選修一52《多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片斷》課件

1、專題專題5 DNA5 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)和蛋白質(zhì)技術(shù) 課題課題2 2 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNADNA片斷片斷. . . 1.1.理解理解PCRPCR的原理和反應(yīng)過程。的原理和反應(yīng)過程。( (重、難點(diǎn)重、難點(diǎn)) )2.2.嘗試嘗試PCRPCR技術(shù)的基本操作。技術(shù)的基本操作。 3.3.討論討論P(yáng)CRPCR技術(shù)的應(yīng)用。技術(shù)的應(yīng)用。. . . 以“DNA復(fù)制”為背景材料，設(shè)計(jì)問題，導(dǎo)入新課，首先回顧DNA的結(jié)構(gòu)和復(fù)制的有關(guān)知識(shí)，然后了解PCR技術(shù)的原理和應(yīng)用，接著講解PCR技術(shù)的反應(yīng)過程及具體實(shí)驗(yàn)操作步驟，后以視頻觀看來再次學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)的知識(shí)點(diǎn)。最后通過課堂檢測(cè)完善所學(xué)內(nèi)容。 通過對(duì)PC

2、R反應(yīng)過程的教學(xué)，應(yīng)以讀圖識(shí)圖為主。教材中反應(yīng)過程圖解詳細(xì)的描繪了參與PCR的各種組成成分；每一輪反應(yīng)的三個(gè)基本步驟變性、復(fù)性、延伸；每一步驟的作用。在教學(xué)中分析圖形的同時(shí)，結(jié)合教科書中的文字說明來加深理解。. . . DNA復(fù)制復(fù)制1 1. . DNADNA分子能準(zhǔn)確復(fù)制的原因有哪些？分子能準(zhǔn)確復(fù)制的原因有哪些？2 2. .細(xì)胞內(nèi)哪些物質(zhì)是從頭合成的？細(xì)胞內(nèi)哪些物質(zhì)是從頭合成的？3 3. .如果在案件偵破過程中，只收集到一根毛發(fā)，如果在案件偵破過程中，只收集到一根毛發(fā)， 但但它所含的遺傳信息太少，該怎么辦呢它所含的遺傳信息太少，該怎么辦呢? ?. . . 一、一、DNADNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)

3、分子的雙螺旋結(jié)構(gòu) DNA DNA分子是由兩條反向平行的（即一條鏈為分子是由兩條反向平行的（即一條鏈為3355，另一條鏈為，另一條鏈為5 5 3 3 ）脫氧核苷酸）脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤旋而成的規(guī)則雙螺旋結(jié)長(zhǎng)鏈盤旋而成的規(guī)則雙螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu). .脫氧核糖與磷酸交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成脫氧核糖與磷酸交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；堿基排列在鏈的內(nèi)基本骨架；堿基排列在鏈的內(nèi)側(cè)側(cè). .兩條鏈上的堿基通過氫鍵連結(jié)起來，形成堿基兩條鏈上的堿基通過氫鍵連結(jié)起來，形成堿基對(duì)。堿基對(duì)的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定對(duì)。堿基對(duì)的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與胸腺嘧啶配與胸腺嘧啶配對(duì)對(duì), ,鳥鳥嘌呤一嘌呤一定與胞定與

4、胞嘧啶配嘧啶配對(duì)對(duì). . . . 二、二、DNADNA的復(fù)制的復(fù)制2 2、時(shí)期、時(shí)期有絲分裂有絲分裂間期間期 減數(shù)減數(shù)第一次分裂前的間期第一次分裂前的間期3 3、場(chǎng)所、場(chǎng)所細(xì)胞核（主）、線粒體、葉綠體細(xì)胞核（主）、線粒體、葉綠體4 4、模板、模板DNA母鏈母鏈1 1、概念、概念由一個(gè)由一個(gè)DNA形成兩個(gè)完全相同的形成兩個(gè)完全相同的DNA的過程的過程. . . 5 5、原材料、原材料脫氧核苷酸脫氧核苷酸6 6、基本條件、基本條件酶、酶、ATPATP、原料、模板、原料、模板7 7、復(fù)制過程、復(fù)制過程 DNA DNA的解旋的解旋 親親代代DNADNA分子利用細(xì)胞提供的能量在解旋酶的作用分子利用細(xì)胞提

5、供的能量在解旋酶的作用下氫鍵斷裂，部分雙螺旋鏈解旋為兩條平行的雙下氫鍵斷裂，部分雙螺旋鏈解旋為兩條平行的雙鏈。鏈。. . . RNA RNA引物的合成引物的合成 以以單股單股DNADNA為模板，在引物酶的作用下合成小段的為模板，在引物酶的作用下合成小段的RNARNA引引物。物。 DNA DNA的生成的生成 以以單股的單股的DNADNA為模板，在為模板，在DNADNA聚合酶的作用下，在聚合酶的作用下，在RNARNA引物的末端由引物的末端由55端端33端合成端合成DNADNA。切掉引物生成岡崎片斷切掉引物生成岡崎片斷 在在核酸酶的作用下切掉引物。在核酸酶的作用下切掉引物。在DNADNA聚合酶的作用

6、下聚合酶的作用下將引物部位換上將引物部位換上DNADNA，此時(shí)的，此時(shí)的DNADNA片斷稱為岡崎片片斷稱為岡崎片斷。斷。. . . DNA DNA片斷的連接片斷的連接 在在DNADNA連接酶的作用下將岡崎片斷連接起來。形成連接酶的作用下將岡崎片斷連接起來。形成一條完整的新的一條完整的新的DNADNA鏈。新鏈與舊鏈構(gòu)成新的鏈。新鏈與舊鏈構(gòu)成新的DNADNA。. . . 邊解旋邊復(fù)制邊解旋邊復(fù)制( (過程）過程）8 8、復(fù)制特點(diǎn)、復(fù)制特點(diǎn)半保留復(fù)制（結(jié)果）半保留復(fù)制（結(jié)果）9 9、遵循原則、遵循原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則. . . 1010、精確復(fù)制的原因、精確復(fù)制的原因1111、復(fù)制的

7、意義、復(fù)制的意義 DNA DNA分子通過復(fù)制使遺傳信息從親代傳給了后分子通過復(fù)制使遺傳信息從親代傳給了后代，從而保持了遺傳信息的連續(xù)性代，從而保持了遺傳信息的連續(xù)性規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復(fù)制提供了精確的模板規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復(fù)制提供了精確的模板堿基互補(bǔ)配對(duì)能力保證了復(fù)制準(zhǔn)確無誤的進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)能力保證了復(fù)制準(zhǔn)確無誤的進(jìn)行. . . PCRPCR( (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）1 1、 DNADNA聚合酶特性聚合酶特性不能從頭合成不能從頭合成DNADNA，只能從，只能從DNADNA的的33端端開始延伸開始延伸DNADNA鏈，因此，鏈，因此， DNADNA復(fù)制復(fù)制需要需要引物。引物。2 2、

8、DNADNA聚合酶作用過程聚合酶作用過程當(dāng)引物與當(dāng)引物與DNADNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后， DNADNA聚合酶就能從引物的聚合酶就能從引物的33端開始延伸端開始延伸DNADNA鏈，鏈，DNADNA的的合成方向總是從子鏈的合成方向總是從子鏈的55端向端向33端端延伸延伸。. . . 3 3、 PCRPCR原理原理在在8080100100C C的溫度范圍內(nèi)，的溫度范圍內(nèi)， DNADNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個(gè)過程稱為變解體，雙鏈分開，這個(gè)過程稱為變性。性。當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNADNA鏈又會(huì)重鏈

9、又會(huì)重新結(jié)合成雙新結(jié)合成雙鏈。鏈。 PCR PCR利用了利用了DNADNA的熱變性原理，通過控制溫度來控的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的PCRPCR儀實(shí)質(zhì)上也是儀實(shí)質(zhì)上也是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。器。. . . 高高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導(dǎo)致溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導(dǎo)致DNADNA聚合酶失活的問題，耐高溫的聚合酶失活的問題，耐高溫的TaqTaq DNA DNA聚合酶解決聚合酶解決了高溫導(dǎo)致了高溫導(dǎo)致DNADNA聚合酶失活的問題，促成了聚合酶失活的問題，促成了PCRPCR技術(shù)技術(shù)的自動(dòng)的自動(dòng)化

10、。化。4 4、 TaqTaq DNA DNA聚合酶的應(yīng)用聚合酶的應(yīng)用5 5、 緩沖液需要為緩沖液需要為PCRPCR反應(yīng)提供的物質(zhì)反應(yīng)提供的物質(zhì) DNA DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的四種脫氧核苷酸，耐熱的DNADNA聚合酶，同時(shí)通過控制聚合酶，同時(shí)通過控制溫度使溫度使DNADNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。行。. . . PCR PCR技術(shù)是技術(shù)是8080年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。術(shù)。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、快速、 簡(jiǎn)便、簡(jiǎn)便、重

11、復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出 6 6、 PCRPCR技術(shù)的特點(diǎn)技術(shù)的特點(diǎn)7 7、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外DNADNA復(fù)制環(huán)境的區(qū)別復(fù)制環(huán)境的區(qū)別體內(nèi)體內(nèi)DNADNA的復(fù)制的復(fù)制體外的模擬體外的模擬模板（母鏈）模板（母鏈）細(xì)胞內(nèi)源細(xì)胞內(nèi)源外源加入外源加入引物引物引物合成酶引物合成酶外源加入外源加入底物底物dNTPdNTP細(xì)胞內(nèi)源細(xì)胞內(nèi)源外源加入外源加入聚合酶聚合酶細(xì)胞內(nèi)源細(xì)胞內(nèi)源外源加入外源加入反應(yīng)環(huán)境反應(yīng)環(huán)境細(xì)胞內(nèi)環(huán)境細(xì)胞內(nèi)環(huán)境緩沖液緩沖液. . . PCR PCR過程需要的引物不是過程需要的引物不是RNARNA，而是人工合成的，而是人工合成的DNADNA單鏈，其長(zhǎng)度通

12、常為單鏈，其長(zhǎng)度通常為20203030個(gè)脫氧核苷酸個(gè)脫氧核苷酸8 8、細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和、細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和PCRPCR不同點(diǎn)不同點(diǎn) PCR PCR過程中過程中DNADNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過的解旋不依靠解旋酶，而是通過對(duì)反應(yīng)溫度的控制來實(shí)現(xiàn)的對(duì)反應(yīng)溫度的控制來實(shí)現(xiàn)的. . . PCRPCR的反應(yīng)過程的反應(yīng)過程1 1、PCRPCR的反應(yīng)步驟的反應(yīng)步驟 PCR PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個(gè)基本步驟個(gè)基本步驟變性、復(fù)性和延變性、復(fù)性和延伸伸. .變性（模板變性（模板DNADNA解旋）解旋） 模模板板DNADNA經(jīng)加熱至經(jīng)加熱至94940 0C

13、 C。一定時(shí)間后，使模板。一定時(shí)間后，使模板DNADNA雙雙鏈或經(jīng)鏈或經(jīng)PCRPCR擴(kuò)增形成的雙鏈擴(kuò)增形成的雙鏈DNADNA解離，使成為單鏈，以解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。準(zhǔn)備。2 2、循環(huán)過程、循環(huán)過程. . . PCR PCR 循環(huán)第一步循環(huán)第一步 ：加熱變性：加熱變性. . . 復(fù)性（退火）復(fù)性（退火） 模模板板DNADNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到50500 0C C左右，左右，引物與模板引物與模板DNADNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。合。. . . PCR PCR 循環(huán)第二步循環(huán)

14、第二步 ：引物與靶序列退火：引物與靶序列退火. . . 延伸延伸 DNA DNA模板引物結(jié)合物在模板引物結(jié)合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的作用下以聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的的原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的DNADNA鏈。鏈。. . . PCR PCR 循環(huán)第三步循環(huán)第三步 ：引物延伸：引物延伸. . . 第第1 1個(gè)個(gè) PCR PCR 循環(huán)完成后循環(huán)完成后 ：得到兩個(gè)拷貝：得到兩個(gè)拷貝的靶序列的靶序列. . . 循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)DNADNA數(shù)量數(shù)量1 12 22

15、24 43 38 820201,048,5761,048,57630301,073,741,8241,073,741,8243 3、3030次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量. . . 4 4、PCR PCR 循環(huán)的結(jié)果循環(huán)的結(jié)果 DNA DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNADNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)擴(kuò)序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。增。從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物板參與反應(yīng)，并且由引物延伸而成的延伸而成的DNADNA單鏈會(huì)與單鏈

16、會(huì)與引物引物結(jié)合，進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)行DNADNA的延的延伸。伸。. . . PCR PCR 的實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)驗(yàn)操作1 1、PCRPCR儀儀（一）設(shè)備及用具（一）設(shè)備及用具實(shí)質(zhì)上一臺(tái)能夠?qū)嵸|(zhì)上一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器的儀器2 2、微量離心管、微量離心管一種一種薄壁塑料管薄壁塑料管，總?cè)莘e為，總?cè)莘e為0.5ml0.5ml3 3、微量移液器、微量移液器用于用于定量轉(zhuǎn)移定量轉(zhuǎn)移PCRPCR配方中的配方中的液體，液體，其上的一次其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次性吸液槍頭用一次更換一次. . . PCRPCR儀儀. . . 1 1、準(zhǔn)備、準(zhǔn)備2 2、移液、移液（二）實(shí)驗(yàn)操作步驟（二）實(shí)驗(yàn)操作步驟

17、按照按照PCRPCR反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放在實(shí)反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌驗(yàn)桌上上. .用微量移液器按照用微量移液器按照PCRPCR反應(yīng)體系配方往微量離心反應(yīng)體系配方往微量離心管里面加入各種試管里面加入各種試劑劑. . . . 過程：蓋嚴(yán)微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈過程：蓋嚴(yán)微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁擊管壁注注意意: :3 3、混合、混合B B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應(yīng)液混合均勻應(yīng)液混合均勻A A、離心管口的蓋子一定蓋嚴(yán)，防止實(shí)驗(yàn)中脫落或、離心管口的蓋子一定蓋嚴(yán)，防止實(shí)驗(yàn)中脫落或液體外溢液體外溢.

18、 . . 將離心管放入將離心管放入PCRPCR儀上，設(shè)置好儀上，設(shè)置好PCRPCR儀的循環(huán)程儀的循環(huán)程序序. .過程：將微量離心管放在離心機(jī)上過程：將微量離心管放在離心機(jī)上, ,離心約離心約10s.10s.4 4、離心、離心5 5、反應(yīng)、反應(yīng)離心目的：使反應(yīng)液體集中在離心管底部，提高離心目的：使反應(yīng)液體集中在離心管底部，提高反應(yīng)效反應(yīng)效果果. . . . 循環(huán)數(shù)循環(huán)數(shù)變性變性復(fù)性復(fù)性延伸延伸第一次第一次9494C C，10min10min3030次次44，30s30s5555，30s30s7272，1min1min最后一次最后一次44，1min1min5555，30s30s7272，1min1min. . . PCR PCR技術(shù)技術(shù)高度靈敏，高度靈敏，為了避免外源為了避免外源DNADNA等因素的污染而等因素的污染而造成干擾實(shí)驗(yàn)，造成干擾實(shí)驗(yàn)，PCRPCR操作時(shí)要注意做到：操作時(shí)要注意做到：隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進(jìn)行高壓滅菌；蒸餾水等在使用必須進(jìn)行高壓滅菌；分裝試劑，簡(jiǎn)化操作程序，使用一次性槍頭分裝試劑，簡(jiǎn)化操作程序，使用一次性槍頭. . . 1.標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程一般分為變性、復(fù)性、延伸三大步，這三大步需要的溫度依次是() A92、