 中加入800 J TRIZOL 0待樣品裂解后，加入氯仿并進(jìn)行步驟 2中的抽提操作。 在用異丙醇沉淀RNAi前，加入510jg無RNAS的脂質(zhì)體（Cat.No 10814）作 為水樣層的載體。為降低其黏度在加入氯仿前用26號(hào)注射器抽吸兩次以切斷基因組DNA脂質(zhì)體會(huì)留在水樣層中并和 RNAft析出。在濃縮到4 mg/ml之前它不 會(huì)抑制第一絲狀體的合成也不會(huì)