基因組DNA測序文庫構(gòu)建

1、基因組DNA測序文庫構(gòu)建1 .對收到的DNA羊品進行檢測，取 2-3ul樣品，用1%勺瓊脂糖膠檢測，對于純度不夠（含RNA蛋白）的DNA羊品需要柱純化后重新檢測。對于細菌基因組需要擴增16S全長序列，進行驗證。對于噬菌體或者質(zhì)粒樣品，若用16S全長引物擴增，無目的條帶則無細菌基因組污染，若出現(xiàn)目的條帶則存在污染，需要去除后建庫。2 .用Qubit檢測DNA羊品濃度。3 .吸取部分 DNA羊品，用 TE或日ution Buffer稀釋，終濃度在 10ng/ul-30ng/ul 之間,體積為130ul。用Covaris破碎，破碎時請根據(jù)需要片段大小，按標準操作流程操作。4.樣品足夠多的情況下，可以

2、取適量破碎后的產(chǎn)物進行PAGE膠或者瓊脂糖膠檢測。M Sample訕:5 .對破碎后的產(chǎn)物進行柱式法 （5倍體積的B3+100-200ul異丙醇）濃縮回收，加入50-100ulTE或日ution Buffer 洗脫。回收產(chǎn)物用 Qubit測值。6 .修平和磷酸化100ul體系DNA1ug5 X T4 polymerase buffer20ulBSA (5mg/ml)2ulATP (100mm)1uldNTP (10mm)10ulT4 DNA Polymerase (5U/ul)1ulKlenow (10U/ul)1ulT4 PNK (10U/ ul)1.5ul22 C反應20min,柱式法純化

3、，50-100ul TE 洗脫。t化后 Qubit測值。7 .力口 A'100ul體系DNA0.5-2.5ug10 X klenow buffer10uldATP(10mm)1-3ulKlenow(exon-) (5U/ul)1-3ul37°反應20min ,柱式法純化，50-100ul TE洗脫。t化后 Qubit測值。8 .連接頭200ul體系10 X T4 DNA ligase buffer 20ulPEG400030ulATP(100mm)2ulDNAX接頭丫T4 DNA ligase1.5-2ul加水至200ulDNA與接頭的摩爾比約在1:3至1:10之間。9 .連

4、接產(chǎn)物用柱式法純化后，跑瓊脂糖膠切割目的區(qū)域回收。10 . PCRF增10 X TagE buffer 5ulMg+4uldNTP(10mm) 1ullib-PCR-F0.5ullib-PCR-R 0.5ultagE0.5ulDNA5ulddHO33.5ul11 .瓊脂糖膠回收。12 . Qubit測值，總量足夠的情況下，取 3ul跑膠檢測。13 .附錄T4 DNA Polymerase由于同時具有 5'f 3'DNA聚合酶活性和 3'f 5'DNA外切酶活 性，可以用于將 5'端突出末端補平或3'端突出末端削平。T4 DNA Polymeras

5、e的3'f 5'DNA外切酶活性對于單鏈 DNAM比雙鏈DNA活性更高，即單鏈 DNA要比雙鏈DNA 中的非配對鏈部分更容易被T4 DNA Polymerase所消化。T4 DNA Polymerase 的3'-5'外切酶活性比 Klenow Fragment要高約200倍。DNA聚合酶I大片段(Klenow 片段)是E. coli DNA聚合酶I的蛋白水解產(chǎn) 物，具有DNA聚合酶活性和 3' f5'核酸外切酶活性，但缺失了5' f3'核酸外切酶活性。Klenow既保留了全酶的高保真性，又不會降解DNA 5'末端。注意：由

6、于該酶具有3' f5'核酸外切酶活性，升高反應溫度、加入過量的酶、未加入 dNTP或反 應時間過長均會導致 DNA末端堿基被切除形成凹陷。T4多聚核甘酸激酶能夠催化磷酸在ATP的丫 -位和寡核甘酸鏈(雙鏈或單鏈DNA或RNA)的5 '-羥基末端以及3 '-單磷酸核昔間進行轉(zhuǎn)移和交換，1個Richardson 單位，指37 c條件下，30分鐘內(nèi)1 U催化1 nmol酸不溶性32P 摻 入所需要的酶量 。Klenow片段(3' -5' exo )是大腸桿菌 DNA聚合酶I的蛋白水解產(chǎn)物。它保留 了 DNA聚合酶活性，但失去了5' f3'外切核酸酶活性。該酶經(jīng)突變(D355A, E357A)去除了其3' -5'的外切核酸酶活性(1) 。 1單位指在37° C條件下，30分鐘內(nèi)能使 10 nmol的dNTPs摻入酸不溶性沉淀物所需要的酶量。注意：Klenow