蔗糖酶蛋白含量的測(cè)定Folin酚法 ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 蔗糖酶蛋白含量的測(cè)定蔗糖酶蛋白含量的測(cè)定 Folin- Folin-酚法酚法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵笠?、?shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵? 1、學(xué)習(xí)、學(xué)習(xí)Folin-Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法；酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法；2 2、掌握分光光度法制造規(guī)范曲線，準(zhǔn)確測(cè)定未知樣品的蛋白質(zhì)含量；、掌握分光光度法制造規(guī)范曲線，準(zhǔn)確測(cè)定未知樣品的蛋白質(zhì)含量；3 3、掌握分光光度計(jì)的運(yùn)用方法。、掌握分光光度計(jì)的運(yùn)用方法。二、實(shí)驗(yàn)根本原理二、實(shí)驗(yàn)根本原理 Folin-Folin-酚測(cè)定法是在雙縮脲反響的根底上開(kāi)展起來(lái)的，酚測(cè)定法是在雙縮脲反響的根底上開(kāi)展起來(lái)的，F(xiàn)olin-Folin-酚試劑是酚試劑

2、是由甲、乙兩種試劑組成的。甲試劑由碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅和酒石酸鉀由甲、乙兩種試劑組成的。甲試劑由碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅和酒石酸鉀鈉組成，在堿性條件下蛋白質(zhì)中的肽鍵與酒石酸鉀鈉銅鹽起作用，生成紫紅鈉組成，在堿性條件下蛋白質(zhì)中的肽鍵與酒石酸鉀鈉銅鹽起作用，生成紫紅色絡(luò)合物；乙試劑是由磷鉬酸和磷鎢酸、硫酸、溴等組成，在堿性條件下，色絡(luò)合物；乙試劑是由磷鉬酸和磷鎢酸、硫酸、溴等組成，在堿性條件下，銅銅- -蛋白質(zhì)絡(luò)合物以及蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基酚基和色氨酸復(fù)原磷鉬酸蛋白質(zhì)絡(luò)合物以及蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基酚基和色氨酸復(fù)原磷鉬酸- -磷鎢酸試劑乙試劑產(chǎn)生深藍(lán)色鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物，其色澤深淺與磷鎢酸試劑乙

3、試劑產(chǎn)生深藍(lán)色鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物，其色澤深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。可用蛋白質(zhì)含量成正比。可用500nm500nm波長(zhǎng)比色測(cè)定，適于測(cè)定蛋白質(zhì)含量波長(zhǎng)比色測(cè)定，適于測(cè)定蛋白質(zhì)含量0.050.050.5g/L.0.5g/L.優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 簡(jiǎn)單、迅速、靈敏度高；反響較穩(wěn)定。簡(jiǎn)單、迅速、靈敏度高；反響較穩(wěn)定。缺陷：缺陷： 該反響受多種要素的干擾。該反響受多種要素的干擾。1. 1. 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)( (肽鍵肽鍵) ) OH OH 甲試劑甲試劑 ( (酒石酸鉀鈉銅鹽酒石酸鉀鈉銅鹽) ) 生成紫紅色絡(luò)合物生成紫紅色絡(luò)合物 蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸 紫紅色絡(luò)合物紫紅色絡(luò)合物 OH OH 乙

4、試劑乙試劑 產(chǎn)生深藍(lán)色鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物產(chǎn)生深藍(lán)色鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物 二、實(shí)驗(yàn)資料與試劑二、實(shí)驗(yàn)資料與試劑1 1、實(shí)驗(yàn)資料：、實(shí)驗(yàn)資料： 蔗糖酶提取的各步分別純化樣品蔗糖酶提取的各步分別純化樣品、?？筛鶕?jù)樣品溶液的蛋。可根據(jù)樣品溶液的蛋白質(zhì)含量高低作適當(dāng)?shù)南♂?。白質(zhì)含量高低作適當(dāng)?shù)南♂尅? 2、實(shí)驗(yàn)試劑：、實(shí)驗(yàn)試劑： 規(guī)范蛋白質(zhì)溶液：規(guī)范蛋白質(zhì)溶液：0.5g/L0.5g/L牛血潔白蛋白牛血潔白蛋白 Folin- Folin-酚試劑酚試劑 甲試劑甲試劑 乙試劑乙試劑三、實(shí)驗(yàn)器材與儀器三、實(shí)驗(yàn)器材與儀器1 1、試管及試管架；、試管及試管架；2 2、可見(jiàn)光分光光度計(jì)及、可見(jiàn)光分光光度計(jì)及1cm1cm

5、玻璃比色皿；玻璃比色皿；3 3、恒溫水浴箱、恒溫水浴箱(25(25。四、實(shí)驗(yàn)操作方法和步驟四、實(shí)驗(yàn)操作方法和步驟1 1、制備、制備Folin-Folin-酚法蛋白質(zhì)規(guī)范曲線酚法蛋白質(zhì)規(guī)范曲線 取取6 6支試管，編號(hào)支試管，編號(hào)1 16 6，按表，按表1 1順序依次參與各種試劑，并在分光光度計(jì)順序依次參與各種試劑，并在分光光度計(jì)于于500nm500nm處測(cè)定光吸收值處測(cè)定光吸收值 A500nmA500nm值。值。試管號(hào)試管號(hào)1 12 23 34 45 56 60.5g/L0.5g/L標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（mlml）0 00.20.20.40.40.60.60.80.81 1蒸餾水蒸餾水

6、 （mlml）1 10.80.80.60.60.40.40.20.20 0Folin-Folin-酚試劑甲酚試劑甲 （mlml）5 55 55 55 55 55 5混勻，在室溫混勻，在室溫(25(25）下靜置）下靜置10 min10 minFolin-Folin-酚試劑乙酚試劑乙 （mlml）0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5混勻，在室溫下靜置混勻，在室溫下靜置20min20minA A500nm500nm表表1 12 2、各步分別純化的蔗糖酶蛋白測(cè)定、各步分別純化的蔗糖酶蛋白測(cè)定 由于蔗糖酶提取、分別純化的各個(gè)樣品的蔗糖酶蛋白質(zhì)含量較高，因此由于蔗糖酶提

7、取、分別純化的各個(gè)樣品的蔗糖酶蛋白質(zhì)含量較高，因此在測(cè)蔗糖酶提取分別純化樣品在測(cè)蔗糖酶提取分別純化樣品、 的蔗糖酶蛋白質(zhì)含量以前，的蔗糖酶蛋白質(zhì)含量以前，可根據(jù)各樣品溶液的蔗糖酶蛋白質(zhì)含量高低不同作適當(dāng)?shù)南♂?，以測(cè)定蔗糖可根據(jù)各樣品溶液的蔗糖酶蛋白質(zhì)含量高低不同作適當(dāng)?shù)南♂?，以測(cè)定蔗糖酶蛋白質(zhì)含量酶蛋白質(zhì)含量A500nmA500nm值在蛋白質(zhì)含量規(guī)范曲線范圍以內(nèi)為宜。值在蛋白質(zhì)含量規(guī)范曲線范圍以內(nèi)為宜。 取取1313支試管，編號(hào)支試管，編號(hào)1 11313，按表，按表2 2依次參與各種試劑，并在分光光度計(jì)于依次參與各種試劑，并在分光光度計(jì)于500nm500nm處測(cè)定光吸收值處測(cè)定光吸收值 A50

8、0nm A500nm值。值。樣樣 品品空空白白I(1:20 I(1:20 稀釋稀釋) )(1:15 (1:15 稀釋稀釋) )(1:10 (1:10 稀釋稀釋) )(原液原液) )編編 號(hào)號(hào)1 12 23 34 45 56 67 78 89 91010111112121313樣品樣品液液V(ml)V(ml)0.00.00.050.050.20.20.50.50.050.050.20.20.50.50.050.050.20.20.50.50.050.050.20.20.50.5水水(ml)(ml)1.01.00.950.950.80.80.50.50.950.950.80.80.50.50.95

9、0.950.80.80.50.50.950.950.80.80.50.5FoliFolin n酚甲酚甲試劑試劑(ml)(ml)5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0混勻后，室溫（混勻后，室溫（25 25 ）放置）放置1010分鐘分鐘FoliFolin n酚乙酚乙試劑試劑(ml)(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5混勻后，室溫（混勻后，室溫（25 25 ）放置）放置2020分鐘分鐘A A500nm500nm0 0表表2 23 3、繪制規(guī)范曲線并計(jì)算、繪制規(guī)范曲線并計(jì)算 繪制規(guī)范曲線：繪制規(guī)范曲線： 以光吸收值以光吸收值 A500nm A500nm為縱坐標(biāo)，規(guī)范蛋白質(zhì)含量為縱坐標(biāo)，規(guī)范蛋白質(zhì)含量mg/Lmg/L為橫坐標(biāo)，為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制蛋白質(zhì)規(guī)范曲線。在坐標(biāo)紙上繪制蛋白質(zhì)規(guī)范曲線。 計(jì)算：計(jì)算： 蔗糖酶提取分別純化的樣品蔗糖酶提取分別純化的樣品、 稀釋溶液的光吸收值稀釋溶液的光吸收值 A500nm A500nm，查蛋白質(zhì)規(guī)范曲線得蔗糖酶蛋白含量，再進(jìn)展樣品，查蛋白質(zhì)規(guī)范曲線得蔗糖酶蛋白含量，再進(jìn)展樣品、 溶液的最終蔗糖