麥麩為基質(zhì)的紅曲霉抗氧化活性研究石峰

1、 麥麩為基質(zhì)的紅曲霉抗氧化活性研究 浙江工業(yè)大學(xué) 石峰 藥學(xué)院摘要：紅曲是我國的傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品，是以大米為原料，經(jīng)紅曲菌繁殖后生成的一種紫紅色米曲。培養(yǎng)紅曲霉，接種到麥麩，大米上，麥麩分別取培養(yǎng)時間位7天，10天，12天，15天17天 ，20天冷凍保存，大米取培養(yǎng)時間20天保存，然后所有樣品經(jīng)烘干保存。用ABTS法，DPPH等法測定紅曲麥麩和紅曲大米的抗氧化性并作比較。關(guān)鍵詞：紅曲霉，麥麩，抗氧化活性，多酚1 前言氧自由基（ROS）是很多疾病的發(fā)病原因之一，如癌癥，動脈粥樣硬化，糖尿病，帕金森癥等。正常情況下，體內(nèi)ROS不斷產(chǎn)生，也不斷被抗氧化系統(tǒng)清除，從而達到一種動態(tài)平衡。但是，當人體內(nèi)的自由

2、基產(chǎn)生過多或清除過慢，就會攻擊各種細胞、器官使之受到損傷，加速集體的衰老過程并誘發(fā)各種疾病1。外源性抗氧化劑能夠加強淬滅自由基，減緩氧化損傷的累計速率。一般的活性氧自由基主要是朝陽陰離子自由基（O2-）、羥自由基（·OH）、過氧自由基（ROO·）、一氧化氮分子自由基（NO·）等2。紅曲是我國的傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品，古代又叫赤曲或丹曲3，作為傳統(tǒng)中藥，紅曲具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗菌消炎等功能。紅曲的代謝產(chǎn)物主要有紅曲色素、莫納可林（MonacolinK，MK）、-氨基丁酸（GABA）、抗氧化活性物質(zhì)、降血壓物質(zhì)等。Yoko Aniya在1999年從Anka紅曲米提取到

3、了Dimerumic acid， 并發(fā)現(xiàn)Dimerumic acid可以清楚DPPH，活性羥基和超氧化物陰離子，具有較強的抗氧化活性，以及在對老鼠的活體實驗中表明了其保護肝臟的能力4。Junsei Taira用Anka紅曲得到DImerumic acid，發(fā)現(xiàn)Dimerumic acid在低濃度就有很明顯的抗氧化活性效果5。酚類化合物由于其羥基取代的高反應(yīng)性和吞噬自由基的能力而有很好的抗氧化活性。Feng等人將薏米為底物的紫色紅曲發(fā)酵產(chǎn)物用甲醇來提取，得到具有出色抗氧化活性的酚類6。Yang等人將大米為底物的紫色紅曲發(fā)酵產(chǎn)物用甲醇提取，同樣得到酚類7。Lee等人以大豆為底物發(fā)酵紅曲，得到的產(chǎn)物

4、用水提取，主要的抗氧化物質(zhì)同樣是酚類8。屈炯等對紅曲色素的抗氧化活力進行研究，發(fā)現(xiàn)紅曲色素在·OH、O2·和DPPH·體系這三種抗氧化模型中表現(xiàn)出了較高的抗氧化活性。其清除率比同濃度的VC分別高20%、41%和34%9。小麥麩皮是制粉過程中提取小麥粉和胚芽后的殘留部分。小麥麥麩中含有多種生理活性物質(zhì)，如亞油酸、維生素E、多糖、低聚糖、酚類化合物。其中麩皮豐富的多酚類物質(zhì)，其含量大約為小麥的40倍，而多酚物質(zhì)主要存在于小麥麩皮中10。江生在堿性條件下測定小麥麩皮醇提取物中的總酚含量和總黃酮含量，分別為31.39±0.03（mg/g）和14.96±

5、0.04（mg/g），同時，采用紫外分光光度法、鄰二氮菲法和鄰苯三酚自氧法研究了小麥麩皮三種提取物（醚提物、醇提物、水提物）對三種常見自由基（DPPH、OH、O2）的清除作用，發(fā)現(xiàn)小麥麩皮三種提取物對于三種自由基均有清除作用11。近年來，小麥的年產(chǎn)量已經(jīng)超過1億噸，每年加工出小麥麩皮可達2000萬噸，但大多沒有進行深加工和再利用。如果能充分利用麩皮進行深加工和綜合利用，將具有很高的經(jīng)濟效益和社會效益12。2 背景在以往的研究中，大部分紅曲霉都是以大米作為發(fā)酵基質(zhì)，而本文使用麥麩作為發(fā)酵基質(zhì)，一個在于其價格低廉，可以充分利用以往被忽視的麥麩的價值，另一個在于麥麩本身含有豐富的抗氧化活性物質(zhì)，以其

6、為基質(zhì)的紅曲霉可能比傳統(tǒng)的紅曲米的抗氧化活性高。酚酸是酚類物質(zhì)的一類植物源酚酸通常以游離和束縛的形式存在且絕大多數(shù)以束縛型的酚酸的形式存在。束縛的酚酸通常以酯鍵、醚鍵與許多化合物結(jié)合在一起13，紅曲霉在其生長代謝的過程中也可能會將一部分束縛型酚酸變?yōu)橛坞x型酚酸。到目前為止，已有很多方法，如各種溶劑：水，乙醇，甲醇，丙酮單獨或組合使用來提高提取率，但是谷物的總抗氧化能力可能由于其中的酚類化合物被束縛因此被嚴重低估14。而且，目前用于體外測定物質(zhì)抗氧化能力的方法有比色法，化學(xué)發(fā)光法，熒光法，點子自旋共振法（ESR）等，但大多數(shù)是針對物質(zhì)清楚某一種自由基而言，并不能反映出其總的抗氧化能力，鑒于物質(zhì)在

7、肌體內(nèi)起作用的正是其總的抗氧化能力，因此，用總的抗氧化能力（total antioxidant activity，TAA）來評價物質(zhì)的抗氧化能力是很有必要的。ABTS法本質(zhì)上是一種間接的方法，是用來檢測物質(zhì)清楚ABTS自由基的能力，與真實的氧化分解沒有關(guān)系，并不是直接反應(yīng)被檢物質(zhì)的活力，所以要想較全面的判斷一種物質(zhì)的抗氧化能力還要結(jié)合其他的方法，如DPPH法。15在本文中，將首先使用ABTS法對其總抗氧化活性進行評測。之后再對其抗氧化活性成分進行分析檢測。目前，對于紅曲霉的研究多數(shù)是基于大米為基質(zhì)的紅曲米，且大多是研究洛伐他汀、-氨基丁酸、紅曲色素。對于麥麩為基質(zhì)的紅曲霉的抗氧化活性以及其活性

8、物質(zhì)多酚、黃酮的文獻比較少見。2 材料、儀器與方法2.1研究材料麥麩 紅曲霉菌種 普通大米 2.2 實驗儀器培養(yǎng)基 錐形瓶 試管 搖床 恒溫箱 紫外分光光度計 超凈臺 離心機2.3 試驗方法2.3.1 紅曲霉的固態(tài)發(fā)酵1.接種PDA培養(yǎng)基，配方為：土豆40g 葡萄糖4g 瓊脂4g 水200ml，在恒溫箱中生長7d2 .接種液體培養(yǎng)基，配方為：葡萄糖3g NaNO2 0.2g 蛋白胨1g MgSO4 0.1g， 在搖床中培養(yǎng)2d3 .接種固態(tài)培養(yǎng)基，稱取15g麥麩至50ml12個錐形瓶（料厚3-4cm），加15mlH2O 加0.2%（0.03ml）乙酸，混勻。稱取20g大米（經(jīng)過水泡）對照 加1

9、0mlH2O（注意：20g大米與15g麥麩等厚。大米中水于米為1比3 ，即 20g 大米中已含水5g 大米15g。）充分冷卻后，接種液體培養(yǎng)基（10%）1.5ml將接種好的培養(yǎng)基錐形瓶放置與恒溫培養(yǎng)箱中，麥麩培養(yǎng)時間分別為7d 10d 12d 15d 17d 20d，大米培養(yǎng)時間20d ，每個時間段的紅曲霉培養(yǎng)三組。4.把各個時間段的發(fā)酵產(chǎn)物烘干，用打碎機打碎，冰箱保存。2.3.2 ABTS法測定抗氧化活性ABTS制備：將7.4mmol/L的ABTS和2.6mmol/L的K2S2O8（過硫酸鉀）各0.2ml混合，于室溫避光的條件下反應(yīng)12h，用PH為7.4的磷酸鹽緩沖液或乙醇稀釋40-50倍，

10、要求在734nm下，吸光度為0.70±0.02，取合適重量如10mg的紅曲麥麩與5ml的ABTS溶液混合，離心，反應(yīng)6min，測定734nm下吸光度。Trolox標準液（0.3 mmol/L，9.6ml）：取Trolox 1mg， 加蒸餾水9.6ml。使標準曲線吸光值在0.2-0.8之間，得到清除率y與trolox含量（x）之間的回歸方程 公式： 清除率=（A0-A）/A0*100% （A0 為未加樣品的ABTS液吸光值，A為樣品與ABTS液反應(yīng)后的吸光值）ABTS法最先由Mille等人開創(chuàng)，用于測定生物樣品的抗氧化能力。該方法是以ABTS（2, 2'-聯(lián)氮一雙一(3一乙基苯

11、并噻唑啉-6-磺酸)，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。這種水溶性的自由基引發(fā)劑為顯色劑。ABTS經(jīng)活性氧氧化后生成穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基ABTS+，向其中加入被測物質(zhì)，如果該物質(zhì)中存在抗氧化成分，則該物質(zhì)會與ABTS+發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色，然后在ABTS+這種自由基的最大吸光波長下(一般選擇734nm)檢測吸光度的變化，與含trolox即6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫毗喃-2-羧酸)，一種類似于VE的水溶性物質(zhì)的對照標準體系比較，換算出被測物質(zhì)總的抗氧化能力，結(jié)果多表示為達到一定濃度測試物質(zhì)相當?shù)目寡趸芰λ枰腡rolox的濃度，所以也把該方法稱為TEAC法16。2.3.3 DPPH法測

12、定抗氧化活性取樣品提取物用DMSO溶解，配置成2mg/mL的母液。DPPH用無水乙醇配制成0.1mmol/L，置于棕色瓶中備用。于試管中分別加入2.5ml的0.1mmol/L的DPPH，0.5ml不同質(zhì)量濃度（10,20,40,60,80,100 g/ml）的樣品溶液，2ml蒸餾水，混勻。反應(yīng)30min，于517nm波長處檢測樣品吸光度（A0）；取0.5mlDMSO代替樣品溶液測得空白吸光度（AJ）；每個檢測做3個重復(fù)，取其平均值。清除率計算公式如下：清除率=（A0-Aj）/A0*100% 其原理為：二苯代苦味?；杂苫?DPPH·)是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若受試物能清除它

13、，則表示受試物具有降低經(jīng)自由基、烷自由基或過氧自由基等自由基的有效濃度，打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的作用。DPPH·有個單電子，光譜掃描顯示在517nm處有強吸收，其乙醇水溶液呈深紫色，加入受試物后，通過在517nm測定其清除DPPH自由基而引起吸光度減少的情況可以反映受試物的抗氧化活性，計算其清除自由基的能力2.3.4 多酚含量的測定樣品用同體積70%的甲醇、乙醇及丙酮溶液在40下過夜振蕩提取(100r/min)。提取后抽慮得濾液，濾液濃縮除去有機溶劑后用蒸餾水定容，取定量的溶液測定其中的總酚含量。取300L提取液補水至1mL，加入1ml福林酚制劑（0.2mol/L），混合均勻，再加入3

14、mL 15%的碳酸鈉溶液。避光反應(yīng)2h，在760nm處測定吸光值。 采用FC試劑法測定總多酚，其原理是在堿溶液中，酚類化合物可以將鎢鑰酸還原(W6+變成W5+生成藍色化合物，化合物的顏色和多酚的含量正相關(guān)，此藍色化合物的最大吸收波長為760nm。3.結(jié)果與分析3.1 ABTS法測抗氧化活性用個各時間段紅曲麥麩與20天的紅曲米1mg與6mlABTS溶液（50%乙醇稀釋）反應(yīng)并在734nm下的測吸光度，做3組平行試驗取平均值，ABTS溶液吸光度A0為0.637。各時間段平均吸光度表1和抑制率與培養(yǎng)時間的關(guān)系圖1 培養(yǎng)天數(shù)組號7101215172020米10.041 0.094 0.369 0.13

15、6 0.173 0.113 0.018 20.422 0.172 0.148 0.131 0.160 0.076 0.025 30.138 0.168 0.142 0.167 0.173 0.067 0.026 平均0.200 0.145 0.220 0.145 0.169 0.085 0.023 表格 1用1.5ml80%丙酮提取各時間段的麥麩和大米30mg，進行離心，取上30ml清液與6mlABTS溶液（50%乙醇稀釋）反應(yīng)并在734nm下的測吸光度，做3組平行試驗取平均值，測得ABTS溶液吸光度A0為0.342得到各時間段平均吸光度表2和培養(yǎng)時間的關(guān)系圖2 表格 2培養(yǎng)天數(shù) 組別7101

16、215172020（米）10.015 0.086 0.082 0.136 0.132 0.095 -0.006 20.095 0.105 0.101 0.140 0.132 0.126 -0.006 30.117 0.077 0.084 0.136 0.147 0.120 -0.006 平均0.076 0.089 0.089 0.137 0.137 0.114 -0.006 直接用ABTS溶液與樣品反應(yīng)，從圖1得知隨著培養(yǎng)時間變長清除率線性關(guān)系成正相關(guān)，即隨著培養(yǎng)時間增大，紅曲麥麩的抗氧化性在變強，20天的紅曲大米的抗氧化活性比20天的紅曲麥麩抗氧化活性強。樣品的提取液與ABTS溶液反應(yīng)，從圖

17、2得知隨著培養(yǎng)時間增長，清除率在變?nèi)?，即紅曲麥麩的抗氧化活性在變?nèi)酰?0天的紅曲大米清除率與圖一里的并沒太大變化。圖1與圖2中紅曲麥麩的抗氧化活性測量的結(jié)果差異這么大的猜想原因可能是：隨著紅曲霉的生長產(chǎn)生了某種抗氧化活性很高的物質(zhì)，但是這種物質(zhì)用丙酮卻并不能提取出來(接來我們會去嘗試驗證這一猜想，并提取出這種物質(zhì)）。3.2 DPPH法測抗氧化活性在黑暗條件下，各時間段樣品與DPPH溶液反應(yīng)30分鐘，在517nm下測得吸光度，平行做三組實驗，取平均值，測DPPH的吸光度A0為0.875。各個時間段的平均吸光度表3和DPPH自由基清除率與培養(yǎng)時間的關(guān)系圖3 表格 3 培養(yǎng)天數(shù)組號71012151

18、72020（大米）10.643 0.5880.502 0.451 0.4210.3880.37420.649 0.576 0.4960.446 0.429 0.3860.37230.632 0.581 0.4970.4420.420 0.3940.369平均0.641 0.582 0.498 0.443 0.423 0.3890.372從圖3得知隨著培養(yǎng)時間的增長，紅曲麥麩的清除率增大，即紅曲麥麩的抗氧化活性增強。20天的紅曲大米抗氧化活性比20天的紅曲麥麩抗氧化活性大。3.3 多酚含量的測定300L提取液+700L蒸餾水+1ml福林酚試劑（反應(yīng)3分鐘后）+3mL2%Na2CO3避光反應(yīng)2h，

19、在760nm下測吸光度，平行做3組，取平均值。數(shù)據(jù)如表4，吸光值和培養(yǎng)天數(shù)的關(guān)系如下圖 表格 4 培養(yǎng)天數(shù)組號7101215172020（米）10.363 0.327 0.383 0.341 0.291 0.365 0.750 20.321 0.348 0.400 0.335 0.298 0.377 0.757 30.345 0.371 0.383 0.340 0.281 0.359 0.741 平均0.343 0.349 0.389 0.339 0.290 0.367 0.749 由圖得知在培養(yǎng)7天至20天的時間里紅曲麥麩中的多酚含量幾乎處于穩(wěn)定狀態(tài)。20天的紅曲米中多酚含量比紅曲麥麩中含量

20、多。4. 討論與不足本實驗測量了生長各個階段的紅曲大米的抗氧化活性和20天的紅曲大米的抗氧化活性，得出了隨著紅曲霉的生長使麥麩的里抗氧化物質(zhì)增多，抗氧化活性增強。20天的紅曲大米也比同時間的紅曲麥麩抗氧化活性強。但是相對大米與麥麩的成本價，從經(jīng)濟角度我認為如果要大規(guī)模提取這些抗氧化活性物質(zhì)，可以考慮從麥麩中提。因為時間不足和實驗室一些儀器試劑不全等方面的現(xiàn)實原因，本實驗有很多不足，原計劃還打算測樣品黃酮含量，樣品的總生物量和一些標準曲線。因為前期實驗室缺少過程中某些關(guān)鍵的試劑，實驗起步很晚，導(dǎo)致實驗進程很慢，未能完成預(yù)定目標。參考文獻1伍鍵萍.紅曲霉發(fā)酵多糖條件及抗氧化活性的初步研究D.天津科

21、技大學(xué),20122王福海,黃成華.活性氧自由基的研究進展J.廣州化工.2013(16)3溫學(xué)偉.紅曲抗氧化的研究進展J.食品工業(yè)科技.2011(02)4Yoko Aniya, Ikuko I Ohtani, Tatsuo Higa,et al.Dimerumic acid as an antioxidant of the mold Monascus AnkaJ.Free Radical Biology & Medicine,1999,28(6): 999-10045Junsei Taira, Chika Miyagi, Yoko Aniya. Dimerumic acid&#

22、160;as an antioxidant from the mold, Monascus anka: the inhibition mechanisms against lipid peroxidation and hemeprotein-mediated oxidationJ. Biochemical Pharmacology,2002,63:1019- 10266Yu-Hsiu Tseng, Joan-Hwa Yang, Hui-Ling Chang, et al. Antioxidant properties of methanolic extr

23、acts from monascal adlay J. Food Chemistry,2006, 97: 375-3817Joan-Hwa Yang, Yu-Hsiu Tseng, Yu-Ling Lee, et al. Antioxidant properties of methanolic extracts from monascal riceJ.Swiss Society of Food Science and Technology,2006,39:740-7478Yu-Ling Lee, Joan-Hwa Yang Jeng-Leun Mau, Antioxidant properties of water extracts from Monascus fermented soybeansJ.Food Chemistry,2008,106:112