基因工程研究策略和實踐

1、基因工程研究策略和實踐基因工程研究策略和實踐基因決定性狀基因決定性狀 青霉素能產(chǎn)生青霉菌 家蠶能吐出蠶絲為人類利用定向改造基因的設想定向改造基因的設想1. 能否讓細菌“吐出”蠶絲？2. 能否讓微生物產(chǎn)生人胰島素、干擾素等昂貴藥物？經(jīng)過多年的努力，科學家于經(jīng)過多年的努力，科學家于2020世紀世紀7070年代創(chuàng)立了可以定向改造生物年代創(chuàng)立了可以定向改造生物DNADNA的技術(shù)的技術(shù)- -基因工程基因工程基因工程的概念基因工程的概念 將獲取的目的基因片段在體外與載體DNADNA通過人工剪切、連接構(gòu)成DNADNA重組體，將其導入受體細胞并使之無性繁殖（稱之為“克隆”）和表達，這種有目的的應用分子克隆技術(shù)

2、, ,人為的改造基因、改變生物的遺傳性狀的系列過程, ,總稱為基因工程?；蚬こ虅e名基因工程別名DNA重組技術(shù)重組技術(shù)操作環(huán)境操作環(huán)境生物體外生物體外操作對象操作對象基因基因操作水平操作水平DNA水平水平基本過程基本過程剪切剪切拼接拼接導入導入表達表達結(jié)果結(jié)果人類需要的基因產(chǎn)物人類需要的基因產(chǎn)物基因工程過程示意圖基因工程過程示意圖基因工程的研究策略基因工程的研究策略一、目的基因的分離一、目的基因的分離( donor DNA ) ( donor DNA ) 二、載體二、載體DNADNA及其改造及其改造(Vector DNA)(Vector DNA)三、體外三、體外DNADNA重組重組(DNA r

3、ecombination )(DNA recombination )四、重組四、重組DNADNA的轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化( Transformation)( Transformation)五、重組體的篩選鑒定與克隆擴增五、重組體的篩選鑒定與克隆擴增 ( identification & clone ( identification & clone amplification)amplification)六、目的六、目的DNADNA在受體細胞中的表達在受體細胞中的表達(gene (gene expression)expression)一、目的基因的分離一、目的基因的分離 從從cDNAcDNA

4、文庫中分離目的基因文庫中分離目的基因 從基因組從基因組DNADNA文庫中分離目的基因文庫中分離目的基因 PCRPCR擴增目的基因片段擴增目的基因片段 化學方法人工合成基因化學方法人工合成基因mRNA cDNA 雙鏈雙鏈cDNA 重組重組DNA分子分子 cDNA文庫 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 載體載體 受體菌受體菌 復制復制1.從從cDNA文庫中分離目的基因文庫中分離目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶堿水解堿水解 T T T T cDNAcDNA文庫僅包含正在表達的基因文庫僅包含正在表達的基因 不同物種、不同組織的不同物種、不同組

5、織的cDNAcDNA文庫不相同文庫不相同 基因總量少，易篩選基因總量少，易篩選組織或細胞染色體組織或細胞染色體DNA基因片斷基因片斷克隆載體克隆載體重組重組DNA分子分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶受體菌受體菌基因組基因組DNADNA文庫文庫存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所由克隆載體所攜帶的所有基因組有基因組DNADNA的集合的集合2. 2. 從基因組從基因組DNADNA文庫文庫獲取目的基因獲取目的基因包含所有遺傳信息包含所有遺傳信息構(gòu)建難度大（單拷貝基因、長片段基因）構(gòu)建難度大（單拷貝基因、長片段基因）篩選難度大篩選難度大用于研究基因在基因

6、組中的情況用于研究基因在基因組中的情況3 3、PCRPCR擴增目的基因片段擴增目的基因片段適用于克隆序列清楚的基因適用于克隆序列清楚的基因以基因組以基因組DNADNA為模板，直接進行為模板，直接進行PCRPCR擴擴增較難增較難多采用以多采用以mRNAmRNA為模板的為模板的RT-PCRRT-PCR法法PCR擴增儀4. 化學合成法獲取較短的目的基因化學合成法獲取較短的目的基因由已知氨基酸序列推測可能的由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列序列二、載體二、載體DNADNA載體載體 (Vector)載體是目的基因的運載體是目的基因的運載工具，其作用是將目的載工具，其作用是將目的基因帶入受體細胞中，并基

7、因帶入受體細胞中，并使目的基因擴增和表達。使目的基因擴增和表達。常用載體常用載體 質(zhì)粒質(zhì)粒 病毒載體病毒載體 噬菌體噬菌體 粘性質(zhì)粒粘性質(zhì)粒 / /粘粒粘粒 載體的選擇標準載體的選擇標準 有復制起點，能自主復制；有復制起點，能自主復制； 具有篩選標記，便于重組體的篩選和鑒定；具有篩選標記，便于重組體的篩選和鑒定； 具有一種或多種限制性內(nèi)切酶的單一切割位點，并在位點中插入外源基因后，不具有一種或多種限制性內(nèi)切酶的單一切割位點，并在位點中插入外源基因后，不影響其復制功能；影響其復制功能； 分子量小，以容納較大的外源分子量小，以容納較大的外源DNADNA。 表達型載體還應具有與宿主細胞相適應的啟動子

8、、增強子、加尾信號等基因表達表達型載體還應具有與宿主細胞相適應的啟動子、增強子、加尾信號等基因表達元件。元件?？寺≥d體克隆載體(cloning vector)(cloning vector)為使插入的外源為使插入的外源DNADNA序列被擴增序列被擴增而特而特意設計的載體稱為意設計的載體稱為克隆載體?？寺≥d體。表達載體表達載體(expression vector) (expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNADNA序列可序列可轉(zhuǎn)錄翻譯轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為成多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體。表達載體。載體的分類載體的分類 - - 按作用分按作用分穿梭

9、載體穿梭載體(shuttIe vector)(shuttIe vector) 又稱又稱雙功能載體雙功能載體(bifunctional vector)(bifunctional vector)。能。能在兩種不同的生物體內(nèi)復制和往來穿梭的載體在兩種不同的生物體內(nèi)復制和往來穿梭的載體。其可同時具有細菌質(zhì)粒的復制原點和真核生。其可同時具有細菌質(zhì)粒的復制原點和真核生物可識別的病毒復制原點或酵母菌的自主復制物可識別的病毒復制原點或酵母菌的自主復制序列（序列（ARSARS），它即能在），它即能在原核細胞中擴增原核細胞中擴增又能又能在在真核細胞中復制和表達真核細胞中復制和表達。主要用于原核細胞。主要用于原核細

10、胞與真核細胞之間進行基因轉(zhuǎn)移，通常是將載體與真核細胞之間進行基因轉(zhuǎn)移，通常是將載體和待克隆的真核生物和待克隆的真核生物DNADNA片段先在細菌中克隆片段先在細菌中克隆，再轉(zhuǎn)移到真核細胞中表達，并可提高外源基，再轉(zhuǎn)移到真核細胞中表達，并可提高外源基因的表達效因的表達效 率。如率。如pKSVpKSV一一1010、pJDB219pJDB219載體等載體等。載體的分類載體的分類 - - 按來源分按來源分 質(zhì)粒質(zhì)粒(plasmid vector)(plasmid vector) 病毒病毒(virus vector )(virus vector ) 噬菌體噬菌體(phage vector)(phage v

11、ector) 粘性質(zhì)粒粘性質(zhì)粒 / /粘粒粘粒(cosmid vector)(cosmid vector) 1. 質(zhì)粒載體: (1)分子量較小，在細菌中有較多的拷貝數(shù)。 (2)松馳型。 (3)具有一個以上的標志，便于篩選。 (4)具有數(shù)個或一個單一的酶切點。 天然的質(zhì)粒不能具備以上所有條件，所以實際應用的都是人工構(gòu)建的質(zhì)粒，其中最常用的是pBR322 ,pUC19.，常用的質(zhì)粒載體常用的質(zhì)粒載體pBR322pUC118/1192 2病毒載體 （1 1）整合型載體：外源基因通過這種病毒載體與宿主細胞的染色體整合，外源基因隨宿主細胞基因組的復制而擴增。（2 2）游離型載體：能夠以病毒顆粒的形式在宿

12、主內(nèi)自行復制或在輔助病毒存在下進行復制。如：腺病毒。3.3.噬菌體載體 現(xiàn)用的噬菌體載體都是在野生型基礎上改造而成的。改建之后的常用載體有兩類：插入型載體，具有一個可供外源DNADNA插入的克隆位點，只能插入較小的外源DNA片段(10kb)。如gt10gt10、gt11gt11；替換型載體，具有成對的克隆位點，在兩個位點之間的DNADNA區(qū)段可被外源插入的DNADNA片段取代，能插入較大的外源DNA片段(20-24kb左右)。如charon4charon4、charon10charon10。4. Cosmid4. Cosmid質(zhì)粒 由DNA cosDNA cos區(qū)與質(zhì)粒重組建造而成。在宿主細胞

13、中可以作為正常噬菌體進行復制，但不表達噬菌體的任何功能。 分子量?。s46kb46kb），可容納大至40-40-50kb50kb的外源DNADNA片段。適用于構(gòu)建真核細胞的基因文庫。 如 cosmid pHC79 cosmid pHC79三、體外三、體外DNADNA重組重組 概念：概念： 不同來源的不同來源的DNADNA片段片段共價連接共價連接、通過重新、通過重新組合構(gòu)成了具有兩個組合構(gòu)成了具有兩個DNADNA分子遺傳信息的新分子遺傳信息的新重組重組體體DNADNA分子的過程。分子的過程。 分類：分類： 粘末端連接粘末端連接 平齊末端連接法平齊末端連接法 同聚物核苷酸末端法同聚物核苷酸末端法

14、人工接頭連接人工接頭連接 T-AT-A克隆克隆限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 “分子剪刀分子剪刀” 型限制性內(nèi)切酶型限制性內(nèi)切酶，能專一地識別，能專一地識別DNADNA分子上特定的堿基序列并將分子上特定的堿基序列并將DNADNA切斷的切斷的內(nèi)切酶。內(nèi)切酶。識別序列的特點識別序列的特點；(I)(I)專一；專一；(2)(2)常由常由4 46 6個堿基組成；個堿基組成； (3) (3)具有回文序列具有回文序列 經(jīng)切割可以生成平頭末端或粘性末端。經(jīng)切割可以生成平頭末端或粘性末端。 可以產(chǎn)生相同粘性末端的不同的限制酶稱作可以產(chǎn)生相同粘性末端的不同的限制酶稱作同尾酶。同尾酶。DNADNA連接酶連接酶“分子針線分

15、子針線” 連接雙鏈連接雙鏈DNA分子中相鄰分子中相鄰3- - OH和和5- -磷酸基之間的磷酸二酯鍵的形磷酸基之間的磷酸二酯鍵的形成。成。 最常用的是最常用的是T4T4連接酶，可以連接粘性連接酶，可以連接粘性末端和平頭末端。末端和平頭末端。1. 1. 粘末端連接粘末端連接（a）目的基因和載體用同一種限制酶切割后連接。載體易自身環(huán)化。 用堿性磷酸酶( (能除掉DNA-5DNA-5端P P基團，使5 5端帶一OH)OH)處理載體，可防止載體自身環(huán)化。 （b b）目的基因和載體用兩種產(chǎn)生粘末端的限制酶切割后連接，可控制目的基因的插入方向( (定向克隆) )Bam H切割反應切割反應 GGATCC C

16、CTAGGT4 DNA連接酶連接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割載體載體DNA用用Bam H切割切割重組體重組體載體自連載體自連目的基因自連目的基因自連同一限制酶切位點連接同一限制酶切位點連接不同限制酶切位點的連接不同限制酶切位點的連接Eco R切割位點切割位點Bg l切割位點切割位點EcoR+ Bg l雙酶切雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切雙酶切T4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體2. 2. 平齊末端連接平齊末端連接優(yōu)點：可連接任何一對優(yōu)點：可連接任何一對DNADNA 可恢復一個酶切位點或產(chǎn)生一個新酶可恢復一個酶切位點或產(chǎn)生一個新酶 切位點切

17、位點缺點：連接率低缺點：連接率低要求連接酶及底物濃度高要求連接酶及底物濃度高 GAAGAA 3. 3. 同聚物核苷酸末端法同聚物核苷酸末端法 在在DNADNA或或RNARNA分子末端的一段同聚物核苷酸延伸。分子末端的一段同聚物核苷酸延伸。 應用末端轉(zhuǎn)移酶在應用末端轉(zhuǎn)移酶在DNADNA片段片段33末端制備粘末端。末端制備粘末端。 避免自身環(huán)化避免自身環(huán)化 互補序列較長時（互補序列較長時（4bp)4bp)，不需連接酶，不需連接酶 4. T-A4. T-A克隆克隆T-vectorT-vector兩條鏈的兩條鏈的5 5端含端含有一個游離的有一個游離的T TPCRPCR過程中增加延伸時間，過程中增加延伸

18、時間，TaqTaq酶可在產(chǎn)物的酶可在產(chǎn)物的3 3端多加端多加一個一個A A受體菌條件受體菌條件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)處于感受態(tài)(competent) (competent) 導入方式導入方式轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 (transformation)(transformation)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 (transfection)(transfection)感染感染 (infection)(infection)四、重組四、重組DNADNA的轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化1. 1. 基本概念基本概念 轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)化（transformationtransformation）：把以質(zhì)粒為載體：把以質(zhì)粒為載

19、體構(gòu)建的重組構(gòu)建的重組DNADNA，在一定條件下引入受體細胞，在一定條件下引入受體細胞的過程。的過程。 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染（transfectiontransfection）：以噬菌體或病毒構(gòu)：以噬菌體或病毒構(gòu)建的重組建的重組DNADNA引入受體細胞的過程。引入受體細胞的過程。 感染（感染（infectioninfection）：）：病毒或重組病毒病毒或重組病毒DNADNA進進入細胞的過程。入細胞的過程。 轉(zhuǎn)化子：轉(zhuǎn)化子：又稱工程菌，即接受了重組又稱工程菌，即接受了重組DNADNA的受的受體菌。體菌。2.2.受體細胞感受態(tài)受體細胞感受態(tài) 感受態(tài)感受態(tài)(competent) ：細胞最易攝取細胞最易攝取和和

20、“容忍容忍”外來外來DNADNA的生理狀態(tài)。的生理狀態(tài)。 致敏：致敏：誘導細胞進入感受態(tài)的操作誘導細胞進入感受態(tài)的操作。轉(zhuǎn)化動物細胞常用的方法轉(zhuǎn)化動物細胞常用的方法 1.1.磷酸鈣共沉淀法；磷酸鈣共沉淀法； 2.DEAE- 2.DEAE-葡聚糖或聚陽離子促進吸收法；葡聚糖或聚陽離子促進吸收法； 3. 3.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法； 4. 4.電穿孔法；電穿孔法； 5. 5.病毒轉(zhuǎn)染法；病毒轉(zhuǎn)染法； 6. 6.顯微注射法。顯微注射法。 五、重組體篩選、鑒定與五、重組體篩選、鑒定與克隆擴增克隆擴增平板篩選平板篩選插入失活插入失活插入表達插入表達電泳篩選電泳篩選PCRPCR篩選篩選核酸雜交核酸雜交

21、DNADNA測序測序免疫學檢測法免疫學檢測法1. 1. 常用篩選常用篩選/ /鑒定陽性重組體的方法鑒定陽性重組體的方法初步初步篩選篩選精確精確鑒定鑒定表型表型鑒定鑒定1.1.平板篩選法平板篩選法（1 1）插入失活）插入失活（insertional inactivation)insertional inactivation)： 在載體在載體某個某個基因序列的限制性內(nèi)切酶位點基因序列的限制性內(nèi)切酶位點上插入外源上插入外源DNADNA后，使該基因失去活性，從而不后，使該基因失去活性，從而不能表達其相應的功能。能表達其相應的功能。 常以此現(xiàn)象作為標記，篩選被這種重組體常以此現(xiàn)象作為標記，篩選被這種重組

22、體轉(zhuǎn)化的細胞。轉(zhuǎn)化的細胞。( (插入失活法插入失活法) )抗藥性標記選擇抗藥性標記選擇1. Amps Tets （轉(zhuǎn)化失?。?. Ampr Tetr （轉(zhuǎn)化成功，但僅轉(zhuǎn)入載體，無重組）3. Ampr Tets （轉(zhuǎn)化、重組均成功 ）（2 2）插入表達（）插入表達（insertional expression)insertional expression) 載體設計時，在篩選標志基因前連接一段載體設計時，在篩選標志基因前連接一段負調(diào)控序列（抑制作用），當目的基因在此插負調(diào)控序列（抑制作用），當目的基因在此插入時入時 ，使其對下游的抑制作用喪失，使其對下游的抑制作用喪失 ，從而下，從而下游的篩選標

23、志得到表達。游的篩選標志得到表達。 CICI為負控制序列（抑制為負控制序列（抑制Ter表達）表達） 當當DNADNA插入使插入使CICI失活失活 Ter表達，表達，由此作為陽性克隆的篩選。由此作為陽性克隆的篩選。 2.2.酶切酶切- -電泳法篩選電泳法篩選 經(jīng)初篩鑒定有重組子的菌落，小量培養(yǎng)經(jīng)初篩鑒定有重組子的菌落，小量培養(yǎng)后再抽提出重組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體后再抽提出重組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體DNA,DNA,用相用相應的內(nèi)切酶切割，電泳后根據(jù)應的內(nèi)切酶切割，電泳后根據(jù)DNADNA分子大小分子大小不同，鑒別真正重組體不同，鑒別真正重組體DNADNA，排除假陽性和，排除假陽性和載體自我連接載體雙重體。載體自

24、我連接載體雙重體。 該法不能鑒別插入片段大小相似的非目該法不能鑒別插入片段大小相似的非目的基因片段的假陽性。的基因片段的假陽性。 聯(lián)合酶切聯(lián)合酶切鑒定同源末端連接重組子中鑒定同源末端連接重組子中 DNADNA插入片段的方向插入片段的方向3.3.PCR法篩選法篩選 提取重組質(zhì)粒提取重組質(zhì)粒DNADNA，用已知的特異引物擴增，擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測有無，用已知的特異引物擴增，擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測有無相應電泳帶。相應電泳帶。4.4.核酸分子雜交（核酸分子雜交（hybridizationhybridization）兩條不同來源的含有互補核苷酸序列的單兩條不同來源的含有互補核苷酸序列的單鏈核酸分子

25、，通過堿基配對規(guī)律形成一個鏈核酸分子，通過堿基配對規(guī)律形成一個新的穩(wěn)定的雙鏈核酸分子的過程新的穩(wěn)定的雙鏈核酸分子的過程 u 菌落原位雜交（菌落原位雜交（Hybridization in SituHybridization in Situ） （以細菌為受體細胞）（以細菌為受體細胞） 使用與目的使用與目的DNADNA互補的探針鑒別陽性轉(zhuǎn)化菌互補的探針鑒別陽性轉(zhuǎn)化菌菌落原位雜交菌落原位雜交法篩選法篩選復印至硝酸復印至硝酸纖維素膜上纖維素膜上用用NaOHNaOH菌體菌體裂解裂解DNADNA變性變性雜交雜交放射自顯影放射自顯影32P-cDNA與放射性與放射性cDNAcDNA雜雜交的菌落的斑點交的菌落的斑

26、點細菌菌落細菌菌落單鏈單鏈DNADNA結(jié)結(jié)合到膜上合到膜上5.5. DNA測測序序測序：確定測序：確定DNA鏈上確切的堿基順序鏈上確切的堿基順序方法：對初步篩選的陽性重組子，擴增后抽提質(zhì)粒，酶切回收片斷，進行方法：對初步篩選的陽性重組子，擴增后抽提質(zhì)粒，酶切回收片斷，進行DNA測序確認。測序確認。 6.6.免疫學檢測法鑒定表達產(chǎn)物免疫學檢測法鑒定表達產(chǎn)物 依據(jù)抗原、抗體特異性結(jié)合反應的原理，依據(jù)抗原、抗體特異性結(jié)合反應的原理，以單克隆抗體對表達產(chǎn)物進行特異性檢測。以單克隆抗體對表達產(chǎn)物進行特異性檢測。六、目的六、目的DNADNA在受體細胞在受體細胞中的表達中的表達 基因工程表達系統(tǒng)基因工程表達

27、系統(tǒng)大腸桿菌系統(tǒng)大腸桿菌系統(tǒng)枯草桿菌系統(tǒng)枯草桿菌系統(tǒng)酵母細胞系統(tǒng)酵母細胞系統(tǒng)昆蟲細胞系統(tǒng)昆蟲細胞系統(tǒng)哺乳動物細胞系統(tǒng)哺乳動物細胞系統(tǒng)原核表達系統(tǒng)原核表達系統(tǒng)真核表達系統(tǒng)真核表達系統(tǒng)基因工程操作的主要步驟基因工程操作的主要步驟載體載體質(zhì)粒質(zhì)粒噬菌體噬菌體病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因組基因組DNA cDNA 人工合成人工合成PCR產(chǎn)物產(chǎn)物限制酶消化限制酶消化開環(huán)載體開環(huán)載體DNA目的基目的基因因連接酶連接酶重組體重組體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主帶重組體的宿主篩選篩選表型篩選表型篩選酶切電泳鑒定酶切電泳鑒定菌落原位雜交菌落原位雜交重組重組DNADNA技

28、術(shù)操作過程可形象歸納為技術(shù)操作過程可形象歸納為 小小 結(jié)結(jié)分分分離目的基因分離目的基因 切切限制酶切目的基因與載體限制酶切目的基因與載體接接拼接重組體拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌轉(zhuǎn)入受體菌 篩篩篩選重組體篩選重組體 基因工程的實踐基因工程的實踐1.1.利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗 乙肝病毒在體外細胞培養(yǎng)基中并不能生長，因乙肝病毒在體外細胞培養(yǎng)基中并不能生長，因此第一代的乙肝疫苗是從病毒攜帶者的肝細胞質(zhì)膜此第一代的乙肝疫苗是從病毒攜帶者的肝細胞質(zhì)膜上提取出來的。雖然這種質(zhì)膜來源的疫苗具有較高上提取出來的。雖然這種質(zhì)膜來源的疫苗具有較高的免疫原性，但其大規(guī)模生產(chǎn)受到病毒表面抗原來

29、的免疫原性，但其大規(guī)模生產(chǎn)受到病毒表面抗原來源的限制，而且提取物需要高度純化，純化過程中源的限制，而且提取物需要高度純化，純化過程中往往會發(fā)生失活現(xiàn)象。此外，最終產(chǎn)品還必須嚴格往往會發(fā)生失活現(xiàn)象。此外，最終產(chǎn)品還必須嚴格檢驗其中是否混有病人的致病病毒。所有這些工序檢驗其中是否混有病人的致病病毒。所有這些工序?qū)е轮圃斐杀靖呔硬幌拢虼诉@種傳統(tǒng)的乙肝疫苗導致制造成本高居不下，因此這種傳統(tǒng)的乙肝疫苗生產(chǎn)方法不能滿足幾億接種人群的需求。生產(chǎn)方法不能滿足幾億接種人群的需求。乙醇氧化酶基因(aox1)啟動子可幫助該質(zhì)粒整合到特定染色體位點的序列(3-aox1)His合成過程中所需的組氨醇脫氫酶基因(his

30、)圖10-12宿主采用組氨醇脫氫酶宿主采用組氨醇脫氫酶缺陷型缺陷型(HIS4(HIS4) )的的 P.pastorisP.pastoris，經(jīng)雙交換，經(jīng)雙交換整合重組后，染色體上整合重組后，染色體上的的aoxlaoxl丟失，而整合入丟失，而整合入aoxlaoxl啟動子啟動子HBsAg-HBsAg-aoxlaoxl終止子及加終止子及加 poly(A)poly(A)信號序列、信號序列、his4his4和和3aox13aox1。整合后。整合后的細胞可在不含的細胞可在不含HisHis的的培養(yǎng)基上生長培養(yǎng)基上生長 在酵母細胞中，這種蛋白能像在受乙肝病毒侵染的人體細胞中那樣，組裝在酵母細胞中，這種蛋白能像

31、在受乙肝病毒侵染的人體細胞中那樣，組裝成多亞基成多亞基 的復合物，能誘導產(chǎn)生抗體。這個質(zhì)粒結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，在含甲醇的復合物，能誘導產(chǎn)生抗體。這個質(zhì)粒結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，在含甲醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 200h200h后仍不會發(fā)生改變。將重組菌置于后仍不會發(fā)生改變。將重組菌置于240L240L發(fā)酵罐中，其發(fā)酵罐中，其表達量相當于約表達量相當于約9 9l0l06 6劑疫苗。劑疫苗?；蚬こ痰膶嵺`基因工程的實踐2. 彌漫性掌跖角化病患者KRT9突變對中間絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的影響 為了研究其中3個突變（N160S、L167S、A176P）對中間絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的影響，就要構(gòu)建N160S、A176P、L167S的表達載體，觀察它們在細胞內(nèi)的定位和動態(tài)變化。 從皮膚cDNA文庫和患者基因組DNA 中擴增出KRT9的野生型和突變型，將其克隆至pEGFP-N1質(zhì)粒中，分別轉(zhuǎn)染了Hela細胞和Hacat細胞。一、目的基因的分離一、目的基因的分離 從從cDNAcDNA文庫中分離目的基因文庫中分離目的基因 從基因組從基因組DNADNA文庫中分離目的基因文庫中分離目的基因 PCRPCR擴增目的基因片段擴增目的基因片段 化學方法人工合成基因化學方法人工合成基