垂直板聚丙烯酰胺凝膠連續(xù)電泳分離乳酸脫氫酶同工酶

1、1實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 關(guān)于垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳 關(guān)于連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng) 關(guān)于乳酸脫氫酶同工酶及酶活性染色2垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳 電泳 帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下，向著與其電性相反的電極方向移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱之為電泳。 聚丙烯酰胺凝膠 是由單體丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑過硫酸銨(AP)和加速劑N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，通過改變凝膠濃度及交聯(lián)度來調(diào)節(jié)凝膠的孔徑，具有良好的分子篩效應(yīng)。它已成為目前生化實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)。以它為支持物發(fā)展起來的各種聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，不僅

2、能分離、小量制備生物大分子，而且可以用來研究生物大分子的性質(zhì)如電荷、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)以及構(gòu)象等。 垂直板電泳 將配制好的凝膠溶液注入到兩塊垂直放置的玻璃板之間聚膠，然后加樣進(jìn)行電泳。 3AP-TMTEDAP-TMTED催化體系催化體系 TEMED催化AP生成硫酸自由基：S2O82 2SO4 硫酸自由基的氧原子激活A(yù)cr單體并形成單體長(zhǎng)鏈： Bis將單體長(zhǎng)鏈間連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)： 45 化學(xué)聚合的凝膠孔徑較小，常用于制備分離膠，重復(fù)性好。聚化學(xué)聚合的凝膠孔徑較小，常用于制備分離膠，重復(fù)性好。聚合反應(yīng)受各種因素的影響：合反應(yīng)受各種因素的影響： 催化劑和加速劑的濃度催化劑和加速劑的濃度 應(yīng)選擇合適的應(yīng)

3、選擇合適的AP和和TEMED濃度使聚合濃度使聚合時(shí)間控制在時(shí)間控制在3060min內(nèi)較好，過量的催化劑和加速劑會(huì)引起燒膠內(nèi)較好，過量的催化劑和加速劑會(huì)引起燒膠和蛋白質(zhì)條帶的畸變。和蛋白質(zhì)條帶的畸變。 pH TEMED只能以游離堿的形式發(fā)揮作用，在酸性條件下，叔只能以游離堿的形式發(fā)揮作用，在酸性條件下，叔胺缺少自由堿基，引發(fā)胺缺少自由堿基，引發(fā)AP產(chǎn)生自由基的過程會(huì)被延遲，聚合時(shí)間產(chǎn)生自由基的過程會(huì)被延遲，聚合時(shí)間延長(zhǎng)。延長(zhǎng)。 溫度溫度 聚合速度與溫度有關(guān)，一般是高溫聚合快，而聚合的速度聚合速度與溫度有關(guān)，一般是高溫聚合快，而聚合的速度影響交聯(lián)孔徑的大小，所以凝膠聚合時(shí)必須保持溫度恒定，通常用影

4、響交聯(lián)孔徑的大小，所以凝膠聚合時(shí)必須保持溫度恒定，通常用與電泳相同的溫度。與電泳相同的溫度。 分子氧分子氧 分子氧的存在會(huì)阻止碳鏈的延長(zhǎng)，妨礙聚合作用，在聚分子氧的存在會(huì)阻止碳鏈的延長(zhǎng)，妨礙聚合作用，在聚合過程中要盡量避免接觸空氣。合過程中要盡量避免接觸空氣。 雜質(zhì)雜質(zhì) 某些金屬離子或其它雜質(zhì)也會(huì)影響凝膠的化學(xué)聚合，所以某些金屬離子或其它雜質(zhì)也會(huì)影響凝膠的化學(xué)聚合，所以應(yīng)選擇高純度的應(yīng)選擇高純度的Acr、Bis和和AP。6 凝膠總濃度及交聯(lián)度對(duì)凝膠的影響凝膠總濃度及交聯(lián)度對(duì)凝膠的影響 凝膠溶液中單體和交聯(lián)劑的總濃度和兩者的比例是決定聚丙烯酰胺凝膠特性包括其機(jī)械性能、彈性、透明度、粘著度及孔徑大

5、小的主要因素。T為凝膠溶液中單體和交聯(lián)劑的總質(zhì)量濃度，C為凝膠溶液中交聯(lián)劑占單體和交聯(lián)劑總量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。 式中，a為丙烯酰胺單體的質(zhì)量(g)，b為交聯(lián)劑的質(zhì)量(g)，m為溶液的終體積(mL)。 凝膠a、b的比例決定了凝膠的物理性狀。當(dāng)a:b小于10時(shí)，凝膠脆且硬，不透明，呈乳白色；當(dāng)a:b大于100時(shí)，即使用5%的丙烯酰胺凝膠也呈糊狀；通常用a:b在30左右，并且丙烯酰胺濃度高于3%，凝膠富有彈性并且透明。 %100 mbaT%100 babC7 凝膠的總質(zhì)量濃度凝膠的總質(zhì)量濃度T和交聯(lián)度和交聯(lián)度C決定凝膠的有效決定凝膠的有效孔徑。凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有分子篩效應(yīng)，不同孔徑。凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

6、具有分子篩效應(yīng)，不同大小和形狀的大分子通過孔徑時(shí)所受的阻滯力不同，大小和形狀的大分子通過孔徑時(shí)所受的阻滯力不同，加上大分子的電荷效應(yīng)，使各種大分子遷移率不同加上大分子的電荷效應(yīng)，使各種大分子遷移率不同得以分離。在實(shí)際工作中，常依據(jù)待分離蛋白質(zhì)已得以分離。在實(shí)際工作中，常依據(jù)待分離蛋白質(zhì)已知相對(duì)分子質(zhì)量的大小來選擇所合適的凝膠濃度，知相對(duì)分子質(zhì)量的大小來選擇所合適的凝膠濃度，使蛋白質(zhì)混合物得到最大限度的分離，大多數(shù)蛋白使蛋白質(zhì)混合物得到最大限度的分離，大多數(shù)蛋白質(zhì)在質(zhì)在7.5%凝膠中能得到滿意的結(jié)果，所以這個(gè)濃度凝膠中能得到滿意的結(jié)果，所以這個(gè)濃度的凝膠稱為的凝膠稱為標(biāo)準(zhǔn)膠標(biāo)準(zhǔn)膠。當(dāng)分析一個(gè)未知

7、樣品時(shí)，常用。當(dāng)分析一個(gè)未知樣品時(shí)，常用標(biāo)準(zhǔn)膠或梯度凝膠來測(cè)試，而后確定適宜的凝膠濃標(biāo)準(zhǔn)膠或梯度凝膠來測(cè)試，而后確定適宜的凝膠濃度。度。 8凈電荷聚丙烯酰胺凝膠電泳凈電荷聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)的原理分離蛋白質(zhì)的原理 凈電荷聚丙烯酰胺凝膠電泳是對(duì)天然狀態(tài)生物大分子進(jìn)行的電泳，目的是為了保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象、其亞基之間的相互作用及其生物學(xué)活性。利用蛋白質(zhì)分子中所帶凈電荷、分子質(zhì)量、形狀的差異，在電場(chǎng)中泳動(dòng)的速度和方向不同，從而達(dá)到分離的目的。多數(shù)蛋白質(zhì)的pI在中性偏酸性范圍，通常是將樣品在堿性緩沖系統(tǒng)中進(jìn)行電泳，蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷，以不同速度向陽極遷移，稱為陽極電泳；對(duì)于一些堿性蛋白，使用酸

8、性緩沖系統(tǒng)進(jìn)行電泳，蛋白質(zhì)分子帶正電荷而向陰極遷移，稱為陰極電泳。9蛋白質(zhì)在凈電荷聚丙烯酰胺凝膠蛋白質(zhì)在凈電荷聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分離因素電泳中的分離因素 電荷因素 蛋白質(zhì)分子形狀和大小相同，所帶電荷性質(zhì)和數(shù)量不同 分子大小 蛋白質(zhì)分子形狀和所帶電荷性質(zhì)和數(shù)量相同，分子大小不同 分子形狀 蛋白質(zhì)分子所帶電荷性質(zhì)和數(shù)量相同，分子形狀不同電荷因素分子大小分子形狀10聚丙烯酰胺凝膠電泳的類型聚丙烯酰胺凝膠電泳的類型 連續(xù)系統(tǒng) 是指電泳系統(tǒng)采用相同孔徑的凝膠、緩沖系統(tǒng)等條件下進(jìn)行區(qū)帶電泳，是利用蛋白質(zhì)分子的電荷效應(yīng)進(jìn)行分離，凝膠的分子篩效應(yīng)不明顯，一般只用于分離一些比較簡(jiǎn)單的樣品，缺點(diǎn)是分辨率不高。

9、優(yōu)點(diǎn)是制膠簡(jiǎn)單快捷，緩沖系統(tǒng)的pH恒定，可以防止樣品進(jìn)膠后因pH變化發(fā)生凝聚和沉淀，緩沖系統(tǒng)組成簡(jiǎn)單。11 不連續(xù)系統(tǒng)不連續(xù)系統(tǒng) 是指使用不同孔徑的凝膠和不同緩是指使用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系的電泳方式，在電泳分離過程中，由于濃縮膠沖體系的電泳方式，在電泳分離過程中，由于濃縮膠的堆積作用，可使樣品在濃縮膠和分離膠的界面上先的堆積作用，可使樣品在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，對(duì)樣品進(jìn)行濃縮，然后在一定濃度或濃縮成一窄帶，對(duì)樣品進(jìn)行濃縮，然后在一定濃度或濃度梯度的凝膠上進(jìn)行分離，既存在電荷效應(yīng)，也有濃度梯度的凝膠上進(jìn)行分離，既存在電荷效應(yīng)，也有分子篩效應(yīng)。雖然制膠操作難度較大，但是它具

10、有連分子篩效應(yīng)。雖然制膠操作難度較大，但是它具有連續(xù)系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)越性，分辨率高。續(xù)系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)越性，分辨率高。 不連續(xù)電泳的不連續(xù)電泳的四個(gè)不連續(xù)性四個(gè)不連續(xù)性 凝膠濃度的不連續(xù)凝膠濃度的不連續(xù)性；緩沖液離子成分的不連續(xù)性；緩沖液性；緩沖液離子成分的不連續(xù)性；緩沖液pH梯度的不梯度的不連續(xù)性；電位梯度的不連續(xù)性連續(xù)性；電位梯度的不連續(xù)性。12關(guān)于乳酸脫氫酶關(guān)于乳酸脫氫酶 1959年Markert等用電泳的方法將純化的心肌乳酸脫氫酶(LDH)分離出5條區(qū)帶，由陽極到陰極依次命名為L(zhǎng)DH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5，它們均具有LDH催化活性，從而首先提出了同工酶的概念。目前已

11、知LDH同工酶是由H和M亞基按不同比例組成的四聚體。 LDH同工酶廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中，動(dòng)物各組織中LDH同工酶各組分含量不同。臨床上對(duì)LDH及同工酶的檢測(cè)可作為某些疾病診斷的依據(jù)之一。13乳酸脫氫酶同工酶活性染色乳酸脫氫酶同工酶活性染色 用活性染色對(duì)LDH進(jìn)行鑒定，將凝膠浸泡在活性染色液中，LDH與底物的反應(yīng)，用甲硫吩嗪(PMS)作為電子的中間載體，氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)作為最終電子受體，底物脫下的氫最后傳遞給NBT，NBT被還原后，產(chǎn)生藍(lán)紫色的不溶于水的物質(zhì)以對(duì)LDH定位。反應(yīng)式如下：14LDH4LDH3LDH5LDH1LDH2 1 2 3 4電泳結(jié)果實(shí)例電泳結(jié)果實(shí)例15電泳裝置

12、電泳裝置 采用Pharmacia公司的SE250小型夾心式垂直板電泳裝置： 制膠裝置 制備凝膠板 電泳裝置 進(jìn)行凝膠電泳 每組（2人）做一塊膠，兩組共用一套電泳裝置，兩套電泳槽共用一臺(tái)電泳儀。1617操作步驟操作步驟 一、樣品制備： 斷脊椎處死小鼠，取適量小鼠骨骼肌、肝臟、心肌和腦組織，加入5倍組織重的勻漿緩沖液，用玻璃勻漿器勻漿，離心(10 000 r /min，15 min)，吸出上清液，加入等體積40 %的蔗糖（含少許溴酚藍(lán)）混勻，放置4冰箱中備用。 18二、制備凝膠：二、制備凝膠： 凝膠模的組裝凝膠模的組裝 凝膠模由凝膠模由一塊玻璃板一塊玻璃板、一塊凹形一塊凹形氧化鋁板氧化鋁板和和兩條

13、間隔條兩條間隔條組成，將它們按下圖組裝，四組成，將它們按下圖組裝，四周對(duì)齊，注意手指勿接觸玻璃和氧化鋁板內(nèi)側(cè)的灌膠周對(duì)齊，注意手指勿接觸玻璃和氧化鋁板內(nèi)側(cè)的灌膠面，注意間隔條的安裝。面，注意間隔條的安裝。19將凝膠模安裝在固定架上將凝膠模安裝在固定架上 將凝膠模插入固定架，將凝膠模插入固定架，使凹形氧化鋁板緊貼固定使凹形氧化鋁板緊貼固定架的背板，將固定架放在架的背板，將固定架放在一個(gè)水平玻璃板上，使凝一個(gè)水平玻璃板上，使凝膠模各部件與固定架下緣膠模各部件與固定架下緣對(duì)齊，輕輕擰緊螺絲，使對(duì)齊，輕輕擰緊螺絲，使壓條緊壓凝膠模。壓條緊壓凝膠模。背板壓條固定架橡膠墊底座凸輪20將固定架安裝在底座上將

14、固定架安裝在底座上 將固定架置于凝膠將固定架置于凝膠模底座上，螺絲朝外，模底座上，螺絲朝外，固定架兩側(cè)插入凸輪，固定架兩側(cè)插入凸輪，凸輪旋轉(zhuǎn)凸輪旋轉(zhuǎn)180o使凝膠模使凝膠模的下緣在固定架的橡膠的下緣在固定架的橡膠墊上壓緊，形成一個(gè)墊上壓緊，形成一個(gè)密密閉的夾心式凝膠模閉的夾心式凝膠模。 21 制膠制膠(T=7.5%，C=2.6%) 兩組兩組按照表中的按照表中的比例和順序在小燒杯中配制凝膠溶液，加入比例和順序在小燒杯中配制凝膠溶液，加入AP后，立即混勻，沿玻璃板后，立即混勻，沿玻璃板盡快盡快倒入玻璃板和金倒入玻璃板和金屬板縫隙中，注意不要有氣泡，當(dāng)凝膠液面距屬板縫隙中，注意不要有氣泡，當(dāng)凝膠液面

15、距短板（白金屬板）上緣短板（白金屬板）上緣0.3 cm時(shí)，立即輕輕將時(shí)，立即輕輕將樣樣品槽模板品槽模板插入凝膠溶液中，注意樣品槽中不要插入凝膠溶液中，注意樣品槽中不要有氣泡，凝膠溶液應(yīng)充滿樣品槽間隙。制膠裝有氣泡，凝膠溶液應(yīng)充滿樣品槽間隙。制膠裝置室溫垂直放置，置室溫垂直放置，3060 min聚合反應(yīng)完成。聚合反應(yīng)完成。 22制備連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠的配方（兩組） 凝膠溶液組成體積Tris-Gly緩沖液5 mL30%凝膠貯液2.5 mL重蒸水（含TEMED）2.5 mL10%AP60L 23凝膠板電泳槽本體三、準(zhǔn)備電泳：三、準(zhǔn)備電泳： 將凝膠板安裝在電泳槽本體上將凝膠板安裝在電泳槽本體上

16、 將凝膠板從制膠裝置上取下，安裝到電泳槽本體上，使凹形氧化鋁板緊貼在本體的密封橡膠封條上，用彈簧夾夾緊，在凝膠板和本體之間形成一個(gè)封閉的上液槽。24 加樣加樣 取取125mL電極緩沖液貯液，用去電極緩沖液貯液，用去離子水稀釋到離子水稀釋到250mL，加入，加入上、下緩沖液槽上、下緩沖液槽中中，注意上槽液要注意上槽液要高過凹形板高過凹形板，凝膠板與下，凝膠板與下液槽的縫隙處無氣泡。將印有樣品槽模板形液槽的縫隙處無氣泡。將印有樣品槽模板形狀的塑料片貼在玻璃板上，使其與樣品槽重狀的塑料片貼在玻璃板上，使其與樣品槽重合（加樣后電泳前將塑料片取下），小心拔合（加樣后電泳前將塑料片取下），小心拔出樣品槽模

17、板。用微量進(jìn)樣器吸取一定體積出樣品槽模板。用微量進(jìn)樣器吸取一定體積的樣品溶液，小心地將樣品加在樣品槽底部。的樣品溶液，小心地將樣品加在樣品槽底部。注意注意每種樣品使用每種樣品使用同一支進(jìn)樣器同一支進(jìn)樣器，以免樣品，以免樣品相互污染。相互污染。 25骨骼肌骨骼肌 8L 心肌心肌 5L 肝臟肝臟 3L 腦腦 10L 26四、電泳：四、電泳： 加樣后，蓋上電泳加樣后，蓋上電泳槽安全蓋，接通電源，槽安全蓋，接通電源，注意正負(fù)電極的連接，注意正負(fù)電極的連接，將電泳儀調(diào)至恒壓將電泳儀調(diào)至恒壓80 V，待指示劑全部進(jìn)入凝膠待指示劑全部進(jìn)入凝膠后，電壓提高到后，電壓提高到120 V，繼續(xù)電泳，直到溴酚藍(lán)繼續(xù)電

18、泳，直到溴酚藍(lán)前沿到達(dá)距凝膠下端約前沿到達(dá)距凝膠下端約0.5 cm時(shí)，關(guān)閉電源，時(shí)，關(guān)閉電源，停止電泳（本實(shí)驗(yàn)可將停止電泳（本實(shí)驗(yàn)可將溴酚藍(lán)走出溴酚藍(lán)走出0.5h1h后停后停止電泳）。止電泳）。電極導(dǎo)線安全蓋上液槽下液槽橡膠封條彈簧夾冷卻水口27五、活性染色，脫色，照相：五、活性染色，脫色，照相： 電泳結(jié)束后，將凝膠板取下，用薄尺子輕輕將玻電泳結(jié)束后，將凝膠板取下，用薄尺子輕輕將玻璃板和氧化鋁板撬開，在凝膠下部切角標(biāo)注凝膠方位，璃板和氧化鋁板撬開，在凝膠下部切角標(biāo)注凝膠方位，然后將帶有凝膠的板反扣過來，膠面朝下，用尺子小然后將帶有凝膠的板反扣過來，膠面朝下，用尺子小心地將凝膠的一角剝離，使凝膠

19、掉入裝有活性染色液心地將凝膠的一角剝離，使凝膠掉入裝有活性染色液的培養(yǎng)皿中。輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使凝膠完全浸泡在染的培養(yǎng)皿中。輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使凝膠完全浸泡在染色液中，放入色液中，放入37恒溫水浴中保溫，染色過程注意恒溫水浴中保溫，染色過程注意避避光光，待大多數(shù)條帶顯現(xiàn)藍(lán)紫色時(shí)除去染色液，顯色時(shí)，待大多數(shù)條帶顯現(xiàn)藍(lán)紫色時(shí)除去染色液，顯色時(shí)間一般為間一般為1530 min。加入脫色液終止酶促反應(yīng)，搖加入脫色液終止酶促反應(yīng)，搖動(dòng)動(dòng)35 min，凝膠底色脫去直至背景清亮，數(shù)碼相機(jī)凝膠底色脫去直至背景清亮，數(shù)碼相機(jī)照相。照相。 28 附：附：制干膠制干膠 用兩張玻璃紙將凝膠制成夾心式干膠，待凝膠干透后，取

20、下玻璃板即可得到平整透明的電泳干膠圖譜。凝膠玻璃板玻璃紙29其他注意事項(xiàng)其他注意事項(xiàng) 愛惜電泳裝置，輕拿輕放，玻璃板必須用海綿清洗，避免產(chǎn)生劃痕，損壞需賠償。 染色液價(jià)格昂貴，按量發(fā)放（兩塊膠30mL），隨用隨取，注意避光，如果沒有變綠仍可繼續(xù)使用，不影響染色效果。 每班請(qǐng)一位同學(xué)配制脫色液1000 mL，每?jī)山M使用50 mL（染色、脫色均為兩塊膠同時(shí)進(jìn)行）。 實(shí)驗(yàn)完成后，將電泳裝置洗凈，所用配件放回盤中，老師檢查合格后方可離開。30 凝膠的總質(zhì)量濃度凝膠的總質(zhì)量濃度T和交聯(lián)度和交聯(lián)度C決定凝膠的有效決定凝膠的有效孔徑。凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有分子篩效應(yīng)，不同孔徑。凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有分子篩效

21、應(yīng)，不同大小和形狀的大分子通過孔徑時(shí)所受的阻滯力不同，大小和形狀的大分子通過孔徑時(shí)所受的阻滯力不同，加上大分子的電荷效應(yīng)，使各種大分子遷移率不同加上大分子的電荷效應(yīng)，使各種大分子遷移率不同得以分離。在實(shí)際工作中，常依據(jù)待分離蛋白質(zhì)已得以分離。在實(shí)際工作中，常依據(jù)待分離蛋白質(zhì)已知相對(duì)分子質(zhì)量的大小來選擇所合適的凝膠濃度，知相對(duì)分子質(zhì)量的大小來選擇所合適的凝膠濃度，使蛋白質(zhì)混合物得到最大限度的分離，大多數(shù)蛋白使蛋白質(zhì)混合物得到最大限度的分離，大多數(shù)蛋白質(zhì)在質(zhì)在7.5%凝膠中能得到滿意的結(jié)果，所以這個(gè)濃度凝膠中能得到滿意的結(jié)果，所以這個(gè)濃度的凝膠稱為的凝膠稱為標(biāo)準(zhǔn)膠標(biāo)準(zhǔn)膠。當(dāng)分析一個(gè)未知樣品時(shí)，常用。當(dāng)分析一個(gè)未知樣品時(shí)，常用標(biāo)準(zhǔn)膠或梯度凝膠來測(cè)試，而后確定適宜的凝膠濃標(biāo)準(zhǔn)膠或梯度凝膠來測(cè)試，而后確定適宜的凝膠濃度。度。 31蛋白質(zhì)在凈電荷聚丙烯酰胺凝膠蛋白質(zhì)在凈電荷聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分離因素電泳