56反膠束萃取精編版

1、萃取新技術(shù)之萃取新技術(shù)之 第六節(jié)第六節(jié) 反膠束萃取反膠束萃取 一、概述一、概述 傳統(tǒng)的萃取法難以應(yīng)用于蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)的萃取法難以應(yīng)用于蛋白質(zhì)的提取分離。提取分離。 ? 分離對(duì)象的特性；分離對(duì)象的特性； ? 萃取劑的問題。萃取劑的問題。 在這一背景下發(fā)展起來了一種新的在這一背景下發(fā)展起來了一種新的萃取分離技術(shù)萃取分離技術(shù)反膠束萃取反膠束萃取。 ?1977年，瑞士年，瑞士Luisi等人首次提出用反膠等人首次提出用反膠束萃取蛋白質(zhì)；束萃取蛋白質(zhì)； ?到到80年代，荷蘭年代，荷蘭Vant Riet和和Dekker、美國美國Gokelen、Hatton首先進(jìn)行了反膠首先進(jìn)行了反膠束萃取蛋白質(zhì)的研究。束萃取

2、蛋白質(zhì)的研究。 ?近年來該項(xiàng)研究已在國內(nèi)外深入展開。近年來該項(xiàng)研究已在國內(nèi)外深入展開。 該法的優(yōu)點(diǎn)：該法的優(yōu)點(diǎn)： ? 成本低、溶劑可反復(fù)使用；成本低、溶劑可反復(fù)使用； ? 萃取率和反萃取率都很高；萃取率和反萃取率都很高； ? 有可能解決外源蛋白的降解問題；有可能解決外源蛋白的降解問題； ? 構(gòu)成反膠束的表面活性劑往往具有溶解構(gòu)成反膠束的表面活性劑往往具有溶解細(xì)胞的能力，可直接從整細(xì)胞中提取蛋細(xì)胞的能力，可直接從整細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)和酶。白質(zhì)和酶。 二、反膠束溶液形成的條件和特性二、反膠束溶液形成的條件和特性 反膠束溶液是透明的、熱力學(xué)穩(wěn)定的反膠束溶液是透明的、熱力學(xué)穩(wěn)定的系統(tǒng)。系統(tǒng)。反膠束（反膠

3、束（reversed micelle）是表）是表面活性劑分散于連續(xù)有機(jī)相中一種自發(fā)形面活性劑分散于連續(xù)有機(jī)相中一種自發(fā)形成的納米尺度的聚集體。成的納米尺度的聚集體。 表面活性劑表面活性劑是由親水憎油的極性基團(tuán)是由親水憎油的極性基團(tuán)和親油憎水的非極性基團(tuán)兩部分組成的和親油憎水的非極性基團(tuán)兩部分組成的兩性分子，可分為兩性分子，可分為 陰離子表面活性劑陰離子表面活性劑 、陽離子表面活性劑陽離子表面活性劑 和和非離子型表面活性非離子型表面活性劑劑。 表表1 常用的表面活性劑及其相應(yīng)的有機(jī)溶劑常用的表面活性劑及其相應(yīng)的有機(jī)溶劑 表面活性劑表面活性劑 有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑 AOT丁二丁二 表面活性劑表面活性劑

4、 有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑 酸酸-2-2乙乙基己基酯基己基酯磺酸鈉磺酸鈉 n-烴類（烴類（C6 Brij60脂肪脂肪 辛烷辛烷 C10）、異辛烷、）、異辛烷、醇酯醇酯 環(huán)己烷、四氯化碳、環(huán)己烷、四氯化碳、苯苯 TritonX 己醇己醇/環(huán)己烷環(huán)己烷 CTAB十六十六己醇己醇/異辛烷，己異辛烷，己烷基三甲烷基三甲醇醇/辛烷，三氯甲辛烷，三氯甲烷烷/辛烷辛烷 基溴化銨基溴化銨 TOMAC三三環(huán)己烷環(huán)己烷 磷脂酰膽堿磷脂酰膽堿 苯、庚烷苯、庚烷 辛基甲基辛基甲基氯化氨氯化氨 用得最多的是陰離子表面活性劑用得最多的是陰離子表面活性劑AOT（丁二酸（丁二酸-2-2乙基己基酯磺酸鈉）。乙基己基酯磺酸鈉）。 圖圖1

5、 AOT的結(jié)構(gòu)式的結(jié)構(gòu)式 ?將表面活性劑溶于水中，當(dāng)其濃度超過將表面活性劑溶于水中，當(dāng)其濃度超過CMC時(shí)，表面活性劑就會(huì)在水溶液中聚集時(shí)，表面活性劑就會(huì)在水溶液中聚集在一起而形成聚集體，稱為正常膠束。在一起而形成聚集體，稱為正常膠束。 ?若將表面活性劑溶于非極性的有機(jī)溶劑中，若將表面活性劑溶于非極性的有機(jī)溶劑中，并使其濃度超過并使其濃度超過CMC，便會(huì)在有機(jī)溶劑內(nèi)，便會(huì)在有機(jī)溶劑內(nèi)形成聚集體，稱為反膠束。形成聚集體，稱為反膠束。 ?臨臨 界界 膠膠 束束 濃濃 度度 (Critical Micelle Concentration)：膠束形成時(shí)所需表面：膠束形成時(shí)所需表面活性劑的最低濃度。活性劑

6、的最低濃度。 正常膠束正常膠束 ? 表面活性劑的極性表面活性劑的極性頭朝外，疏水的尾頭朝外，疏水的尾部朝內(nèi)，中間形成部朝內(nèi)，中間形成非極性的非極性的“核核”。 水水 極性極性“頭頭” 非極性的非極性的“核核” 非極性非極性“尾尾” 圖圖2-a 正常膠束的結(jié)構(gòu)示意圖正常膠束的結(jié)構(gòu)示意圖 反膠束反膠束 有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑 極性極性“頭頭” ? 表面活性劑的極性表面活性劑的極性頭朝內(nèi)，疏水的尾頭朝內(nèi)，疏水的尾部向外，中間形成部向外，中間形成極性的極性的“核核”。 極性的極性的“核核” 非極性非極性“尾尾” 圖圖2-b 反膠束的結(jié)構(gòu)示意圖反膠束的結(jié)構(gòu)示意圖 反膠束的制備反膠束的制備 相轉(zhuǎn)移法相轉(zhuǎn)移法 注

7、入法注入法 溶解法溶解法 反膠束的特性反膠束的特性 ?臨界濃度臨界濃度 大多數(shù)為大多數(shù)為0.11.0mmol/L； ?含水率含水率W C水W?C表 W的值直接影響到反膠束的大小。的值直接影響到反膠束的大小。 通常反膠束通常反膠束 W40，表面張力，表面張力 0.2mN/m時(shí)不穩(wěn)定，故反膠束最大半徑時(shí)不穩(wěn)定，故反膠束最大半徑 Rm=6nm，適用于，適用于相對(duì)分子量相對(duì)分子量 pI時(shí)，反膠束萃取才可進(jìn)行；而對(duì)于陰離子時(shí)，反膠束萃取才可進(jìn)行；而對(duì)于陰離子表面活性劑，表面活性劑，pHpI時(shí)才可。時(shí)才可。 圖圖5 pH值對(duì)蛋白質(zhì)萃取率的影響值對(duì)蛋白質(zhì)萃取率的影響 對(duì)不同相對(duì)分子量的蛋白質(zhì)，對(duì)不同相對(duì)分子

8、量的蛋白質(zhì)，pH值對(duì)值對(duì)萃取率的影響有差異性，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)相對(duì)分萃取率的影響有差異性，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)相對(duì)分子量增加時(shí)，只有增大（子量增加時(shí)，只有增大（pH-pI）的絕對(duì)）的絕對(duì)值，相轉(zhuǎn)移才能完成。值，相轉(zhuǎn)移才能完成。 eg. eg. 糜蛋白酶（相對(duì)分子量為糜蛋白酶（相對(duì)分子量為2500025000）的萃取率在的萃取率在 |pH-pI|pH-pI|為為2-42-4時(shí)達(dá)到最高；而牛血時(shí)達(dá)到最高；而牛血清蛋白（相對(duì)分子量為清蛋白（相對(duì)分子量為 6800068000）在相同的系統(tǒng)中）在相同的系統(tǒng)中根本不發(fā)生相轉(zhuǎn)移。根本不發(fā)生相轉(zhuǎn)移。 圖圖6 蛋白質(zhì)相對(duì)分子量蛋白質(zhì)相對(duì)分子量Mr與最佳與最佳pH和和pI值之差的關(guān)

9、系值之差的關(guān)系 （在（在TOMAC-正丁醇體系中萃取）正丁醇體系中萃?。?對(duì)于包含大蛋白分子的反膠束，其尺對(duì)于包含大蛋白分子的反膠束，其尺寸遠(yuǎn)大于寸遠(yuǎn)大于“空核空核”的反膠束，萃取時(shí)勢(shì)必的反膠束，萃取時(shí)勢(shì)必要消耗較多的能量，這些能量只能通過較要消耗較多的能量，這些能量只能通過較強(qiáng)的靜電相互作用得到補(bǔ)償。用調(diào)節(jié)強(qiáng)的靜電相互作用得到補(bǔ)償。用調(diào)節(jié)pH的作用來增加蛋白質(zhì)分子表面電荷的方法，的作用來增加蛋白質(zhì)分子表面電荷的方法，正是達(dá)到增強(qiáng)靜電作用的一條途徑。正是達(dá)到增強(qiáng)靜電作用的一條途徑。 2、離子強(qiáng)度、離子強(qiáng)度 離子強(qiáng)度對(duì)萃取率的影響主要是由離子離子強(qiáng)度對(duì)萃取率的影響主要是由離子對(duì)表面電荷的屏蔽作用

10、所決定的：對(duì)表面電荷的屏蔽作用所決定的： 1)離子強(qiáng)度增大后，反膠束表面的雙電層變離子強(qiáng)度增大后，反膠束表面的雙電層變薄，減弱了蛋白質(zhì)與反膠束間的靜電作用；薄，減弱了蛋白質(zhì)與反膠束間的靜電作用； 反膠束內(nèi)表面的雙電層變薄后，也減弱了反膠束內(nèi)表面的雙電層變薄后，也減弱了表面活性劑極性基團(tuán)間的斥力，使反膠束表面活性劑極性基團(tuán)間的斥力，使反膠束變??；變?。?2)3)離子強(qiáng)度增大后，增大了離子向反膠束離子強(qiáng)度增大后，增大了離子向反膠束內(nèi)內(nèi)“水池水池”的遷移并取代其中蛋白質(zhì)的的遷移并取代其中蛋白質(zhì)的傾向；傾向； 鹽與蛋白質(zhì)或表面活性劑的相互作用，鹽與蛋白質(zhì)或表面活性劑的相互作用，可改變?nèi)芙庑阅??？筛淖內(nèi)?/p>

11、解性能。 4)7 3、表面活性劑類型及濃度、表面活性劑類型及濃度 1)從反膠束萃取的機(jī)理出發(fā)，選用有利于增強(qiáng)從反膠束萃取的機(jī)理出發(fā)，選用有利于增強(qiáng)蛋白質(zhì)表面電荷與反膠束內(nèi)表面電荷間的靜蛋白質(zhì)表面電荷與反膠束內(nèi)表面電荷間的靜電作用和增加反膠束大小的表面活性劑。電作用和增加反膠束大小的表面活性劑。 增大表面活性劑的濃度可增加反膠束的數(shù)量，增大表面活性劑的濃度可增加反膠束的數(shù)量，從而增大對(duì)蛋白質(zhì)的溶解能力。從而增大對(duì)蛋白質(zhì)的溶解能力。 2) 但濃度過高時(shí)，可能在溶液中形成復(fù)雜的但濃度過高時(shí)，可能在溶液中形成復(fù)雜的聚集體，增加反萃取的難度。聚集體，增加反萃取的難度。 4、離子種類、離子種類 通常反膠束

12、中表面活性劑的極性基團(tuán)通常反膠束中表面活性劑的極性基團(tuán)不是完全電離的，有很大一部分陽離子仍不是完全電離的，有很大一部分陽離子仍在膠團(tuán)的內(nèi)表面上，因此陽離子的種類會(huì)在膠團(tuán)的內(nèi)表面上，因此陽離子的種類會(huì)影響反膠束內(nèi)表面的電荷密度，該密度越影響反膠束內(nèi)表面的電荷密度，該密度越大，產(chǎn)生的反膠束也越大。大，產(chǎn)生的反膠束也越大。 表表2 不同離子對(duì)蛋白質(zhì)萃取的影響不同離子對(duì)蛋白質(zhì)萃取的影響 鹽類鹽類 pH值值 萃取率（萃取率（%） 核糖核核糖核溶菌酶溶菌酶 胰蛋白胰蛋白酸酶酸酶 酶酶 15.7 100.9 31.3 7.6 98.5 27.0 胃乳蛋胃乳蛋白酶白酶 _ _ CaCl2 1M pH5和和pH

13、10 CaCl2 0.1M pH10 CaCl2 0.1M pH5 KCl 1M pH5 MgCl2 0. 1M pH5 96.0 4.0 86.6 103.0 11.5 9.3 59.1 14.4 21.4 8.4 _ _ 5、其它因素、其它因素 ?有機(jī)溶劑的種類有機(jī)溶劑的種類 ?助表面活性劑助表面活性劑 ?溫度溫度 五、反膠束萃取蛋白質(zhì)的應(yīng)用五、反膠束萃取蛋白質(zhì)的應(yīng)用 ?分離蛋白分離蛋白質(zhì)混合物質(zhì)混合物 圖圖8 三種蛋白質(zhì)混合物分離過程示意圖三種蛋白質(zhì)混合物分離過程示意圖 ?從發(fā)酵液中提取胞外酶從發(fā)酵液中提取胞外酶 Aries - Barros用用AOT/ 異辛烷體系，從異辛烷體系，從細(xì)菌

14、發(fā)酵液中提取了細(xì)菌發(fā)酵液中提取了2 種脂肪酶；種脂肪酶； Leser 從大豆和向日葵中分離了蛋白質(zhì)、從大豆和向日葵中分離了蛋白質(zhì)、油脂和多酚。油脂和多酚。 ?直接提取胞內(nèi)酶直接提取胞內(nèi)酶 Giovenco 利用表面活性劑可以破壞細(xì)利用表面活性劑可以破壞細(xì)胞壁的特點(diǎn)胞壁的特點(diǎn), 用反膠團(tuán)體系直接提取了胞用反膠團(tuán)體系直接提取了胞內(nèi)酶。內(nèi)酶。 ?蛋白質(zhì)復(fù)性蛋白質(zhì)復(fù)性 反膠團(tuán)復(fù)性固態(tài)變性蛋白質(zhì)示意圖反膠團(tuán)復(fù)性固態(tài)變性蛋白質(zhì)示意圖 Masafumi Sakono等（等（2004）利用非離子型表）利用非離子型表面活性劑四甘醇十二烷基醚形成反膠束使碳酸酐面活性劑四甘醇十二烷基醚形成反膠束使碳酸酐酶復(fù)性，酶復(fù)性，20h內(nèi)收率達(dá)到內(nèi)收率達(dá)