第七章__細胞重組與細胞融合

1、第七章第七章 細胞重組與細胞融合細胞重組與細胞融合一、細胞重組一、細胞重組二、二、細胞融合細胞融合一、細胞重組一、細胞重組（一）概述（一）概述 1 概念概念 通過一定的實驗技術，從活細胞中分離出細胞器及其組分，然后在體外一定條件下將不同細胞來源的細胞器及其組分進行重組，使其裝配成具有生物活性的細胞或細胞器，又稱細胞拆合。 2 特點特點 細胞重組最初只在細胞核、質之間的移植，現(xiàn)在發(fā)展到可以人為的對細胞任何的不同組分進行組合，大大擴展了在細胞工程研究中的應用。 3 意義意義 1）研究核質關系 2）研究細胞器的功能及相互作用關系 3）研究細胞器的組裝，甚至細胞的自我裝配機理，以揭示細胞起源與進化的機

2、制。 4）結合基因轉移技術，可人為地使細胞表達新的性狀和產(chǎn)生新的產(chǎn)物，實現(xiàn)掌握細胞、利用細胞、改造并進而創(chuàng)造出具有特定性狀和功能的工程細胞。（二）細胞重組技術（二）細胞重組技術 細胞重組的方式及有關概念細胞重組的方式及有關概念 1）胞質體與完整細胞的融合形成胞質雜種； 2）微細胞與完整細胞的融合形成微細胞異核體； 3）胞質體與核體（小細胞）融合形成重組細胞（核質雜種） 胞質體（cytoplast,cytosome)：除去細胞核后由細胞膜包裹的結構。 小細胞（minicell ）：又稱核體，具有細胞核、帶有薄層細胞質。 微細胞（microcell）：含有一個微核（僅有一條或幾條染色體）并帶有薄層

3、細胞質。1 顯微操作技術顯微操作技術 在顯微鏡下或借助于顯微操作儀，用細微玻璃針或微吸管、微電極等對細胞進行人為操作。2 細胞分離技術細胞分離技術 1）梯度沉降分離法 2）等密度沉降分離法 3）流式細胞儀分離法3 細胞破碎方法細胞破碎方法 1）超聲波破碎法 2）反復凍溶法 3）化學裂解法 4）高速組織倒碎法 4 細胞器的分離細胞器的分離5 胞質體、核體和微細胞的制備胞質體、核體和微細胞的制備 最常使用方法是： 物理法結合顯微操作技術 化學法結合離心技術制備 1）胞質體 首先用細胞松弛素B處理細胞誘發(fā)其排核，然后震蕩離心分離得到胞質體。 2）核體 在得到胞質體的同時，離心收集排除的有完整細胞核，

4、帶有少量細胞質并圍有完整細胞膜的結構便是核體。 3）微細胞 首先用秋水仙素處理，染色體停滯在有絲分裂中期，體外培養(yǎng)過程中，在單個染色體或染色體周緣會重現(xiàn)核膜而形成含有一個微核、一薄層細胞質和一個完整質膜的微細胞。6 細胞器拆合重組舉例細胞器拆合重組舉例 細胞器的移植主要是指葉綠體和線粒體的移植。 如卡爾森用白化型原生質體攝取正常的葉綠體，進而發(fā)育成正常的綠色植物；或有人用抗藥型草履蟲的線粒體植入敏感的草履蟲細胞，使后者獲得抗藥性等。 二、二、 細胞融合細胞融合(cell fusion)（一） 、細胞融合的概念細胞融合的概念 用人工方法把同種或不同種的兩個或兩個以上的細胞，通過介導物作用，融合成

5、一個細胞的技術。亦稱體細胞雜交（somatic hybridization）（二）、（二）、 細胞融合的意義（應用）細胞融合的意義（應用）1 進行基因定位，繪制人類基因圖進行基因定位，繪制人類基因圖基因定位的方法基因定位的方法家系分析法細胞融合法基因劑量效應法重組DNA法分子雜交法限制性片段長度多態(tài)性技術脈沖電泳法（PEGE）基因圖基因圖：指將人類染色體上所有基因按其具體位置、次序和間隔距離詳細地排列而成的圖，又叫染色體連鎖圖2 誘導誘導PC染色體染色體3 體細胞雜種的致瘤性分析體細胞雜種的致瘤性分析4 遺傳缺陷的基因互補遺傳缺陷的基因互補5 分化功能表達調控的研究分化功能表達調控的研究6 淋

6、巴細胞雜交瘤技術與單克隆抗體淋巴細胞雜交瘤技術與單克隆抗體由單個雜交瘤細胞增殖產(chǎn)生的克隆細胞群分泌的高度純一的抗體稱為單克隆抗體7 植物細胞的原生質體融合培育雜種植株植物細胞的原生質體融合培育雜種植株8 核質相互作用關系核質相互作用關系9 基因治療基因治療10 疾病診斷疾病診斷（三）、細胞融合的機理細胞融合的機理 膜融合是兩個不同的膜相互接觸和融合，導致兩膜脂和膜蛋白的相互混合及兩側內含物的混合。細胞融合的基本步驟包括： 1 細胞密切靠近 2 細胞橋形成 3 細胞質滲透 4 細胞核融合 融合機制種種融合機制種種1） “脂無序脂無序”模型模型 Lucy，1970-19752）Ca2+誘導的側向誘

7、導的側向“相分離相分離”模型模型 Papahadjopoulos 19783）六角形）六角形HII構象與膜融合構象與膜融合 Cullis and Hope19784）Ca2+誘導局部脫水與膜融合誘導局部脫水與膜融合 Wilschut and Hoekstra 19845）滲透模型與膜融合）滲透模型與膜融合 Lucy 19866）質子泵驅動膜融合）質子泵驅動膜融合 劉樹森1986 膜融合過程大體概括為兩大階段：首先是兩膜脂相互聚合和接觸，其次是接觸部位的局部脫水，形成不穩(wěn)定中間結構，使膜脂發(fā)生混合而最終導致膜的融合（四）、細胞融合的材料細胞融合的材料1 植物或微生物原生質體的制備2 動物單個細胞

8、的獲得 酶解消化法（胰蛋白酶、膠原酶）（五）、（五）、 細胞融合的方法細胞融合的方法1、生物法、生物法病毒誘導細胞融合病毒誘導細胞融合 仙臺病毒（仙臺病毒（Sendal virus）又稱日本血凝性病毒又稱日本血凝性病毒（HVJ），），是一種是一種RNA病毒，病毒，1962年岡田善雄發(fā)年岡田善雄發(fā)現(xiàn)，能引起艾氏腹水瘤細胞融合成多核細胞?，F(xiàn)，能引起艾氏腹水瘤細胞融合成多核細胞。 引起細胞融合的有效部位在于它的細胞膜成分，引起細胞融合的有效部位在于它的細胞膜成分，特別是磷脂成分，而與核酸活性無關。特別是磷脂成分，而與核酸活性無關。2、化學法、化學法PEG結合高結合高Ca2+、pH誘導法誘導法1）高級

9、脂肪酸衍生物2）脂質體3）鈣離子4）水溶性高分子化合物聚乙二醇（PEG） 最為常用 5）水溶性蛋白質和多肽（如牛血清蛋白） 20世紀70年代，華裔加籍科學家高國楠發(fā)現(xiàn)PEG能促進植物原生質體融合，開辟了植物細胞融合的研究。 目前化學法主要包括：NaNO3誘導、高Ca2+、和pH誘導、PEG誘導、PEG結合高Ca2+和pH誘導等，后者最為常用。A、 基本原理基本原理 PEG(polyethylene glycol)是一種多聚化合物，分子式為H(OHCH2-CH2)nOH，平均分子量在20020000之間。誘導機制可能是由于帶有大量負電荷的PEG分子和原生質體表面的負電荷間在鈣離子的作用下形成靜電

10、鍵，促使原生質體間的黏著而結合，導致電荷平衡失調并重新分配，使兩種原生質體上的正負電荷連接起來，進而形成具有共同質膜的融合體。B、 基本過程及注意事項基本過程及注意事項 （1）親本原生質體事先做好識別標記（色素、缺陷型、抗性標記等） （2）原生質體密度在105/ml左右，比例1：1 （3）PEG分子量通常為40006000，濃度50% （4）加入PEG后迅速混勻，置24培育1020min，然后緩緩加入高pH、高鈣離子溶液，15min后用洗滌液洗滌，離心收集。3、物理法、物理法電場誘導細胞融合電場誘導細胞融合 電融合是20世紀80年代發(fā)展起來的。優(yōu)點是融合率高、重復性強、傷害小、方法簡便易行、可

11、在顯微鏡下觀察融合的全過程。 原生質體在短時間內強電場（高壓脈沖電場，場強為kV/cm量級）作用下，極化產(chǎn)生偶極子，緊密排開成串珠狀，在適當時間和強度（如50mA、1.2kV/cm)的直流電脈沖作用下，細胞膜被擊穿，進一步形成融合體。4、物理法、物理法激光誘導細胞融合激光誘導細胞融合 更具高度選擇性、有效性（六）、融合細胞的選擇（六）、融合細胞的選擇1 融合體的類型融合體的類型 在整個融合液中，除了未融合的單親細胞外，主要包括三種類型的融合細胞。 1）同核體同源原生質體的融合 2）異核體非同源原生質體的融合 3）多核體含有雙親不同比例核物質的融合體 2融合體的篩選方法融合體的篩選方法 1 1）

12、遺傳互補篩選法）遺傳互補篩選法 2 2）抗性互補篩選法）抗性互補篩選法 3 3）生長特性篩選法）生長特性篩選法 4 4）物理特性篩選法）物理特性篩選法 5 5）其他方法）其他方法（七）、細胞融合技術的應用舉例（七）、細胞融合技術的應用舉例 制備細胞懸液制備細胞懸液 雙親細胞的選擇誘導細胞融合誘導細胞融合雜種細胞篩選雜種細胞篩選1）由抗藥性細胞組成的雜種細胞篩選）由抗藥性細胞組成的雜種細胞篩選2）由營養(yǎng)缺陷變異型細胞組成的雜種的篩選）由營養(yǎng)缺陷變異型細胞組成的雜種的篩選3）由溫度敏感突變型細胞組成的雜種的篩選）由溫度敏感突變型細胞組成的雜種的篩選雜種細胞的培養(yǎng)雜種細胞的培養(yǎng)1 1、動物細胞融合技

13、術的基本步驟、動物細胞融合技術的基本步驟 動物細胞融合舉例動物細胞融合舉例單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備1 單克隆抗體的制作原理單克隆抗體的制作原理2 單克隆抗體的制作過程單克隆抗體的制作過程1） 動物免疫與免疫脾細胞懸液的制備2）骨髓瘤細胞的獲得與培養(yǎng)3） 細胞融合4） 抗體的檢測及雜交瘤的選擇5） 單抗的大量生產(chǎn) 細胞合成細胞合成DNA有兩條途徑有兩條途徑主要途徑（生物合成）：主要途徑（生物合成）：糖、氨基酸核苷酸DNA 此途徑可因加氨基碟呤（A，一種葉酸的抵抗劑）被阻斷。 DNA合成過程中所需的脫氧胸苷酸（dTMP）是由脫氧尿苷酸（dUMP）經(jīng)甲基化形成。甲基供體是四氫葉酸，四氫葉酸是

14、由二氫葉酸還原酶還原二氫葉酸而來。 氨基碟呤在分子結構上是二氫葉酸的類似物，可與二氫葉酸競爭二氫葉酸還原酶發(fā)生不可逆結合，從而阻斷四氫葉酸的形成，不能提供甲基形成dUMP，最后阻斷DNA的合成。3 雜交瘤篩選原理雜交瘤篩選原理 當上面主要途徑被阻斷時可由此途徑代替補充，即可在次黃嘌呤核糖核酸轉移酶（HGPRT+）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK+）作用下，利用H（次黃嘌呤）合成嘌呤核苷酸，利用T（胸腺嘧啶）來合成胸腺嘧啶核苷酸，進而合成DNA。救急（應急）途徑救急（應急）途徑HAT篩選法篩選法 一個親本細胞株為次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶缺陷型（HGPRT） 另一個親本細胞株為胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（

15、TK） 在含有次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T）的HAT選擇培養(yǎng)液中，上述親本細胞都無法生存，只有融合以后的雜種細胞才能生長，因此可有效地選擇出雜種細胞。雜交瘤篩選過程雜交瘤篩選過程親本親本1 （突變型細胞株）（突變型細胞株）親本親本2骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞（或胸腺瘤細胞）（或胸腺瘤細胞）（HGPRT和和TK）（HGPRT+和和TK+）加加A后正常和應急兩條途徑后正常和應急兩條途徑均被阻斷不能合成均被阻斷不能合成DNA 加加A后主要（正常）途徑被阻斷，后主要（正常）途徑被阻斷，可走應急途徑合成可走應急途徑合成DNA ，但該細，但該細胞在一般培養(yǎng)條件下不能較長時間胞在一般培養(yǎng)條件下

16、不能較長時間存活，只有同瘤細胞融合后才獲取存活，只有同瘤細胞融合后才獲取無限增殖能力無限增殖能力故只有雜交細胞才能在故只有雜交細胞才能在HAT培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)基上增殖（骨髓瘤細胞從免疫脾細胞獲?。ü撬枇黾毎麖拿庖咂⒓毎@取HGPRT+和和TK+，脾細胞則從骨髓瘤脾細胞則從骨髓瘤細胞獲取無限增殖能力）細胞獲取無限增殖能力）免疫脾細胞免疫脾細胞（三）植物原生質體的培養(yǎng)與融合三）植物原生質體的培養(yǎng)與融合總過程包括： 原生質體的制備 原生質體的培養(yǎng) 原生質體的融合 雜種細胞的篩選 雜種細胞的分化1 原生質體培養(yǎng)的意義原生質體培養(yǎng)的意義 1）融合產(chǎn)生體細胞雜種 2）分離或引入各種細胞器 3）導入外源基因

17、 4）誘發(fā)突變體 5）研究細胞信息傳遞、能量代謝、物質運輸?shù)裙δ?6）研究細胞壁的合成機理 7）研究膜的功能和細胞膜的相互作用 8）研究核質關系 9）研究疾病與抗性生理2 原生質體的制備原生質體的制備 3 原生質體的培養(yǎng)原生質體的培養(yǎng) 1）培養(yǎng)方法）培養(yǎng)方法 液體培養(yǎng)法液體培養(yǎng)法 固體平板培養(yǎng)法固體平板培養(yǎng)法 雙層培養(yǎng)法雙層培養(yǎng)法4 原生質原生質體的融合體的融合 植物細胞雜交是指將兩個原生質體融合成一個細胞的過程，又稱體細胞雜交。Cocking（1971）建議程序的代表圖示 起源細胞（降解細胞壁） 親本原生質體（誘導融合）集聚粘連胞質融合（異核體培養(yǎng)）核融合、壁再生（雜種細胞選擇）細胞分裂（雜

18、種愈傷組織)誘導分化（器官、胚狀體形成）雜種植株5 再生植株的種類再生植株的種類 由于核融合的情況不同，形成不同的雜種植株。1） 親和的細胞雜種 具有雙親全套染色體，異源雙二倍體。2） 部分親和的細胞雜種 一個親本的染色體有少量重建或重組于另一親本的染色體組中。3） 胞質雜種 一親本的染色體被全部排斥，但胞質是雙親的4） 異核質雜種 具有一個親本細胞核和另一個親本細胞質的類型。 4）利用生長特性選擇6 融合細胞融合細胞和和雜種篩選雜種篩選1) 利用遺傳互補選擇 a 葉綠體缺失互補選擇b 營養(yǎng)缺陷型互補選擇c 抗性互補選擇2) 敏感差異選擇3) 利用物理特性選擇1978年，西德科學家獲得蕃茄馬鈴薯的雜種植株；1982年，美國培育出“土豆西紅柿”；1986年，日本培育出稻（C3）和稗（C4）之間的新品種，同時“生物白藍”（38）白菜（20）+甘藍（18）成功；1988年，聯(lián)邦德國培育出地下結馬鈴薯，地上結西紅柿的“馬鈴柿”。 近20幾年來，利用細胞雜交技術培育出眾多的雜種植株。