基因測序技術的優(yōu)缺點及應用

1、基因測序技術的優(yōu)缺點及應用隨著人類基因組計劃的完成，人類對自身遺傳信息的了解和掌握有了前所 未有的進步。與此同時，分子水平的基因檢測技術平臺不斷發(fā)展和完善，使得基因 檢測技術得到了迅猛發(fā)展，基因檢測效率不斷提高。從最初第一代以 Sanger測 序為代表的直接檢測技術和以連鎖分析為代表的間接測序技術，到2005年，以Illumina公司的Solexa技術和 ABI公司的SOLiD技術為標志的新一代測 序(next-generation sequencing,NGS) 的相繼出現(xiàn)，測序效率明顯提升，時間 明顯縮短，費用明顯降低，基因檢測手段有了革命性的變化。其技術正向著大規(guī)模、 工業(yè)化的方向發(fā)展，

2、極大地提高了基因檢測的檢出率，并擴展了疾病在基因水平的 研究范圍。2009年3月，約翰霍普金斯大學的研究人員在Science雜志上 發(fā)表了通過NGS外顯子測序技術，發(fā)現(xiàn)了一個新的遺傳性胰腺癌的致病基因 PALB2,標志著NGS測序技術成功應用于致病基因的鑒定研究。同年,Nature發(fā)表了采用 NGS技術發(fā)現(xiàn)罕見弗里曼謝爾登綜合征MYH3致病基因突變和Nat Genet»發(fā)表了遺傳疾病米勒綜合征致病基因。此后 ，通過NGS技術，與 遺傳相關的致病基因不斷被發(fā)現(xiàn),NGS技術已成為里程碑式的進步。2010年,Science雜志將這一技術評選為當年“十大科學進展”。近兩年，基因檢測成為臨床診

3、斷和科學研究的熱點，得到了突飛猛進和日新月異的發(fā)展，越來越多的臨床和科研成果不斷涌現(xiàn)出來。同時，基因檢測已經(jīng)從 單一的遺傳疾病專業(yè)范疇擴展到復雜疾病和個體化應用更加廣闊的領域，其臨床檢測范圍包括高危疾病的新生兒篩查、遺傳疾病的診斷和基因攜帶的檢測以及基 因藥物檢測用于指導個體化用藥劑量、 選擇和藥物反應等諸多方面的研究。目前, 基因檢測在臨床診斷和醫(yī)學研究的應用正越來越受到醫(yī)生的普遍重視和引起研 究人員的極大的興趣。本文介紹了幾種 DNA水平基因檢測常見的方法，比較具優(yōu)缺點和在臨 床診斷和科學研究中的應用，對指導研究生和臨床醫(yī)生課外學習，推進臨床科研工 作和提升科研教學水平有著指導意義。1、第

4、一代測序1.1 Sanger測序 采用的是直接測序法。1977年,Frederick Sanger等 發(fā)明了雙脫氧鏈末端終止法，這一技術隨后成為最為常用的基因測序技術。2001 年,Allan Maxam 和 Walter Gibert發(fā) 明了 Sanger測序法，并在此后的10年 里成為基因檢測的金標準。其基本原理即雙脫氧核甘三磷酸 (dideoxyribonucleoside triphosphate,ddNTP)缺乏 PCR 延伸所需的 3'-OH,因 此每當DNA鏈加入分子ddNTP,延伸便終止。每一次 DNA測序是由4個獨 立的反應組成，將模板、引物和 4種含有不同的放射性同

5、位素標記的核甘酸的 ddNTP分別與DNA聚合酶混合形成長短不一的片段，大量起始點相同、終止點 不同的DNA片段存在于反應體系中，具有單個堿基差別的 DNA序列可以被聚 丙烯酰胺變性凝膠電泳分離出來 將到放射性同位素自顯影條帶。依據(jù)電泳條帶 讀取DNA雙鏈的堿基序列。人類基因組的測序正是基于該技術完成的。Sanger測序這種直接測序方法具有高度的準確性和簡單、快捷等特點。目前，依然對于一些臨床上小樣本遺傳疾病基因的鑒定具有很高的實用價值。例如，臨床上采用Sanger直接測序 FGFR 2基因證實單基因 Apert綜合征和直接測序 TCOF1基因可以檢出多 達90%的與Treacher Coll

6、ins綜合征相關的突變。值得注意的是,Sanger測 序是針對已知致病基因的突變位點設計引物,進彳T PCR直接擴增測序。單個突 變點的擴增包括該位點在內(nèi)的外顯子片段即可 ，不必將該點所在基因的全部外顯 子都擴增。因此,應明確定位要擴增的位點所在的基因外顯子和該點的具體位置，設計包括該點在內(nèi)的上下游 150200 bp的外顯子片段引物。此外，盡管有NGS 的出現(xiàn)，但Sanger測序?qū)τ谟兄虏』蛭稽c明確并且數(shù)量有限的單基因遺傳疾 病的致病基因的檢測是非常經(jīng)濟和高效的。到目前為止,Sanger測序仍然是作為基因檢測的金標準，也是NGS基因檢測后進行家系內(nèi)和正常對照組驗證的主要 手段。值得注意的是

7、,Sanger測序目的是尋找與疾病有關的特定的基因突變。對于沒有明確候選基因或候選基因數(shù)量較多的大樣本病例篩查是難以完成的，此類測序研究還要依靠具有高通量測序能力的NGS。雖然Sanger測序具有高度的分析準確性，但其準確性還取決于測序儀器以及測序條件的設定。另外,Sanger 測序不能檢測出大片段缺失或拷貝數(shù)變異等基因突變的類型，因此對于一些與此相關的遺傳性疾病還不能做出基因?qū)W診斷。1.2 連鎖分析 采用的是間接測序法。在 NGS出現(xiàn)之前，國際通用的疾 病基因定位克隆策略是建立在大規(guī)模全基因掃描和連鎖分析基礎上的位置候選 基因克隆。人類的染色體成對出現(xiàn)，一條來自父親，一條來自母親，每一對染色

8、體在 同樣的位置上擁有相同的基因，但是其序列并不完全相同，被稱為父系和母系等位 基因。遺傳標記是指在人群中表現(xiàn)出多態(tài)現(xiàn)象的DNA序列，可追蹤染色體、染色體某一節(jié)段或某個基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。它存在于每一個人，但大小和序列有差別，具有可遺傳性和可識別性。目前采用第二代遺傳標記，即重復序列多態(tài)性，特別是短串聯(lián)重復序列，又稱微衛(wèi)星標記。連鎖分析是以連鎖 這種遺傳現(xiàn)象為基礎，研究致病基因與遺傳性標記之間關系的方法。如果控制某 一表型性狀的基因附近存在遺傳標記，那么利用某個遺傳標記與某個擬定位的基 因之間是否存在連鎖關系，以及連鎖的緊密程度就能將該基因定位到染色體某一 位置上。1986

9、年 Morton 等提出優(yōu)勢對數(shù)記分法 （log odds score method,LOD）,主要檢測兩基因以某一重組率連鎖時的似然性。LOD值為正，支持連鎖;LOD值為負,則否定連鎖。通過計算家系中的微衛(wèi)星標記與致病位點之 間的LOD值，可以初步估算二者間的遺傳距離及連鎖程度，從而確定該基因在染色體上的粗略位置。然后利用該區(qū)域的染色體基因圖譜，分析定位區(qū)域內(nèi)所有基因的功能與表達，選擇合適的候選基因進行突變檢測，最終將致病基因定位或克產(chǎn)生0然而，采用連鎖分析進行基因檢測存在很大的局限性。 不但所需遺傳樣本量較大，一般要求提供三代及以上遺傳家系患者血樣，而且數(shù)據(jù)量大、處理復雜、產(chǎn)出速度較慢、定

10、位不夠精確 （一般只能定位在染色體某一區(qū)間 ），這就使得研究工作繁重和定位基因的時間周期特別長。目前 ，連鎖分析采用的單核甘酸多肽 性和短串聯(lián)重復序列還在使用，但經(jīng)典的間接測序方法，如單鏈構象多肽性、變性 梯度凝膠電泳和異源雙鏈分析在美國已被淘汰 ，而在發(fā)展中國家作為研究手段還 在有限使用。2、新一代測序（NGS）主 要 包 括 全(whole-genomesequencing,WGS) 、(whole-exomesequencing,WES) 和基 因 組 重 測 序全 外 顯 子 組測 序目標區(qū)域測序 （Targetedregionssequencing,TRS),它們同屬于新一代測序技術

11、?？傮w而言,NGS技術具有通量大、時間短、精確度高和信息量豐富等優(yōu)點，使得遺傳學者可以在短時間內(nèi)對感興趣的基因進行精確定位。但這些不同的測序技術在測序范圍、數(shù)據(jù)分析 量以及測序費用和時間等方面又有很大差別，如果選擇適合的方法，對于臨床診斷 和科學研究將起到事半功倍的作用。2.1 目標區(qū)域測序 目前常用的是基因芯片技術。具測序原理是基于DNA雜交原理，利用目標基因組區(qū)域定制的探針與基因組DNA進行芯片雜交或溶液雜交，將目標基因區(qū)域 DNA富集,再通過NGS技術進行測序。其測序過 程是通過把數(shù)以萬計的 cDNA或寡聚核甘酸置于芯片上制成列陣，將芯片上周 定好的已知序列的核甘酸探針與溶液中含有熒光標

12、記的相應核酸序列進行互補 配對,根據(jù)測序儀所顯示強熒光的位置和強度，獲取每組點陣列信息，再利用生物信息學算法確定目的靶核甘酸的序列組成。 測序所選定的目標區(qū)域可以是連續(xù)的 DNA序列，也可以是分布在同一個染色體不同區(qū)域或不同染色體上的片段。目標區(qū)域測序技術，對于以往通過連鎖分析將基因突變鎖定在染色體某一片段區(qū)域內(nèi)，但無法找出突變是一個非常好的進一步檢測手段。2010年,Nicholas等使用基因 分型芯片聯(lián)合連鎖分析技術，成功發(fā)現(xiàn)頭小畸形的新基因WDR62,文章發(fā)表在NatGenet雜志。類似的研究在家族性胰腺癌中確定8個候選變異位點和在家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變發(fā)現(xiàn)易感基因TSPAN12。

13、基因芯片測序技術可以將經(jīng)過連鎖分析鎖定了目標范圍或經(jīng)過全基因組 篩選的特定基因或區(qū)域進行更深一層的研究，是解決連鎖分析無法發(fā)現(xiàn)致病基因的有效手段?；蛐酒夹g對于已知基因突變的篩查具有明顯優(yōu)勢，可以快速、全面地檢測出目標基因突變。同時，由于目標區(qū)域受到了限制，測序范圍大幅度減 少,測序時間和費用相應降低。但基因芯片檢測所需要的 DNA的量要大，由于已 提取的DNA存在降解的風險，用于基因芯片研究的血標本最好是冰凍的全血 ， 這樣可以使用于檢測 DNA的量有充分保證。2.2 全外顯子組測序(WES)外顯子組是單個個體的基因組 DNA上所 有蛋白質(zhì)編碼序列的總合。人類外顯子組序列約占人類全部基因組

14、序列的1%,但大約包含 85%的致病突變。WES是利用序列捕獲技術將全外顯子區(qū)域 DNA捕捉并富集后進行高通量測序的基因分析方法。采用的技術平臺主要是羅 氏公司的 SeqCap EZ全外顯子捕獲系統(tǒng),Illumina公司的 Solexa技術和 Agilent公司的SureSelect外顯子靶向序列富集系統(tǒng)。其捕獲的目標區(qū)在34 62 M之間，不僅包括編碼區(qū)同時也加入了部分非編碼區(qū)。NGS的測序過程主要包括DNA測序文庫的制備、錨定橋接、PCR擴增、單堿基延伸測序和數(shù)據(jù)分 析。研究者根據(jù)測序儀捕獲到在測序過程中摻入有不同熒光標記堿基片段，經(jīng)計算機將熒光信號轉(zhuǎn)化成不同顏色的測序峰圖和堿基序列?；驕y序結果與NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫等國際權威數(shù)據(jù)庫比對，最終確定是否為突變 基因。自NGS技術問世以來，利用 WES在臨床疾病致病基因的鑒定研究中 取得前所未有的成果。這些成果不