第八章真核生物的基因調(diào)控

1、【最新卓越管理方案您可自由編輯】（生物科技行業(yè)）第八章真 核生物的基因調(diào)控2020年5月多年的企業(yè)咨洵顧問屋儂,經(jīng)過實(shí)戰(zhàn)驗(yàn)證可以落地執(zhí)i亍的卓越管理方窠，值得您下我擁有第八講真核生物的基因調(diào)控 一、真核生物的基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)在真核細(xì)胞中，一條成熟的mRNA 鏈只能翻譯出一條多肽鏈，不存在原核生物中常見的多基因操縱子形式。真核細(xì)胞DNA 都與組蛋白和大量非組蛋白相結(jié)合，只有一小部分DNA 是裸露的。高等真核細(xì)胞DNA 中很大部分是不轉(zhuǎn)錄的，大部分真核細(xì)胞的基因中間還存在不被翻譯的內(nèi)含子。真核生物能夠有序地根據(jù)生長發(fā)育階段的需要進(jìn)行DNA 片段重排，還能在需要時(shí)增加細(xì)胞內(nèi)某些基因的拷貝數(shù)。在真核生物中

2、，基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)相對(duì)較大，它們可能遠(yuǎn)離啟動(dòng)子達(dá)幾百個(gè)甚至上千個(gè)堿基對(duì)，這些調(diào)節(jié)區(qū)一般通過改變整個(gè)所控制基因 5' 上游區(qū) DNA 構(gòu)型來影響它與 RNA 聚合酶的結(jié)合能力。在原核生物中，轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)都很小，大都位于啟動(dòng)子上游不遠(yuǎn)處，調(diào)控蛋白結(jié)合到調(diào)節(jié)位點(diǎn)上可直接促進(jìn)或抑 RNA 聚合酶與它的結(jié)合。真核生物的 RNA 在細(xì)胞核中合成，只有經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)穿過核膜，到達(dá)細(xì)胞質(zhì)后，才能被翻譯成蛋白質(zhì)，原核生物中不存在這樣嚴(yán)格的空間間隔。許多真核生物的基因只有經(jīng)過復(fù)雜的成熟和剪接過程( maturationandsplicing ) ， 才能順利地翻譯成蛋白質(zhì)。二、真核生物的轉(zhuǎn)錄特點(diǎn)原核生物中，密切相

3、關(guān)的基因往往組成操縱子，并且以多順反子 mRNA 的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，整個(gè)體系置于一個(gè)啟動(dòng)子的控制之下。真核生物的 DNA 是單順反子，很少有置于一個(gè)啟動(dòng)子的控制之下的操縱子。真核生物中許多相關(guān)的基因按功能成套組合，被稱為基因家族( genefamily ) 。1 、基因家族一組功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因?？赡苡赡骋还餐嫦然?ancestralgene) 經(jīng)重復(fù) (duplication) 和突變產(chǎn)生。基因家族的特點(diǎn)：基因家族的成員可以串聯(lián)排列在一起，形成基因簇(genecluster)或串聯(lián)重復(fù)基因(tandemlyrepeatedgenes) ，它們可同時(shí)發(fā)揮作用，合成某些蛋白質(zhì)

4、，如 rRNA 、 tRNA 和組蛋白的基因；有些基因家族的成員也可位于不同的染色體上，這些不同成員編碼一組功能上緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)，如珠蛋白基因；有些成員不產(chǎn)生有功能的基因產(chǎn)物，這種基因稱為假基因(Pseudogene)。假基因與有功能的基因同源，原來可能也是有功能的基因，但由于缺失，倒位或點(diǎn)突變等，使這一基因失去活性， 成為無功能基因。 與相應(yīng)的正常基因相比， 假基因往往缺少正?；虻膬?nèi)含子，兩側(cè)有順向重復(fù)序列。人們推測，假基因的來源之一，可能是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后生成的 RNA前體通過剪接失去內(nèi)含子形成 mRNA ，如果 mRNA 經(jīng)反復(fù)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA ，再整合到染色體 DNA 中去，便有可能

5、成為假基因，因此該假基因是沒有內(nèi)含子的，在這個(gè)過程中，可能同時(shí)會(huì)發(fā)生缺失，倒位或點(diǎn)突變等變化，從而使假基因不能表達(dá)。1 ) 簡單基因家族2 ) 復(fù)雜基因家族海膽， 5 個(gè)基因組成串聯(lián)單位， 可以重復(fù) 1000 次。 串聯(lián)單位中的每個(gè)基因分別被轉(zhuǎn)錄成單順反子 RNA ， 這些 RNA 都沒有內(nèi)含子， 而且各基因在同一條DNA 鏈上按同一方向轉(zhuǎn)錄，每個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯速度都受到調(diào)節(jié)。在生物個(gè)體不同發(fā)育階段，出現(xiàn)幾種不同形式的3 ) 發(fā)育調(diào)控的復(fù)雜基因家族a和3亞基。人的a 珠蛋白基因簇位于16號(hào)染色體短臂上，其中Z為胚胎期基因；3-珠蛋白基因簇位于11號(hào)染色體短臂上,其中e為胚胎期基因，和;科丫為

6、胎兒型基因，8和3為成人期基因。在每個(gè)基因家族中，基因排列的順序就是它們?cè)诎l(fā)育階段的表達(dá)順序。原始珠蛋白大約產(chǎn)生于 8 億年前，由單基因編碼，現(xiàn)代珠蛋白基因家族是由同一個(gè)原始基因通過一系列重復(fù)、突變和轉(zhuǎn)位演變而成的。隨著物種的進(jìn)化，動(dòng)物的體積相對(duì)變大，對(duì)氧的需求量越來越大，在進(jìn)化壓力下，血紅蛋白基因通過自發(fā)突變產(chǎn)生雜合基因，編碼出對(duì)氧的結(jié)合和釋放能力要大大高于單分子血紅蛋白的四聚體。在哺乳動(dòng)物的進(jìn)化中，3鏈基因又發(fā)生突變和重復(fù)，形成了胎兒中的e和丫型珠蛋白。胎兒血紅蛋白對(duì)氧的親和力比成人更大，因而利于胎兒得快速發(fā)育。4 ） 假基因1977年，G- JaCp對(duì)非洲爪贍5SrRNA基因簇的研究后提

7、出了假基因的概念，這是一種核 苷酸序列同其相應(yīng)的正常功能基因基本相同，但卻不能合成出功能蛋白質(zhì)的失活基因。假基因的發(fā)現(xiàn)是真核生物應(yīng)用重組DNA 技術(shù)和序列分析的結(jié)果。現(xiàn)已在大多數(shù)真核生物中發(fā)現(xiàn)了假基因，如Hb的假基因、干擾素、組蛋白、“球蛋白和3球蛋白、肌動(dòng)蛋白及人的rRNA 和 tRNA 基因均含有假基因。由于假基因不工作或無效工作，故有人認(rèn)為假基因，相當(dāng)人的痕跡器官，或作為后補(bǔ)基因。除了多種多樣的遺傳缺陷外，大多數(shù)返座假基因具有以下 4 個(gè)較鮮明的特征： a） 完全缺失存在于功能基因中的間隔序列，即內(nèi)含子序列；b）假基因的序列只與功能基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的起點(diǎn)和終點(diǎn)之間的序列相似，而與其 5

8、9;端調(diào)控序列無關(guān)。但是鼠 Ba 3-珠蛋白假基因7, 鼠促皮質(zhì)素-3-脂蛋白前體假基因81、人免疫球蛋白&及入W1假基因9, 10是其中的例外；c）假基因的3'末端緊接著有多聚腺喋吟尾。以上3個(gè)特征明顯提示這些序列是從成熟mRNA衍生而來，因此這類假基因又被稱為處理后的假基因（圖1）。d）這類假基因的序列兩端常被 721bp的正向重復(fù)序列包圍。這種正向重復(fù)序列也在snRNA 假基因家族和Alu I家族中被發(fā)現(xiàn)，提示正向重復(fù)序列的產(chǎn)生可能是一種共同的插入機(jī)制的結(jié)果。通過分析基因組序列發(fā)現(xiàn)，基因組中存在著與基因數(shù)量幾乎相等的假基因， 假基因是功能基因的缺陷拷貝 。在過去的幾十年中

9、，假基因一直被認(rèn)為是分子化石，是進(jìn)化中基因突變的遺跡。而2003 年 5 月日本學(xué)者Hirotsune 的報(bào)導(dǎo)第一次揭示了假基因的功能。Hirotsune 等人將果蠅的 sex lethal 基因轉(zhuǎn)移到小鼠體內(nèi)，大多數(shù)小鼠表現(xiàn)正常，但有一個(gè)品系的小鼠在幼年期全部死亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)， sex lethal 基因插入到 makorin1 p1 假基因中部， 破壞了該假基因的轉(zhuǎn)錄。 makorin1 p1 是 makorin1 基因的假基因。 如果將假基因 makorin1 p1 敲除， makorin1 基因?qū)⒈魂P(guān)閉。這說明， 基因 makorin1 的表達(dá)受到其同源序列假基因的控制。2 、 D

10、NA 水平調(diào)控1 )染色質(zhì)結(jié)構(gòu)影響基因轉(zhuǎn)錄細(xì)胞分裂時(shí)染色體的大部分到間期時(shí)松開分散在核內(nèi)，稱為常染色質(zhì)( euchromatin ) ，染色質(zhì)常常會(huì)在特定的區(qū)域被解旋松弛，形成自由的 DNA ， DNA 本身局部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)基因暴露，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)區(qū)DNA 的結(jié)合，誘發(fā)基因轉(zhuǎn)錄。松散的染色質(zhì)中的基因可以轉(zhuǎn)錄。染色體中的某些區(qū)段到分裂期后不像其他部分解旋松開，仍保持緊湊折疊的結(jié)構(gòu)，在間期核中可以看到其濃集的斑塊，稱為異染色質(zhì)( hetrochromatin ) ，其中從未見有基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。原本在常染色質(zhì)中表達(dá)的基因如移到異染色質(zhì)內(nèi)也會(huì)停止表達(dá)；哺乳類雌體細(xì)胞2 條 X染色體，到間期

11、一條變成異染色質(zhì)者，這條X 染色體上的基因就全部失活?？梢娋o密的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)阻止基因表達(dá)。常染色質(zhì) (euchromatin) ： 指間期核內(nèi)染色質(zhì)纖維折疊壓縮程度低,處于伸展?fàn)顟B(tài)(典型包裝率 750 倍) ,用堿性染料染色時(shí)著色淺的那些染色質(zhì)。常染色質(zhì)是進(jìn)行活躍轉(zhuǎn)錄的部位，呈疏松的環(huán)狀，電鏡下表現(xiàn)為淺染。并非所有基因都具有轉(zhuǎn)錄活性,常染色質(zhì)狀態(tài)只是基因轉(zhuǎn)錄的必要條件而非充分條件異染色質(zhì) (heterochromatin)： 指間期細(xì)胞核中 ,折疊壓縮程度高,處于聚縮狀態(tài)，堿性染料染色時(shí)著色較深的染色質(zhì)組分。類型結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)(或組成型異染色質(zhì)) (constitutiveheterochroma

12、tin)兼性異染色質(zhì)(facultativeheterochromatin)結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)，除復(fù)制期以外，在整個(gè)細(xì)胞周期均處于聚縮狀態(tài)，形成多個(gè)染色中心。結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)的特征：在中期染色體上多定位于著絲粒區(qū)、端粒、次縊痕及染色體臂的某些節(jié)段；由相對(duì)簡單、高度重復(fù)的 DNA 序列構(gòu)成,如衛(wèi)星DNA ；具有顯著的遺傳惰性,不轉(zhuǎn)錄也不編碼蛋白質(zhì)；在復(fù)制行為上與常染色質(zhì)相比表現(xiàn)為晚復(fù)制早聚縮兼性異染色質(zhì)在某些細(xì)胞類型或一定的發(fā)育階段, 原來的常染色質(zhì)聚縮,并喪失基因轉(zhuǎn)錄活性 ,變?yōu)楫惾旧|(zhì)，如 X 染色體隨機(jī)失活。異染色質(zhì)化可能是關(guān)閉基因活性的一種途徑。 DNase 的敏感性和基因表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，活躍表達(dá)基

13、因所在染色體上一般含有一個(gè)或數(shù)個(gè)DNA酶I超敏感位點(diǎn)，超敏感位點(diǎn)的產(chǎn)生可能什染色質(zhì)結(jié)構(gòu)規(guī)律性變化的結(jié)果。 正是這種變化， 使 DNA 容易與 RNA 聚合酶和其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相結(jié)合，從而啟動(dòng)基因表達(dá)，同時(shí)更易于被核酸酶所降解。當(dāng)一個(gè)基因成為轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)時(shí)，含有這個(gè)基因的染色質(zhì)區(qū)域?qū)Nase I (一種內(nèi)切酶)降解的敏感性要比無轉(zhuǎn)發(fā)活性區(qū)域高得多。這是由于此區(qū)域染色質(zhì)的DNA 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，DNase I易于接觸到DNA之故。一個(gè)很好的研究系統(tǒng)是雞的珠蛋白和卵清蛋白系統(tǒng)。來自雞胚紅細(xì)胞的核中，珠蛋白的基因?qū)?DNase I的降解是敏感的，而編碼卵清蛋白的基因在紅細(xì)胞中是不表達(dá)的，它對(duì)DN

14、ase I的降解也是具有抗性的。相反，在母雞輸卵管細(xì)胞的核中，卵清蛋白的基因是具有轉(zhuǎn)錄活性的，但卻不能產(chǎn)生珠蛋白的RNA,卵清蛋白基因的序列對(duì)DNase I的降解要比珠蛋白基因的序列敏感得多。很多實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論幾乎都是有轉(zhuǎn)錄活性的基因?qū)Nase I的敏感性增加，DNase I敏感區(qū)的范圍隨著基因序列的不同而變化，從基因周圍幾個(gè)Kb 到兩側(cè) 20Kb 大小不等。仔細(xì)分析具有轉(zhuǎn)錄活性基因周圍的 DNA 區(qū)域，表明有一個(gè)中心區(qū)域存在，稱為 超敏感區(qū)域 (hypersensitiveregion ) 或超敏感位點(diǎn) (hypersensitivesite ),它對(duì) DNase I 是高敏感的。這些位點(diǎn)

15、或區(qū)域?qū)⑹紫仁艿紻Nase I的剪切。由于對(duì) DNase I的敏感性反映了染色質(zhì)中 DNA 的有效性，我們將這些位點(diǎn)描述為染色質(zhì)中特殊 DNA 暴露區(qū)域，一般在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近，即5'端啟動(dòng)子區(qū)域，少部分位于其它部位如轉(zhuǎn)錄單元的下游。超敏感位點(diǎn)建立于轉(zhuǎn)錄起始之前，轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)物除去后雖超敏感位點(diǎn)信然存在，但轉(zhuǎn)錄卻很快停止，說明超敏感位點(diǎn)的存在是轉(zhuǎn)錄起始的必要條件，但不是充分條件。超敏感位點(diǎn)是一段長200bp 左右的 DNA 序列， 這些區(qū)域是低甲基化區(qū)； 并可能有局部解鏈的存在；不存在核小體結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)不同尋常，此區(qū)因 DNA 的裸露易和多種酶或特異的蛋白質(zhì)結(jié)合，也就是說易于和反式作用因子結(jié)

16、合。2)DNA 的甲基化和去甲基化A 日常型甲基化酶DNA 有較在甲基化的 DNA 模板指導(dǎo)下使新合成的鏈甲基化。特異性很強(qiáng)，對(duì)半甲基化的高的親和力，使新生的半甲基化 DNA 迅速甲基化，從而保證DNA 復(fù)制及細(xì)胞分裂后甲基 化模式不變。B 從頭合成型甲基化酶無需模板指導(dǎo)完成甲基化修飾。不需要母鏈指導(dǎo)，但速度很慢。C 在一些不表達(dá)的基因中，啟動(dòng)區(qū)的甲基化程度很高，而處于活化狀態(tài)的基因則甲基化程度較低?，F(xiàn)以卵黃原蛋白n基因?yàn)槔齺碚f明這個(gè)問題。卵黃蛋白并非在卵母細(xì)胞或受精卵中合成的，而是在成熟的雌性動(dòng)物肝中先合成卵黃蛋白原( vetellogenin ) ，然后分泌到血液中，再運(yùn)送到卵巢。發(fā)育中的

17、卵(卵母細(xì)胞)選擇性地將卵巢中的卵黃蛋白原加以吸取，再切割，裝配成卵黃蛋白。 雄性動(dòng)物也有卵黃蛋白原基因，但不能表達(dá)。 這是因?yàn)槿狈Υ萍に刂?。其分子機(jī)制仍和甲基化有關(guān)。雞的卵黃蛋白原基因的5'調(diào)節(jié)區(qū)有4個(gè)CpG位點(diǎn)(圖18-43 ),C, D位點(diǎn)是雌二酮受體蛋白復(fù)合物的結(jié)合部位。在雌激素處理后，在 -612 (C)的Hpa n位點(diǎn)處于低甲基化。 在紅細(xì)胞 DNA 的上面一股鏈上4 個(gè)位點(diǎn)全部甲基化，下股鏈只有50%甲基化，但經(jīng)雌二酮處理后數(shù)小時(shí)內(nèi)甲基化的形式發(fā)生急劇變化，上股鏈中 4 個(gè)位點(diǎn)全部去甲基化， 與卵黃蛋白原mRNA 相吻合， 而另一股鍵上4 個(gè)位點(diǎn)滯后24 小時(shí)才去甲基化

18、， 這就是在肝細(xì)胞中卵黃蛋白原基因中的 5'端調(diào)節(jié)區(qū)有部分半甲基化位點(diǎn)，而雌激素的處理只引起其中一條鏈迅速地去甲基化，另一條鏈暫時(shí)仍保持本甲基化狀態(tài)，所以此基因在雄體中處于甲基化狀態(tài)，沒有活性。酶對(duì)CpG位點(diǎn)的甲基化是有選擇的，例如小鼠 伊珠蛋白基因5'側(cè)翼有5個(gè)CpG位點(diǎn)，其中 4 個(gè)較集中。用純化的 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶在體外處理這段序列，結(jié)果各位點(diǎn)的甲基化程度各不相同， 有的不發(fā)生甲基化，有的甲基化不明顯，有的稍有甲基化，有的大量甲基化 ， 無論是誘導(dǎo)的還是未誘導(dǎo)的細(xì)胞；無論是純化酶，還是粗制酶都一樣。表明還有其它的選擇 因素存在。甲基化可使基因失活，去甲基化又可使基因恢復(fù)

19、活性。 5- 氮胞苷（圖 18-45 ）沒有游離的5-H ,因而不能接受甲基，若將它摻入 DNA取代胞昔是可以改變基因的甲基化狀態(tài)，而達(dá)到去甲基化。細(xì)胞 DNA 合成一般有兩條途徑。主途徑是由糖和氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA ，葉酸作為重要的輔酶參與這一合成過程。另一輔助途徑是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（ HGPRT ）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK ）的催化作用合成 DNA 。細(xì)胞融合的選擇培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤（ hypoxanthine ， H ） 、氨甲蝶呤（ aminopterin ， A ）和胸腺嘧啶核苷（thymidine ， T ）

20、，所以取三者的字頭稱為 HAT培養(yǎng)基。氨甲蝶呤是葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細(xì)胞利用正常途徑合成 DNA ，而融合所用的瘤細(xì)胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選出的 HGPRT 細(xì)胞株，所以不能在該培養(yǎng)基中生長。只有融合細(xì)胞具有親代雙方的遺傳性能，可在HAT 培養(yǎng)基中長期存活與繁殖（圖 11-1 ） 。Mohandas 等將含有一條X 染色體易位（X/11 易位）的女人成纖維細(xì)胞和小鼠A9 細(xì)胞（HPRT-）融合后用HAT （培養(yǎng)基中加入了次黃喋吟（H）,氨基喋吟（A）和胸背（T）,選擇帶有 HPRT+ 基因的細(xì)胞，而人類X 染色體的長臂上帶有此基因，若X 染色體失活，這個(gè)基因也沒有活性。選擇出的融合細(xì)胞中一部分帶有

21、2 條人的 X 染色體，一條有活性，一條是失活的。隨著培養(yǎng)的延續(xù)，雜種細(xì)胞將繼續(xù)排斥人類的染色體，在這種情況下再用硫基鳥嘌呤進(jìn)行反選擇（ back-selected ） ，即硫代鳥嘌呤是有毒性的， HGPRT+ 的細(xì)胞可使其摻入 DNA而導(dǎo)致死亡，而HGPRT- 的細(xì)胞反而可以得以生存，選擇出來的細(xì)胞只有一條正常的X 染色體（如未易位） ，表明這條染色體是失活的，所以雖有HGPRT 基因，但不表達(dá)。接著他們用5- 氮胞苷未處理細(xì)胞，然后再在HAT 培養(yǎng)基中克隆，結(jié)果細(xì)胞增加了 100 倍。 （圖 18-46 ） 表明原來失活的 X 染色體經(jīng) 5- 氮胞苷處理后恢復(fù)了活性， HGPRT 基因變成

22、活性狀態(tài)，這樣 才能在 HAT 培養(yǎng)基中分裂。這個(gè)實(shí)驗(yàn)說明 HGPRT 基因在失活染色體上重新被活化是由于5- 氮胞苷起到去甲基化的作用 ，也說明萊昂化不是抑制因子的持續(xù)存在，而是一條染色體被選擇性甲基化之故。D DNA 甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制DNA 甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的直接機(jī)制某些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含有CpG 序列，甲基化以后直接影響了蛋白質(zhì)因子的結(jié)合活性，不能起始基因轉(zhuǎn)錄。DNA 甲基化抑制轉(zhuǎn)錄的間接機(jī)制通 過 改 變 染 色 質(zhì) 的 構(gòu) 象 或 者 通 過 與 甲 基 化 CpG 結(jié) 合 的 蛋 白 因 子( methylCpG-bindingprotein1 ) 間接影響轉(zhuǎn)錄因子與

23、 DNA 的結(jié)合。 甲基化達(dá)到一定程度時(shí)會(huì)發(fā)生從常規(guī)的 B-DNA 向 Z-DNA 的過渡。由于Z-DNA 結(jié)構(gòu)收縮，螺旋加深，使許多蛋白質(zhì)因子賴于結(jié)合的元件縮入大溝而不利于基因轉(zhuǎn)錄的起始。甲基化在 DNA 分子上并不是隨機(jī)分布的，基因的 5 端和 3 端往往富含甲基化位點(diǎn)，而啟動(dòng)區(qū) DNA 分子上的甲基化密度與基因轉(zhuǎn)錄受抑制的程度密切相關(guān)。對(duì)于弱啟動(dòng)子來說，稀少的甲基化就能使其完全失去轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)這一類啟動(dòng)子被增強(qiáng)時(shí)，即使不去甲基化也可恢復(fù)其轉(zhuǎn)錄活性。若進(jìn)一步提高甲基化密度，即使增強(qiáng)后的啟動(dòng)子仍無轉(zhuǎn)錄活性。因?yàn)榧谆瘜?duì)轉(zhuǎn)錄的抑制強(qiáng)度與MeCP1 結(jié)合 DNA 的能力成正相關(guān)， 甲基化 CpG

24、 的密度和啟動(dòng)子強(qiáng)度之間的平衡決定了該啟動(dòng)子是否具有轉(zhuǎn)錄活性。DNA 的甲基化還提高了該位點(diǎn)的突變頻率。 真核生物中 5 mC 主要出現(xiàn)在5 CpG-3序列中， 5 mC 脫氨后生成的胸腺嘧啶( T) ，不易被識(shí)別和校正。因此，特定部位的 5 mC 脫氨基反應(yīng)，將在 DNA 分子中引入可遺傳的轉(zhuǎn)化，若位點(diǎn)突變發(fā)生在DNA 功能區(qū)域，就可能造成基因表達(dá)的紊亂。EDNA 甲基化與 X 染色體失活雌性胎生哺乳類動(dòng)物細(xì)胞中兩條X 染色體之一在發(fā)育早期隨機(jī)失活，以確保其與只有一條X染色體的雄性個(gè)體內(nèi) X 染色體基因的劑量相同。 一旦發(fā)生 X 染色體失活， 使該細(xì)胞有絲分裂所產(chǎn)生的后代都保持同一條X 染色

25、體失活?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)， 在 X 染色體上存在一個(gè)與X 染色體失活有密切聯(lián)系的核心部位稱為 X 染色體失活中心( X-chromosomeinactivationcenter ， Xic ) ，定位在 Xq13 區(qū)(正好是Barr 氏小體濃縮部位) 。Xi-specifictranscript(Xist) 基因只在失活的 X 染色體上表達(dá)，其產(chǎn)物是一功能性RNA ，沒有 ORF 卻含有大量的終止密碼子。實(shí)驗(yàn)證明， XistRNA 分子能可能與Xic 位點(diǎn)相互作用，引起后者構(gòu)象變化，易于結(jié)合各種蛋白因子，最終導(dǎo)致X 染色體失活。有關(guān)資料X 染色體失活是指哺乳動(dòng)物二倍體細(xì)胞中除保持一個(gè)活性X 染色體外

26、， 將其余的 X 染色體全部失活。 X染色體失活牽涉到三個(gè)主要步驟：選擇、起始與傳播。在胚胎發(fā)育的早期，也就是當(dāng)胚胎細(xì)胞從全能細(xì)胞開始分化的時(shí)候，X染色體失活的選擇和起始過程就已經(jīng)開始了。X染色體失活從X失活中心 (Xinactivationcenter,Xic) 起始并雙向傳播至整個(gè)X 染色體。 Xist 基因就定位于X 失活中心，其特異轉(zhuǎn)錄物是一個(gè)剪接過的大分子非編碼RNA ，長約 15kb ，它在雌性體細(xì)胞的失活X 染色體上特異地大量表達(dá)。Xist 與 X 染色體失活的選擇Xist 基因表達(dá)的變化與 X 失活的選擇密切相關(guān)。在即將發(fā)生X 失活的胚胎細(xì)胞中，雄性細(xì)胞的單一X染色體和雌性細(xì)胞

27、的兩個(gè)X 染色體上均可檢測到 Xist 基因的轉(zhuǎn)錄。但是，這種 XistRNA 并不穩(wěn)定而且只能在轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)檢測到。當(dāng) X 失活起始時(shí)，從將要被失活的 X 染色體上轉(zhuǎn)錄而來的 XistRNA 得到了穩(wěn)定并且順 式傳播，覆蓋X 染色體，完成X 失活。然后，另一個(gè)有活性的 X 染色體上不穩(wěn)定的 XistRNA 的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)沉寂了。這樣， X 失活的選擇以阻斷活性X 染色體上 XistRNA 的穩(wěn)定和傳播的方式得到了表現(xiàn)。有人認(rèn)為，在 X 失活的選 擇和起 始過 程中，有 兩種常 染色體 編碼 的蛋白因 子起著 重要作 用， 稱為穩(wěn)定 因子 (stabilizingfactor) 和阻斷因子(block

28、ingfactor)4 。穩(wěn)定因子在失活X 染色體上穩(wěn)定 XistRNA 并介導(dǎo)其與 X 染色體的作用，而阻斷因子則與活性X 染色體上的 X 失活中心作用并阻斷XistRNA 的表達(dá)。通常， X 失活在胚胎細(xì)胞系中是隨機(jī)的，表明阻斷因子在兩個(gè)X 失活中心的作用幾率是相等的。但在鼠雜合體中，有一段稱為 X 控制元件 (Xcontrollingelement,Xce) 的序列與 Xist 基因緊密相連，這段序列導(dǎo)致了 X 失活的偏向，這證明順式作用元件能影響阻斷因子與X 失活中心的作用幾率。 X 控制元件可能是通過調(diào)節(jié) XIST 基因轉(zhuǎn)錄起作用的。 Xce 有強(qiáng)、弱兩種。如果兩個(gè)X 染色體帶有相同

29、的 Xce 等位基因，那么 X失活是隨機(jī)的；如果一個(gè)X 染色體帶有弱 Xce 等位基因，而另一個(gè)X 染色體帶有強(qiáng)Xce 等位基因，則 X 失活就會(huì)發(fā)生偏向，前者的 X 失活幾率比后者的大。這可能是在 Xce 影響下 Xic 對(duì)于阻斷因子的動(dòng)力學(xué)競爭的結(jié)果(圖 1)。上述事實(shí)暗示：在一個(gè)細(xì)胞核內(nèi)，所有的 X 失活中心競爭以獲得與阻斷因子相作用的機(jī)會(huì)，X 失活中心與阻斷因子的親和性則是由胚胎細(xì)胞 Xist 轉(zhuǎn)錄的某些方面決定的。 Xist 基因中的一些序列也可以影響 X 失活的選擇過程， 有實(shí)驗(yàn)證實(shí)一段6kb 的 Xist 序列在 X 染色體的失活選擇中起到了決定性的作用。Xist 與 X 染色體

30、失活的起始X 染色體失活是由一系列 Xist 基因表達(dá)模式的改變所調(diào)節(jié)的。在未分化的雌性胚胎干細(xì)胞內(nèi)，兩個(gè)活性X染色體均能以低水平表達(dá)Xist,當(dāng)細(xì)胞分化開始后，X失活也隨之起始。X失活在胚胎細(xì)胞系中的起始早于囊胚期，約在胚胎發(fā)育的第5 天左右。這時(shí)，兩個(gè)Xist 等位基因的表達(dá)也出現(xiàn)了差別，一個(gè)位點(diǎn)的Xist RNA 出現(xiàn)了高表達(dá)并且與失活 X 染色體順式相連，另一個(gè)位點(diǎn)的 Xist 基因表達(dá)量仍保持低水平，帶有這個(gè)位點(diǎn)的 X 染色體就成為活性X 染色體。最后，當(dāng)胚胎細(xì)胞分化至8.5 天以后，活性X 染色體上的 Xist啟動(dòng)子沉寂了，僅可檢測到與失活X 染色體相連的 XistRNA 。也就是

31、說，在胚胎細(xì)胞分化過程中，雌性細(xì)胞經(jīng)歷了一個(gè)低水平雙等位Xist基因表達(dá)-分化雙等位 Xist基因表達(dá)-高水平單等位Xist基因表達(dá)的過程。在雄性胚胎干細(xì)胞和雌性成纖維細(xì)胞中均只有一個(gè)活性的 X 染色體，它們之間 XistRNA 轉(zhuǎn)錄速率的比較結(jié)果證實(shí)：在Xist 基因的低水平和高水平表達(dá)細(xì)胞之間， XistRNA 轉(zhuǎn)錄速率相差無幾。另外，這兩種細(xì)胞間的 XistRNA 前體的數(shù)量和半衰期也基本相同。然而，這兩種細(xì)胞間剪接后XistRNA 的積累和穩(wěn)定程度卻大不一樣。這說明在Xist 基因的低水平和高水平表達(dá)細(xì)胞之間最大的不同是剪接后 XistRNA 的積累，是失活 X 染色體上的 XistR

32、NA 的轉(zhuǎn)錄后穩(wěn)定過程導(dǎo)致了穩(wěn)定的 XistRNA 的增加。 發(fā)生這種現(xiàn)象的可能原因是有一些蛋白因子與XistRNA 相作用并調(diào)節(jié)其與失活X 染色體的聯(lián)系 5 。X 失活的過程含有三個(gè)調(diào)節(jié)Xist 基因表達(dá)模式所必需的動(dòng)作： 失活 X 染色體上穩(wěn)定因子對(duì)XistRNA 的穩(wěn)定；將穩(wěn)定因子限制于失活X 染色體上；活性X 染色體上 Xist 基因表達(dá)的沉寂。這三個(gè)動(dòng)作是由多能胚胎細(xì)胞的分化所誘導(dǎo)的。 XistRNA 穩(wěn)定因子散布于細(xì)胞核，在已分化的雌性細(xì)胞中專一作用于一個(gè)X 染色體。這種專一的作用可能是通過阻斷穩(wěn)定因子與活性X 染色體的接近而完成的。Xist 與 X 失活的傳播和維持雌性體細(xì)胞中覆

33、蓋于失活 X 染色體上的 XistRNA 外觀呈簇集顆粒狀，其功能不受DNase 與 RNaseH的影響，這暗示XistRNA 并未與 DNA 接觸。有學(xué)者認(rèn)為， RNA- 蛋白相互作用中介了 XistRNA 和染色體之間的順式傳播與聯(lián)系。在YAC 轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中，從常染色體上轉(zhuǎn)錄而來的 XistRNA 可以傳播并導(dǎo)致Xist基因連鎖的常染色體序列的沉寂，表明 X 染色體特異元件在Xist 的傳播和異染色質(zhì)化的過程中并不必需。在胎生和有袋類哺乳動(dòng)物中，失活 X 染色體晚到 S 相才復(fù)制，并且組蛋白 H4 的乙?；悩?gòu)體數(shù)量也有所下降 7 ， 所以， XistRNA 的傳播可能延遲了失活X 染色體

34、復(fù)制的起始。 在雌性胚胎干細(xì)胞的分化過程中， X 染色體復(fù)制延遲、 Xist 轉(zhuǎn)錄物得到穩(wěn)定，這與 X 連鎖基因表達(dá)的下調(diào)和低乙?；?X 染色體的出現(xiàn)是一致的。 XistRNA 可能是通過使失活X 染色體在 S 相復(fù)制起作用的，這同時(shí)導(dǎo)致了在較晚復(fù)制的染色體上異染色質(zhì)的形成。 XistRNA 也可能在失活X 染色體的組蛋白乙?；{(diào)節(jié)中起作用，它可以阻礙組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶的作用或召集組蛋白去乙?；浮IST并不足以維持體細(xì)胞雜交體中X染色體的失活，同時(shí)，XIST也不是X失活的維持所必需的，在X失活的維持中起主要作用的是DNA 的甲基化。盡管 XIST/ Xist 在 X 染色體失活中的重要性不

35、容質(zhì)疑，但是細(xì)胞通過何種分子機(jī)理起始和傳播 X 失活仍是一個(gè)迷。對(duì)于假說中的阻斷因子和穩(wěn)定因子的確認(rèn)十分重要，將會(huì)極大地促進(jìn)XistRNA 在 X 染色體上的集結(jié)機(jī)理的研究，也可能為 X 失活的生物化學(xué)機(jī)理研究提供進(jìn)一步的證據(jù)。a. 親本印記來源于父母本的一對(duì)等位基因表達(dá)不同。如源于父本的 IGF- II （胰島素樣生長因子n）基因可表達(dá)，而源于母本的則不能表達(dá)。此是由于卵母細(xì)胞中的IGF-n已被甲基化，而精子中的IGF-n未被甲基化，所以這一對(duì)等位基因在合子中表現(xiàn)不同。20 種印跡基因。 大多數(shù)人類的印跡基因集中在三個(gè)簇中。在每個(gè)基因簇上都存在著特異的印記盒(imprintingbox) ，

36、 能順式調(diào)節(jié)印跡基因的親本特異性表達(dá)，這些位點(diǎn)表現(xiàn)出親本特異性的甲基化作用和去甲基化作用。基因印記是等位基因依賴雙親性別表達(dá)的不符合孟德爾遺傳定律的特殊遺傳現(xiàn)象。基因印記異常調(diào)節(jié)可引起一些遺傳性疾病。 在人類染色體 11p15.5 和 15q11-13 存在兩個(gè)印記基因聚集區(qū)，兩個(gè)區(qū)域的基因印記異常調(diào)節(jié)引起前者為貝-威綜合征，后者為普-威綜合征和安格爾曼綜合征。高等動(dòng)物的基因組為兩倍體，受精卵從雙親中各繼承了一套基因組。每一個(gè)常染色體均為雙拷貝，父源和母源常染色體基因都能有均等的機(jī)會(huì)表達(dá)或受到抑制，這是孟德爾遺傳定律的基本要素。上世紀(jì)90 年代開始，發(fā)現(xiàn)了不符合這個(gè)定律的遺傳現(xiàn)象。某些基因呈單

37、等位基因表達(dá)，即父源與母源的基因拷貝不能同時(shí)表達(dá)，并且，父源或母源等位基因通過某種特異的基因修飾機(jī)制，特異性地抑制另一母源或父源染色體等位基因表達(dá)。例如：胰島素樣生長因子 2 基因 ( insulin-likegrowthfactor2,IGF2 ) 只表達(dá)源自父親的等位基因， 母源等位基因被抑制。相反的例子，胰島素樣生長 因子2受體基因( insulin-likegrowthfactor2receptor,IGF2R )為源自父親的等位基因不表達(dá)，只表達(dá)母源等位基因。這種現(xiàn)象可能是在父母受精卵形成過程中，特異性地對(duì)源自父親或源自母親的等位基因做一印記使其只表達(dá)父源或母源等位基因。這種現(xiàn)象被稱

38、作基因印記( geneimprinting )或基因組印記( genomicimprinting ) 。臨床上很早就發(fā)現(xiàn)父源和母源等位基因不均等表達(dá)的類似基因印記的現(xiàn)象，如睪丸性畸胎瘤和卵巢性畸胎瘤。睪丸性畸胎瘤細(xì)胞的兩套基因組都是來自孤雌生殖發(fā)生的父源染色體，表現(xiàn)為腫瘤無胎兒成分。而卵巢性畸胎瘤細(xì)胞有兩套雌核生殖發(fā)生的母源基因組，腫瘤有胎兒成分。這說明，人類在發(fā)育初期來自父母雙方的基因組也不是均等的，也有基于父母性別的類似基因組印記現(xiàn)象的存在。基因印記的機(jī)制現(xiàn)在還不完全了解，從到目前為止的研究成果看，與DNA的甲基化13 ，染色質(zhì)構(gòu)造的改變4 ， DNA 復(fù)制時(shí)機(jī)的變化 5 和非編碼 RNA

39、 的調(diào)節(jié)作用 6 有關(guān)。親本的IGF- n等位基因在早期胚中被差異甲基化，在成體形成配子時(shí)仍保留原甲基化的模式。印記基因引起疾病主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是印記等位基因的再活化，即印記丟失( lossofimprinting,LOI ) ；二是印記基因的另一拷貝等位基因異常造成該基因失活，而非印記基因是兩等位基因同時(shí)失活引起疾病。下列現(xiàn)象出現(xiàn)可懷疑其致病基因?yàn)橛∮浕?。遺傳形式和父母的性別有關(guān)，例如，胰島素依賴性糖尿病是父源等位基因?yàn)橹虏』虻臅r(shí)候發(fā)病，異常源自母親等位基因的時(shí)候不發(fā)病。原因可能是這個(gè)致病基因源自父親的表達(dá)，源自母親的不表達(dá)。父源二體型或母源二體型引起的疾患。例如：西拉綜合征( S

40、ilver-Russellsyndrome )為 7 號(hào)染色體父源二體型，就是說7 號(hào)染色體的兩條都是源自父親，無源自母親的 7 號(hào)染色體。所以，此病可能是由于源自母親等位基因不能表達(dá)，而全無母親等位基因表達(dá)產(chǎn)物所致。由遺傳不均一性消失而偏向母源染色體增多或偏向父源染色體增多性癌癥。例如：母源選擇性11 號(hào)染色體缺失所引起的小兒腫瘤，其原因可能為母源等位基因表達(dá)的抑癌基因不能表達(dá)而致腫瘤發(fā)生。目前發(fā)現(xiàn)許多疾病的發(fā)病與基因印記相關(guān)。本文重點(diǎn)介紹目前為止研究較充分的貝 -威綜合征，普 -威綜合征和安格爾曼綜合征。貝 - 威綜合征( Beckwith-Wiedemannsyndrome,BWS )

41、:BWS 是以巨大舌，臍膨出和生長過剩為三大主要特征的先天性疾病，同時(shí)伴有內(nèi)臟腫大(主要為肝、腎和脾的腫大) ，出生時(shí)低血糖，單側(cè)肥大(身體的一側(cè)生長過剩)等生長異常。發(fā)病率為 0.07% ，無性別差異， 85% 為散在發(fā)病， 15% 為家族性遺傳，符合常染色體顯性遺傳7 。家族性遺傳為母親單側(cè)遺傳， 因此顯示了和基因印記有關(guān)8 。 BWS 致病基因尚不完全清楚， 已經(jīng)知道 BWS 的致病基因位于第11 號(hào)染色體短臂15.5 區(qū)域 （11p15.5 ） 9 ， 在這個(gè)基因組區(qū)域， IGF2、 H19 、INS 、 KvLQT1 、 LIT1 和 p57KIP2 等印記基因聚集存在， 其中 IG

42、F2 、 H19 、 p57KIP2 和 LIT1等基因與機(jī)體的發(fā)育和分化有關(guān)。 有許多關(guān)于它們和 BWS 相關(guān)研究的報(bào)道， 其中 p57KIP2 ，LIT1 作為其致病基因的可能性尤其引人注目。目前，關(guān)于基因印記的研究已成為分子遺傳學(xué)的一個(gè)重要領(lǐng)域，已有數(shù)十個(gè)印記基因被發(fā)現(xiàn)和克隆。已發(fā)現(xiàn)這些基因與機(jī)體發(fā)育的許多方面有關(guān)，如胎兒發(fā)育和胎盤生長，細(xì)胞分裂和個(gè)體行為。因此，正常印記模式的改變?cè)谂R床上會(huì)引起許多疾病。本文介紹基因印記在人類遺傳疾病發(fā)生中的作用的最新研究進(jìn)展。3 ）染色體丟失有的生物在個(gè)體發(fā)育的早期在體細(xì)胞中要丟失部分染色體，而在生殖細(xì)胞中保持全部的基因組，被丟失的染色體其上的遺傳信息

43、可能對(duì)體細(xì)胞來說沒有什么意義，而對(duì)生殖細(xì)胞的發(fā)育也許是不可缺少的，現(xiàn)在我們來看下面的兩個(gè)有名的例子。馬蛔蟲（ Parascarisequoorum ）受精卵細(xì)胞內(nèi)只有一對(duì)染色體（ 2n=2 ） （另一亞種2n=4 ） ，但染色體上有多個(gè)著絲粒。在發(fā)育早期僅一個(gè)著位點(diǎn)發(fā)揮作用，保證正常有絲分裂的進(jìn)行。發(fā)育后一階段，在縱裂的細(xì)胞中染色體分成很多小片段，其中部分含著絲點(diǎn)，不含著絲點(diǎn)的片段在分裂中丟失。而在橫裂的細(xì)胞中染色體并不丟失。第一次卵裂是橫裂，產(chǎn)生上下兩個(gè)子細(xì)胞，由于受精卵中含有的各種物質(zhì)并不是勻一分布，而是從上到下呈一種梯度分布，也就是說上面的動(dòng)物極和下面的植物極成分是不同的，它影響到分裂的

44、方向和染色體的丟失。第二次卵裂時(shí)下面的子細(xì)胞仍進(jìn)行橫裂，保持著原有的基因組，而上面的子細(xì)胞卻進(jìn)行縱裂，丟失了部分染色體（圖 18-1 ） 。長此下去最下面的子細(xì)胞總是保持了全套的基因組，將發(fā)育成生殖細(xì)胞，其余丟失了部分染色體片段的細(xì)胞分化為體細(xì)胞。此可能是由于在植物極中有特殊的物質(zhì)的存在，這種物質(zhì)具有保護(hù)染色體不受削減的功能。小表癭蚊( Mayetioledestructor )受精卵的細(xì)胞核分裂，而受精卵不分裂，形成合胞體 ( syncytium ) 。當(dāng)核第 3 次分裂后，有兩核移向卵后端的一個(gè)特殊區(qū)域，叫做極細(xì)胞質(zhì) ，在極細(xì)胞質(zhì)中的核保持了全套的染色體( 2n=40 ) ，將來分化為生殖

45、細(xì)胞。而在一般的細(xì)胞質(zhì)中，染色丟失了 32 條，只保留 8 條，將來分化為體細(xì)胞。若在細(xì)胞核移向極質(zhì)前，用細(xì)尼龍絲在極質(zhì)處進(jìn)行結(jié)扎，不讓核移入極質(zhì)或者用紫外線照射極質(zhì)，結(jié)果所有的核中都只保留了 8 條染色體。極細(xì)胞質(zhì)中有很多核糖體樣的顆粒，可以保護(hù)染色體不被削減，當(dāng)紫外線照射后破壞了其功能，染色體照樣也會(huì)丟失，最終不能發(fā)育為生殖細(xì)胞。4 ) 染色體的擴(kuò)增染色體的擴(kuò)增其本質(zhì)是指細(xì)胞內(nèi)特定基困拷貝數(shù)專一性大量增加的現(xiàn)象稱為 基因的擴(kuò)增 ( amplification ) 。最為人們熟知的例子是兩棲類和昆蟲卵母細(xì)胞rRNA 基因的擴(kuò)增。非洲爪蟾的每條染色體上有約 450 拷貝編碼 18SrRNA 和

46、 28SrRNA 的 DNA ，它們成簇存在，重復(fù)串聯(lián)在一起，形成 核仁組織區(qū)。 可是在卵母細(xì)胞中它們的拷貝數(shù)擴(kuò)大了 1000 倍以上。 卵母細(xì)胞十分特殊。它為胚胎的發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)，直到發(fā)育成蝌蚪階段。它的細(xì)胞質(zhì)中也存在著翻譯裝置。此是實(shí)行分化時(shí)必須的。在卵子發(fā)生時(shí)，當(dāng)內(nèi)含物不斷增加時(shí)，其體積也大大增加，形成了毗鄰在一起的 滋養(yǎng)細(xì)胞。 (令人驚奇的是受精時(shí)卵中有很多核糖體，一個(gè)不帶有18S 和 285RNA 的純合體也可以發(fā)育到蝌蚪階段，然后死亡。 )卵母細(xì)胞核為細(xì)胞的第一次減數(shù)分裂的前期提供必要的物質(zhì)，但進(jìn)一步的發(fā)育卻被制止了。兩棲類減數(shù)分裂的染色體是巨大的，在活性區(qū)域中有很多的側(cè)環(huán)，形成

47、燈刷染色體 。在卵母細(xì)胞的核中有數(shù)以千計(jì)大小不等的核仁。每個(gè)核仁含有大小不同的環(huán)狀rDNA ，它是染色體上18S 和 28SrDNA 的串聯(lián)重復(fù)單位經(jīng)滾環(huán)復(fù)制從染色體上釋放出來的。 DNA 的這種擴(kuò)增的過程尚不完全清楚。此DNA 的環(huán)產(chǎn)生 rRNA ，組裝成核 糖體，儲(chǔ)備在核仁中到減數(shù)分裂時(shí)再釋放出來。另一種擴(kuò)增的例子是在果蠅和其它雙翅同昆蟲的唾腺中。多線染色體( polytennechromosomes )具有特異的膨松區(qū)，發(fā)現(xiàn)此是產(chǎn)生過量的 DNA ，而不是mRNA。GeorgeRudkm早在1960年就指出：果蠅唾腺的多線染色體其常染色質(zhì)DNA可以特異擴(kuò)增上千倍，而在異染區(qū)附近只可復(fù)制幾

48、次。加上細(xì)胞分裂時(shí)染色體的正常復(fù)制，在染色體存在著特殊的擴(kuò)增位點(diǎn)，而其它的部分并不擴(kuò)增。在大部分體細(xì)胞中基因組的內(nèi)容是保持不變的，但是某些順序相對(duì)比例有時(shí)會(huì)發(fā)生變化。最有特色的例子是昆蟲的幼蟲發(fā)育，在它們的基因組中特定的特殊序列會(huì)過量復(fù)制( coverreplication )或者 復(fù)制不足 ( underrepliicaation ) 。復(fù)制不足發(fā)生在果蠅的多線染色體中。在此組織中，巨大染色體是由原來的二套染色體被多次復(fù)制而形成。黑腹果蠅。 ( D.melanogaster )的基因組約有1/4 的區(qū)域是由異染色區(qū)構(gòu)成的，形成染色體中心( chromocenaer ) ，其大部分構(gòu)成了衛(wèi)星D

49、NA 序列。與二倍體細(xì)胞相比，在唾腺細(xì)胞中，異染色質(zhì)的相對(duì)含量非常少。這是由于常染色質(zhì) DNA 順序在多線化的過程中大量復(fù)制，而異染色體部分卻不能大量復(fù)制。測定了衛(wèi)星DNA 的含量表明此序列不復(fù)制或很少復(fù)制，而常染色質(zhì)在唾腺中復(fù)制 9 次。多線組織的 rRNA 基因也是復(fù)制不足的， rDNA 的區(qū)域雖有67 次的復(fù)制， 但實(shí)際上無論存在一個(gè)還是兩個(gè)核仁形成區(qū)，最終達(dá)到的水平都是相同的。這種劑量控制形式可能僅特異于 rDNA 。黑腹果蠅的基因組在多線組織中可以分成三種類型控制復(fù)制區(qū)。一個(gè)很自然的假設(shè)是各類區(qū)域的復(fù)制原點(diǎn)控制起始的數(shù)量。衛(wèi)星DNA 中的起始區(qū)不易識(shí)別； rDNA 中的起始區(qū)對(duì)rDN

50、A 基因的數(shù)量作出反饋性反應(yīng)，停止其功能；一般的常染色質(zhì)的起始區(qū)可持續(xù)起始直到結(jié)束。在昆蟲中特殊蛋白的編碼序列存在著不同的擴(kuò)增。在Rhyncosciara 和其它昆蟲的唾腺中產(chǎn)生 DNA 膨松 ( DNApuffs ) 。這種膨松表面上和雙翅目中多線染色體存在的活性斑帶相似，但膨松卻含有局部的 DNA 擴(kuò)增。此擴(kuò)增的序列可能經(jīng)過4 次復(fù)制，使拷貝數(shù)增加了 16倍。在黑腹果蠅的發(fā)育中，其卵殼基因提供了一種不同的擴(kuò)增機(jī)制，卵殼蛋白是由多倍體的卵泡細(xì)胞合成和分泌的。昆蟲的卵殼基因成簇排列，在黑腹果蠅中已鑒別出兩組。在卵泡中其中一組位于 X 染色體上的基因在表達(dá)之前，經(jīng)4 次重復(fù)，擴(kuò)增了 16 倍；另

51、一組基因在第出染色體上，它們經(jīng) 6次重復(fù)，擴(kuò)增了 64倍。在這兩組中，擴(kuò)增區(qū)域延伸到卵殼基因另一側(cè)約 4550Kb 。擴(kuò)增最多的區(qū)域是在卵殼基因周圍約 20Kb 的區(qū)域。當(dāng)擴(kuò)增延伸到另一側(cè)時(shí)，擴(kuò)增顯示出一個(gè)下降的斜率。是什么在控制這種擴(kuò)增呢？下降的斜率表明在單個(gè)分子中擴(kuò)增區(qū)域的端點(diǎn)是異源的。從圖 18-2 中的橫型中可能得到解釋。雙向復(fù)制的重復(fù)起始發(fā)生在這個(gè)區(qū)域的中心部分。復(fù)制叉相距 1050Kb 。這個(gè)模型認(rèn)為整個(gè)的復(fù)制區(qū)是作為一個(gè)復(fù)制子 。此復(fù)制區(qū)是否含有一個(gè)順式一作用區(qū)負(fù)責(zé)復(fù)制呢？當(dāng)這個(gè)區(qū)域的染色體發(fā)生突變時(shí)應(yīng)不會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增。在雜合子中，染色體的突變也會(huì)阻止擴(kuò)增。若這區(qū)域被易位到別處的話。

52、它本身的復(fù)制叉也會(huì)發(fā)起擴(kuò)增。單眼缺乏(ocelliless )突變的性質(zhì)和這種推測是符合的。這種突變導(dǎo)致了復(fù)雜的表型變化，它是約 3 個(gè)斑帶區(qū)域的倒位，位于X 染色體上，含有卵殼基因的區(qū)域。 卵殼基因位于倒位左端3Kb 的區(qū)域。 這個(gè)倒位引起重要的改變是擴(kuò)增橫式的變化。圖 18-3 將野生型和小眼缺失突變的擴(kuò)增區(qū)域進(jìn)行了比較，原來的擴(kuò)增區(qū)在斷裂點(diǎn)的左側(cè)長 40Kb ；易位后擴(kuò)增區(qū)在斷裂點(diǎn)的右側(cè)，長約 50Kb 。擴(kuò)增的水平比原先有所減少，約是野生型極大值的一半(水平減少的原因尚不清楚) 。結(jié)果表明復(fù)制原點(diǎn)能發(fā)起卵殼蛋白附近區(qū)域擴(kuò)增。無論復(fù)制原點(diǎn)的位置發(fā)生什么變化，擴(kuò)增區(qū)域的延伸仍保持不變。1

53、) 基因組序列的選擇性擴(kuò)增真核基因組具有調(diào)節(jié)內(nèi)、外源基因組附加序列的能力。外源序列是通過轉(zhuǎn)染( transfection )傳導(dǎo)入細(xì)胞的。內(nèi)源序列是由某一存在序列通過擴(kuò)增而產(chǎn)生的。在這兩種情況下它們的共同特點(diǎn)是：附加序列有可能以串聯(lián)排列的形式含有很多重復(fù)單位的拷貝。包涵在重復(fù)單位中的基因并不是每個(gè)拷貝都需要表達(dá)。但表達(dá)隨著拷貝數(shù)趨向于增加。無論是由轉(zhuǎn)染還是擴(kuò)增而產(chǎn)生的多拷貝串聯(lián)序列在細(xì)胞中可能以兩種形式存在。若它形成染色體外的單位。則以一種不規(guī)則的方式遺傳：在真核細(xì)胞分裂時(shí)，細(xì)菌的質(zhì)粒是不能均等地分配到子細(xì)胞中，因此完整的單位很少存在。內(nèi)源序列的擴(kuò)增是由那些對(duì)一定的試劑敏感的選擇細(xì)胞所發(fā)動(dòng)的。

54、最好的例子是在一定的細(xì)胞系中加入氨甲喋呤( methotrexate ) 結(jié)果導(dǎo)致擴(kuò)增。 此試劑是二氫葉酸還原酶(DHFR)的抑制劑，可阻斷了葉酸鹽的代謝。 DHFR 的突變，改變活性使其對(duì)氨甲喋呤產(chǎn)生抗性。酶本身的改變是作為一種選擇，而酶量可以增加。酶量的增加是dhfr 結(jié)構(gòu)基因數(shù)目的擴(kuò)增所致。 擴(kuò)增發(fā)生頻率要比自發(fā)的點(diǎn)突變的頻率多得多， 一般的范圍是10-410-6 。 像這樣類似的基因擴(kuò)增現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)20 種以上的其它基因。在這些系統(tǒng)中大部分存在著共同的特點(diǎn)，就是簡單地一次加入試劑并不能獲得高度抗性的細(xì)胞，而是逐步地增加有毒試劑的劑量，使細(xì)胞漸漸適應(yīng)，從而產(chǎn)生抗性細(xì)胞。因此基因的擴(kuò)增是需要一

55、系列的步驟。擴(kuò)增也僅僅只發(fā)生在二個(gè)dhfr 等位基因中的一個(gè)上。對(duì)氨甲喋呤抗性的增加是依靠這一基因座位擴(kuò)增的程度來完成的。在抗氨甲喋呤細(xì)胞中 dhfr 基因數(shù)目的變化范圍是40400 拷貝，拷貝數(shù)的多少取決于選擇的程度和單個(gè)細(xì)胞系本身。mtxr (metnotrexate 抗性 ) 細(xì)胞系分為穩(wěn)定系和不穩(wěn)定系兩類，細(xì)胞在缺乏氨甲喋呤的條件下生長時(shí)除去原來的高水平DHFR 活性的壓力，它們的反應(yīng)不同，二者的差別如圖 18-4 所 示。1 )在穩(wěn)定系中擱增的基因得以保持，因?yàn)樗鼈兾挥谌旧w上dhfr 基因的位點(diǎn)上，而 其內(nèi)源染色體上的等位基仍保持正常的單個(gè)拷貝。（ 2 ）在不穩(wěn)定系統(tǒng)中，當(dāng)選擇壓力

56、釋放時(shí)，擴(kuò)增的基因至少會(huì)部分丟失。但未丟失的是以染色體外的排列方式存在?；驍U(kuò)增在染色體上有一個(gè)可見的效應(yīng)。在穩(wěn)定系統(tǒng)中， dhfr 位座能形成一個(gè)均染色區(qū) （homogeneouslystainingregion,HSR ） ，例如圖 18-5 所示的情況。稱其為均染區(qū)是由于在染色體上存在著一條增加的區(qū)域。用分帶技術(shù)來處理（如 G 帶）后，這一區(qū)域不顯示任何染色體帶，表明帶間的某一區(qū)域經(jīng)歷了一種擴(kuò)增。在不穩(wěn)定的細(xì)胞系中，看來常有dhfr 基因的染色體沒有什么明顯的改變，但是可以看到很多染色體外的點(diǎn)狀染色體，稱為雙微體（double-minutechromosomes） （圖 18-6 ） 。在典型的細(xì)胞系中，每個(gè)雙微體帶有24dhfr基因。雙微體可以復(fù)制；但它們沒有著絲粒，結(jié)果它們不能附著在有絲分裂的紡錘絲上，因此不能均等分離進(jìn)入子細(xì)胞。雖然它的名字叫雙微體，實(shí)際上可看作為染色體外的 微小