DNA甲基化與腫瘤分子標(biāo)志

1、DNADNA甲基化與腫瘤甲基化與腫瘤分子標(biāo)志分子標(biāo)志一、前言一、前言 腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的高發(fā)病和高死亡率性疾病，大量研究和防治資料證實(shí)，早期診斷和早期治療是防治腫瘤與降低死亡率的最有效辦法。因此，長(zhǎng)期以來(lái)尋找能早期診斷的腫瘤標(biāo)志物（Tumor marker，TM)成了人們關(guān)注的焦點(diǎn)。 以肺癌為例，在我國(guó)肺癌是第一大癌癥，超過(guò)癌癥死因的20%，且發(fā)病率與死亡率增長(zhǎng)迅速。肺癌的預(yù)后與診斷是的臨床分期密切相關(guān)：0期肺癌患者術(shù)后的5年生存率可達(dá)90%以上，a可達(dá)60%，而期病人總的5年生存率則從40%下降到5%以下。二、腫瘤標(biāo)志與腫瘤分子標(biāo)志二、腫瘤標(biāo)志與腫瘤分子標(biāo)志 腫瘤標(biāo)志物（腫瘤標(biāo)志物（T

2、umor Marker，TM）是指在惡性腫瘤發(fā)生和增殖過(guò)程中，由腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)而合成分泌的或是由機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞反應(yīng)而異常產(chǎn)生和（或）升高的，反映腫瘤存在和生長(zhǎng)的一類物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、激素、酶（同工酶）、多胺及癌基因產(chǎn)物等。（中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)腫瘤標(biāo)志物專家委員會(huì)）腫瘤分子標(biāo)志腫瘤分子標(biāo)志 20世紀(jì)九十年代初，有文章提出“Tumor Bio-Marker”一詞，即“腫瘤生物標(biāo)志”，以后隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的深入，國(guó)內(nèi)外眾多科學(xué)家稱遺傳學(xué)（genetic）和表遺傳學(xué)（Epigenetic）水平，即基因及基因以外的分子水平（核酸分子）的腫瘤標(biāo)志為“腫瘤分子標(biāo)志”。雖然對(duì)于這些名詞沒(méi)有公開(kāi)的

3、確認(rèn)，但其已越來(lái)越廣泛地被人們接受和應(yīng)用。三、三、DNA甲基化甲基化（一）DNA甲基化與CpG島（二）DNA甲基化與基因表達(dá)調(diào)控（三）DNA甲基化與腫瘤（四）DNA甲基化腫瘤分子標(biāo)志物（五）DNA甲基化檢測(cè)方法（一）（一）DNADNA甲基化與甲基化與CpGCpG島島1、DNA甲基化 在人類和大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，基因組序列中的CpG二核苷酸的胞嘧啶堿基（C）5位上存在甲基化。DNA甲基化是由S-腺苷蛋氨酸作為甲基供體，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化下完成的。甲基化是真核生物DNA的一種最常見(jiàn)的修飾方式，也是一種重要的表遺傳（Epigenetic，基因型不變，而表現(xiàn)型改變）機(jī)制。 2 2、CpGCpG島

4、島 甲基化位點(diǎn)通常發(fā)生在CpG二核苷酸的胞嘧啶堿基上，在哺乳動(dòng)物基因組中大約70% 的CpG二核苷酸位點(diǎn)是甲基化的，但CpG二核苷酸在整個(gè)基因組中的分布是不均勻的，基因組的大部分區(qū)域CpG序列出現(xiàn)頻率較低，但在某些特定區(qū)域，如結(jié)構(gòu)基因的5端，CpG二核苷酸以正常的頻率成串排列，這種區(qū)域被稱為CpG島。在人類基因組中大約有29000-45000個(gè)CpG島，占總DNA的1%左右，60%的基因（包括全部的看家基因和40%的組織特異性表達(dá)基因）都含有CpG島，每一個(gè)CpG島長(zhǎng)度約為1-2Kb，位于基因的5端，覆蓋基因啟動(dòng)子及第一外顯子。CpGMethylation CpG Island Promote

5、r Housekeeping gene 1-2kb : Methylated CpG : Unmethylated CpG 胞嘧啶堿基的轉(zhuǎn)化胞嘧啶堿基的轉(zhuǎn)化3、DNA甲基化的特點(diǎn)甲基化的特點(diǎn) 異常甲基化(Aberrant methylation) 過(guò)甲基化 (Hypermethylation) 低甲基化 (Hypomethylation) 甲基化方式 從頭甲基化(de novo methylation) 維持甲基化(maintenance methylation)（二）（二）DNADNA甲基化與基因表達(dá)調(diào)控甲基化與基因表達(dá)調(diào)控1、DNA甲基化與印跡（imprinting）基因;2、DNA甲基化

6、與胚胎的正常發(fā)育;3、DNA甲基化與雌性個(gè)體X染色體失活;4、DNA甲基化與基因轉(zhuǎn)錄失活. DNA DNA甲基化甲基化抑制轉(zhuǎn)錄的機(jī)制抑制轉(zhuǎn)錄的機(jī)制（三）（三）DNADNA甲基化與腫瘤甲基化與腫瘤1、DNA甲基化、基因突變與腫瘤;2、甲基化不足與腫瘤;3、抑癌基因過(guò)甲基化與腫瘤. TSG（tumour suppressor gene)的過(guò)甲基化被認(rèn)為是導(dǎo)致其表達(dá)失活的第三條途徑。Kundons假說(shuō)認(rèn)為一個(gè)抑癌基因完全失活需要兩次打擊，這個(gè)假說(shuō)幾乎在所有的人類腫瘤中被證明基本正確。長(zhǎng)期以來(lái)，認(rèn)為抑癌基因失活有兩條途徑：基因突變和染色體物質(zhì)丟失（雜合性丟失LOH或等位基因丟失），近年來(lái)的研究顯示，甲

7、基化是TSG失活的第三條機(jī)制，而且在某些情況下是抑癌基因失活的唯一機(jī)制。 目前的研究集中在以下3類基因:抑癌基因：Rb、VHL、p16、p15、p14、p53、p73、BRCA1、APC、FHIT、RAR-2、RASSF1A；DNA損傷修復(fù)基因：MGMT和hMLH1；腫瘤分子侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因：E-cadherin、 DAPK、 TIMP3代謝酶基因：GSTP1 這些基因涉及細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡、DNA損傷修復(fù)及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程。幾乎所有的人類腫瘤中都存在腫瘤相關(guān)基因的異常甲基化。 DNA DNA過(guò)甲基化與腫瘤過(guò)甲基化與腫瘤( (四）四）DNADNA過(guò)甲基化過(guò)甲基化腫瘤分子標(biāo)志

8、腫瘤分子標(biāo)志物物如前所述，基因啟動(dòng)子過(guò)甲基化的本質(zhì)是一種DNA分子異常，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，特別是腫瘤抑制基因的過(guò)甲基化是導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄失活的一個(gè)重要原因。這種甲基化比其它各種類型的DNA分子異常（如基因點(diǎn)突變、基因缺失、微衛(wèi)星序列改變、基因異常擴(kuò)增及染色體異常等）都更加廣泛地存在于幾乎所有種類的腫瘤中。許多研究顯示啟動(dòng)子異常甲基化在許多腫瘤的發(fā)生過(guò)程中是一個(gè)頻發(fā)的早期事件，因此腫瘤相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)是腫瘤發(fā)生的一個(gè)早期敏感指標(biāo)，被認(rèn)為是一種有前景的腫瘤分子生物標(biāo)志物. 1、CpG島異常甲基化 是腫瘤的發(fā)生過(guò)程中是一個(gè)頻發(fā)的早期事件（early event) 許多基礎(chǔ)研究證實(shí)腫瘤相關(guān)基因啟

9、動(dòng)子的過(guò)甲基化發(fā)生細(xì)胞癌變的早期早期,在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中是一個(gè)頻發(fā)的早期事件. 這種甲基化廣泛廣泛地存在于幾乎所有種類的腫瘤中。 2、CpG島異常甲基化 作為腫瘤標(biāo)志物的優(yōu)點(diǎn)（1）樣品多樣化且容易獲得 癌變細(xì)胞可以釋放DNA到外周血中，腫瘤患者外周血中游離DNA（free DNA)的含量比正常人中高4倍.研究發(fā)現(xiàn)外周血血漿/血清、腫瘤累積器官相關(guān)的體液（如唾液、痰、尿液及支氣管灌洗液等）中同樣可以檢測(cè)到腫瘤組織中存在的腫瘤相關(guān)基因的啟動(dòng)子異常甲基化。這些生物樣品比較容易獲得，因此檢測(cè)其中某些腫瘤相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)，可以為腫瘤的早期診斷提供非常有價(jià)值的信息。（2）較其它類型的腫瘤分子標(biāo)記物更易

10、檢測(cè) 如檢測(cè)點(diǎn)突變，即便是同一個(gè)基因，在不同腫瘤中甚至同類腫瘤的不同個(gè)體中，發(fā)生突變的位點(diǎn)也常常不同，以現(xiàn)有技術(shù)要全部檢測(cè)非常困難。然而某一基因在不同類型腫瘤中，其啟動(dòng)子異常甲基化的區(qū)域是相同的，檢測(cè)比較方便；另外與等位基因缺失這樣的標(biāo)志物相比，異常甲基化是一個(gè)陽(yáng)性信號(hào)，很容易與正常組織中的陰性背景區(qū)分。（3）特異性與靈敏度 腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多步驟多因素參與的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，涉及到許多基因的異常，如癌基因的激活以及抑癌基因的失活等，是多種遺傳變異的積累所致。對(duì)于絕大多數(shù)腫瘤，這些基因都是腫瘤相關(guān)性的，而非腫瘤特異性的。雖然不同種類的腫瘤中可能都存在某一基因的異常甲基化，但是不同類型的腫瘤中不同

11、基因的甲基化發(fā)生頻率是不同的，存在著明顯的基因腫瘤類型相關(guān)性，每種腫瘤都有一個(gè)獨(dú)特的基因甲基化譜。因此在以基因啟動(dòng)子的異常甲基化作為腫瘤發(fā)生的生物標(biāo)志物時(shí)，應(yīng)首先了解一些關(guān)鍵基因在各種腫瘤中的甲基化情況，然后在多種候選基因中優(yōu)化選擇34種相關(guān)程度高的基因，檢測(cè)其甲基化狀態(tài)。這樣可以做到在檢測(cè)較少指標(biāo)的同時(shí)保持標(biāo)志物的敏感性和特異性。靈敏度問(wèn)題指標(biāo)本身的敏感性檢測(cè)方法的敏感性不同類型腫瘤中相關(guān)基因的甲基化情況不同類型腫瘤中相關(guān)基因的甲基化情況腫瘤類型 候選基因 結(jié)腸癌 p16,p14,MGMT,APC 肺癌 p16,DAPK,MGMT,GSTP1 乳腺癌 p16,GSTP1,BRCA1,CDH1

12、 白血病 p73,p15 ,DAPK,CDH1 腎癌 VHL,p16,GSTP1,TIMP-3 宮頸癌 p16, APC, HIC-1, DAPK, MGMT,CDH1 食管癌 RASSF1A, RAR-2, DAPK, p16 胃癌 DAPK, CDH1, GSTP1, p15, p16 不同類型腫瘤與基因甲基化不同類型腫瘤與基因甲基化 每一類型的腫瘤中都同時(shí)存在著多種腫瘤相關(guān)基因的異常甲基化，而且不同部位的腫瘤組織中，各種基因的甲基化發(fā)生頻率是不同的，存在著明顯的基因腫瘤類型相關(guān)性。1、胃腸道腫瘤（如結(jié)腸癌、胃癌等）中p16INK4a、p14ARF、MGMT、APC和hMLH1基因的甲基化

13、比率較高；2、呼吸系統(tǒng)腫瘤（肺癌、頭頸部癌）中p16INK4a、DAPK、MGMT基因的甲基化較常見(jiàn)；3、乳腺癌、卵巢癌中p16INK4a、GSTP1、BRCA1、CDH1等基因啟動(dòng)子異常甲基化較為頻繁；4、而惡性血液系統(tǒng)疾病中基因異常甲基化的情況與其它實(shí)體瘤明顯不同，這些腫瘤中p73、p15的異常甲基化頻繁，這兩種基因的異常甲基化在其他腫瘤中則很少見(jiàn)。存在的問(wèn)題特異性更適于高危人群的篩查五、五、DNADNA甲基化檢測(cè)方法甲基化檢測(cè)方法1、甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶法（MSREs)2、限制酶-PCR法(MSREsPCR)3、基因組直接測(cè)序法4、HSO3-修飾基因組測(cè)序法5、甲基化特異性PCR法（

14、MSP)6、結(jié)合HSO3-限制性分析法（COBRA)7、甲基化敏感的單核苷酸引物法（Ms-SNuPE) 8、熒光定量PCR(Methylight)9、變性高效液相色譜法（DHPLC)1、甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶法（MSREs) 該法是利用對(duì)m5C敏感的限制性核酸內(nèi)切酶酶切基因組DNA，當(dāng)酶切位點(diǎn)處發(fā)生甲基化時(shí)，該內(nèi)切酶不能切斷DNA雙鏈；當(dāng)酶切位點(diǎn)處未發(fā)生甲基化時(shí)，DNA雙鏈被切斷。然后經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，判斷該位點(diǎn)的甲基化情況。 優(yōu)點(diǎn):簡(jiǎn)便、快捷。 缺點(diǎn):僅能檢測(cè)甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)處 的胞嘧啶的甲基化，而不能反映整個(gè)CpG島的甲 基化狀態(tài);酶切不完全導(dǎo)致假陽(yáng)性。2、限制酶-

15、PCR法(MSREsPCR) 該法在方法1的基礎(chǔ)上結(jié)合PCR技術(shù)，提高了檢測(cè)的靈敏度。先用甲基化敏感性內(nèi)切酶切割DNA，然后用位于限制性位點(diǎn)側(cè)翼的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該引物僅能擴(kuò)增因甲基化而免于切割的DNA片段，但不能擴(kuò)增未甲基化而被切斷的片段。 優(yōu)點(diǎn):靈敏度有所提高,定性檢測(cè)只需0.6ngDNA。 缺點(diǎn):DNA必須酶切完全，否則易產(chǎn)生假陽(yáng)性;而且同 樣只能檢測(cè)酶切位點(diǎn)處的胞嘧啶的甲基化,僅能分 析所有甲基化位點(diǎn)的6%左右。3、基因組直接測(cè)序法 此方法是基于m5C在標(biāo)準(zhǔn)的Maxam-Gilbert胞嘧啶化學(xué)裂解反應(yīng)（N2H4/哌啶法）中不被裂解，故m5C可通過(guò)在測(cè)序膠上缺少對(duì)應(yīng)于胞嘧啶降

16、解反應(yīng)產(chǎn)物的一條帶而得以鑒定，如果采用MnO4 /哌啶法法則相反，經(jīng)比較可以確定甲基化的胞嘧啶。 優(yōu)點(diǎn):該法克服了限制性內(nèi)切酶法的缺陷; 缺點(diǎn):比較繁瑣，測(cè)序膠上的任何背景或相距很近的條 帶均可導(dǎo)致解釋上的困難，另外該法不能用于少 量或混合DNA樣品的分析,DNA的需求量（2 5g ）。4、HSO3-基因組測(cè)序法 本法的基本原理是依據(jù)單鏈DNA在HSO3-存在的條件下，能有效地將C變成U，而m5C保持不變。隨后用兩對(duì)特異性引物分別擴(kuò)增兩條修飾后的單鏈，然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物測(cè)序，未甲基化的胞嘧啶經(jīng)修飾擴(kuò)增后的產(chǎn)物是T，而甲基化的C經(jīng)修飾擴(kuò)增后仍然是C。 優(yōu)點(diǎn):容易確定基因組DNA分子中各個(gè)單鏈的甲

17、基化狀 態(tài)，可以確定各甲基化的準(zhǔn)確位點(diǎn); 缺點(diǎn):需要較大量的DNA(2-5微克)，操作比較繁瑣。 NH2 NH2 N HSO3- H+N O N OH- O N SO3- 胞嘧啶 6-磺酸胞嘧啶 H2O NH4+ O O HN HSO3- HN O OH- O SO3 HN HN 尿嘧啶 6-磺酸尿嘧啶 5、甲基化特異性PCR法（Methylation-specific PCR,MSP) 基于HSO3-修飾后甲基化與非甲基化CpG的序列差異,可以分別設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)，即可區(qū)分甲基化與非甲基化DNA。 優(yōu)點(diǎn):靈敏度高(50ng)，能用于石蠟包埋組織及血清等 體液中D

18、NA的甲基化；操作相對(duì)簡(jiǎn)便。 缺點(diǎn):若HSO3-處理不徹底，易導(dǎo)致假陽(yáng)性；MSP法是 以引物中所有CpG位點(diǎn)胞嘧啶完全甲基化為前提 的，而事實(shí)上甲基化的CpG島中卻并非每個(gè)CpG 位點(diǎn)都完全甲基化，所以，MSP法常常存在目標(biāo) 片段難擴(kuò)增的問(wèn)題。 MSP法原理法原理 Denaturation of Genomic DNA; Bisulfite Modification; PCR Amplification; Denaturation and Modification CG CG UG UG ( Methylation) ( Unmethylation) PCR primer-M primer-U

19、 CG CG UG UG Gel electrophoresis6、結(jié)合HSO3-限制性分析法（COBRA) 該法首先用HSO3-處理基因組DNA，然后PCR擴(kuò)增待檢測(cè)含CpG位點(diǎn)的序列，由于HSO3-處理引起的序列改變可導(dǎo)致新的甲基化限制性酶切位點(diǎn)的產(chǎn)生或可引起原來(lái)已存在的酶切位點(diǎn)如BstU的丟失，故原始DNA甲基化水平可通過(guò)消化的與未消化的PCR產(chǎn)物的相對(duì)數(shù)量來(lái)表示。 優(yōu)點(diǎn):快速的、靈敏的半定量方法; 缺點(diǎn):定量信息依賴于限制性內(nèi)切酶的完全消化，且甲 基化分析也受DNA中限制性酶切位點(diǎn)的限制,能滿 足上述要求的位點(diǎn)非常有限。7、甲基化敏感的單核苷酸引物法（Ms-SNuPE) 基因組DNA經(jīng)

20、處理后,未甲基化的CU，U在隨后的PCR中象T一樣被復(fù)制；而5mC則保持不變，在PCR中象C一樣被復(fù)制。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離后，同合適的SNuPE引物、Taq聚合酶和32P-dCTP以及32P-dTTP一起孵育后，在進(jìn)行變性PAGE和放射自顯影分析，這樣就很容易地對(duì)某個(gè)特定的CpG位點(diǎn)中甲基化與非甲基化的C的原始狀態(tài)比例進(jìn)行定量分析。 優(yōu)點(diǎn):靈敏、半定量分析； 缺點(diǎn):操作十分繁瑣，既要凝膠電泳分離，又要進(jìn)行放射性 標(biāo)記。8、PCRRFLP法 用HSO3-處理基因組DNA，處理后的DNA的PCR產(chǎn)物中限制性酶切位點(diǎn)改變，從而可用于那些不需要對(duì)序列中特定區(qū)域內(nèi)每個(gè)CpG島甲基化進(jìn)行快速分析。優(yōu)

21、點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便；缺點(diǎn)是僅能分析25%的甲基化位點(diǎn)。9、 HSO3-PCRSSCP：操作繁瑣，分辨率不高。10、熒光定量PCR(Methylight)：靈敏、準(zhǔn)確；但需專門 儀器，檢測(cè)費(fèi)用昂貴。11、變性高效液相色譜法（DHPLC)：僅能檢測(cè)擴(kuò)增區(qū)域 內(nèi)的甲基化總量，不能對(duì)甲基化的CpG位點(diǎn)精確定位。第二部分：第二部分：巢式甲基化特異性巢式甲基化特異性PCR檢檢測(cè)測(cè)DNA甲甲基化基化 一、目的 目前用于檢測(cè)DNA甲基化的最常用方法是甲基化特異性PCR法（MSP），但在檢測(cè)血清等樣品時(shí)，由于DNA含量低，方法靈敏度有待提高。本研究將巢式PCR用于甲基化分析，建立巢式甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（nMS

22、P）法，探討了最佳PCR擴(kuò)增條件，并用該法分析了新鮮癌組織、石臘包埋組織及腫瘤患者血清中p16基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)。 二、方法二、方法1、DNA提?。?新鮮癌組織、石蠟包埋組織及血清樣品DNA提取。2、基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾： 堿變性； 硫化與脫氨； 純化與脫硫；沉淀回收DNA 。3、巢式PCR擴(kuò)增 （1）引物設(shè)計(jì)：引物設(shè)計(jì)是以亞硫酸氫鹽修飾后的基因組DNA為模板，外側(cè)引物序列不包含CpG位點(diǎn)，故可同時(shí)擴(kuò)增甲基化及非甲基化目的片段；內(nèi)側(cè)引物包含CpG位點(diǎn)，分別為甲基化及非甲基化特異性的。 （2）第一次擴(kuò)增：同時(shí)擴(kuò)增甲基化及非甲基化目的片段，產(chǎn)物長(zhǎng)280bp。 （3）將第一輪PCR產(chǎn)物適

23、當(dāng)稀釋（50倍），取10l進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng) 。 （4）以正常人外周血淋巴細(xì)胞（PBL）DNA作陰性對(duì)照，以水作空白對(duì)照。人移行細(xì)胞膀胱癌細(xì)胞株（T-24）的p16基因啟動(dòng)區(qū)是高度甲基化的，故以T-24細(xì)胞DNA作為陽(yáng)性對(duì)照。 （5）同時(shí)用MSP法檢測(cè)腫瘤患者血清樣品中p16基因的甲基化。 （6）凝膠電泳分析。 三、結(jié)果三、結(jié)果1、nMSP法檢測(cè)結(jié)果 T S N P H2O MK M U M U M U M U M U M U 2、nMSP法與MSP法的檢測(cè)結(jié)果比較 分別用MSP和nMSP法檢測(cè)了34例非小細(xì)胞肺癌患者的血清中p16基因的甲基化狀態(tài)，MSP和nMSP法甲基化檢出率分別為53(

24、18/34)和74(25/34) (P0.05,2test)。7例MSP法檢測(cè)為非甲基化的血清標(biāo)本7例MSP法檢測(cè)為非甲基化的血清標(biāo)本經(jīng)nMSP法擴(kuò)增出了甲基化的DNA片段. C1 P C2 H2O MK 3、陽(yáng)性樣品測(cè)序結(jié)果 .3-GCAGGAGGTCTCAGCGGGCGGTAGGGGACGAGGGCGACGTCTGGGAGATGGGTGGACCTAGC-5.3-GCAGGAGGTTTTAGCGGGCGGTAGGGGATGAGGGCGATGTTTGGGAGATGGGTGGATTTAGC-5 .5-CGTCCTCCAAAATCGCCCGCCATCCCCTACTCCCGCTACAAACCCTCT

25、ACCCACCTAAATCG-3四、結(jié)論四、結(jié)論1、巢式甲基化特異性PCR（nMSP)是一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的甲基化檢測(cè)方法，可廣泛應(yīng)用于不同類型標(biāo)本基因啟動(dòng)子甲基化分析。 2、利用巢式甲基化特異性PCR（nMSP）法可用于檢測(cè)外周血血清中腫瘤相關(guān)基因的甲基化狀態(tài) 。3、nMSP法比MSP法具有更高的靈敏度。第三部分：建立一種第三部分：建立一種DNA甲基甲基化的定量分析方化的定量分析方法法一、目的 建立一種基于錯(cuò)配雜交和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的DNA甲基化定量分析方法。二、原理二、原理1、Denaturation of Genomic DNA;2、Bisulfite Modification; 3、P

26、CR Amplification;4、Hybridization;5、Detection. Genomic DNA(M and U) Denature and modification CG UG PCR amplification (Biotinylated primer without CpGs) B CG B TG GC AC Hybridization SPA B CG SPA B TG GC AC Dig Dig Detection HRP-anti-Dig HRP-anti-Dig Substrate Substrate 三、方法三、方法 1 、細(xì)胞培養(yǎng)、脫甲基化處理及DNA、RN

27、A的提取 人移行膀胱癌細(xì)胞株 (T-24)、人肺腺癌細(xì)胞株 (SPC-A1), 人移行膀胱癌細(xì)胞株(BIU-87)、人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞株 (Hep-G2) ，用Trizol總RNA提取試劑盒提取RNA和DNA，以甲醛凝膠電泳檢測(cè)提取RNA完整性。同時(shí)提取DNA，紫外分光光度法測(cè)定濃度和純度。 2、外周血白細(xì)胞DNA提取 按照參考文獻(xiàn)采用鹽析法提取 3 、用SssI處理正常人外周血白細(xì)胞DNA4 、基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾5 、引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增上游引物： 5-Biotin-GAA GAA AGA GGA GGG GTT GG-3;下游引物：5- CTA CAA ACC CTC TAC CC

28、A CC -3，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為280bp。 從GenBank檢索到p16基因序列（GenBank accession no.AF527803,19501-20701），設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)以亞硫酸氫鹽修飾后的DNA為模板 (CT)。引物序列：上游引物（19883-19902），下游引物（20136-20155）。擴(kuò)增參數(shù)：95熱啟動(dòng)10分鐘，加入1.0U TaqDNA聚合酶，于95、60、72各30s循環(huán)30次，最后于72延伸6分鐘。以正常人外周血淋巴細(xì)胞（PBL）DNA作陰性對(duì)照，以重蒸水作空白對(duì)照。以SssI處理的正常人外周血白細(xì)胞DNA作為陽(yáng)性對(duì)照。 6、探針設(shè)計(jì) 根據(jù)5中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列，

29、針對(duì)特定CpG位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成兩條地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針，兩條探針有3處堿基差異( 對(duì)應(yīng)3個(gè)CpG位點(diǎn)),分別與甲基化和非甲基化序列互補(bǔ)（應(yīng)避免非特異的同源序列）。寡核苷酸探針序列為： 5-Dig-TCG GACCTCCG GACCG GTAAC -3（Pm） 5-Dig-TCA AACCTCCA AACCA ATAAC -3（Pu）7、雜交(Hybridization);8、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)(Detection);9、PCR產(chǎn)物測(cè)序(Sequencing);10、甲基化特異性PCR(MSP); 11、 RT-PCR檢測(cè)腫瘤細(xì)胞p16基因的表達(dá) 細(xì)胞經(jīng)5-Aza-CdR處理后,用Trizol試劑盒提

30、取細(xì)胞總RNA。取2ug總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。再以cDNA為模板擴(kuò)增p16基因，并同時(shí)擴(kuò)增-actin為內(nèi)參。p16基因引物序列：上游序列：5-AGCCTTCGGCTGACTGGCTGG-3；下游引物：5-GGCCCATCATCATGACCTGG-3，-actin的引物序列：上游序列：5-CACCCCCACTGAAAAAGATGA -3；下游引物：5-CATCTTCAAACCTCCATGACG -3, PCR反應(yīng)條件：94 變性6min，94 1min，62 30s，72 50s，34個(gè)循環(huán)，72 延伸7min。取擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)。 三、結(jié)果三、結(jié)果1、PCR擴(kuò)增

31、結(jié)果及MSP bp MK T P N H2O T T N N P P H H2 2O O bp MK M U M U M U M U 2、 Luminol-H2O2-HRP發(fā)光體系反應(yīng)動(dòng)力學(xué)3、發(fā)光體系的線性范圍及檢測(cè)限 當(dāng)PCR產(chǎn)物的量為1.2510-30.1 pmol時(shí)，回歸方程為y=576548.2X+ 12016，相關(guān)系數(shù)r=0.994；PCR產(chǎn)物的量為0.110.0pmol時(shí)，回歸方程為y=4258985X +97950，相關(guān)系數(shù)r=0.998，檢測(cè)限為2.510-4pmol 。分別取5l甲基化和非甲基化PCR產(chǎn)物按上述方法各測(cè)定10次，變異系數(shù)(CV) 分別為5.2%和6.4%。

32、4、雜交溫度的選擇 對(duì)于寡核苷酸探針來(lái)說(shuō)，單個(gè)堿基的錯(cuò)配即能使解鏈溫度Tm值顯著降低，降低雜交體的穩(wěn)定性，本方法中使用的兩根探針中有3個(gè)錯(cuò)配位點(diǎn)，因此選擇合適的雜交溫度可以有效地降低本底值，提高雜交特異性。將兩條探針?lè)謩e與它們的互補(bǔ)序列及非互補(bǔ)序列在42、46、48、50及52條件下雜交，然后檢測(cè)RLU，結(jié)果顯示在48時(shí)，兩條探針(Pm、Pu)與各自的互補(bǔ)PCR產(chǎn)物雜交后產(chǎn)生的發(fā)光值相當(dāng)，而與其非互補(bǔ)序列已難以形成穩(wěn)定的雜交體，其相對(duì)發(fā)光值（RLU）與空白管相當(dāng)，對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。 5、測(cè)定混合DNA樣品中甲基化百分率 為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，將等摩爾濃度的甲基化p16 DNA (來(lái)源于T-24

33、細(xì)胞DNA) 和非甲基化p16 DNA 以不同的比例物 (10，31，11，13，01)混合，然后經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾，并按上述方法檢測(cè)樣品中p16基因的甲基化百分率。將檢測(cè)結(jié)果與理論值作圖，由圖可見(jiàn)本方法的檢測(cè)結(jié)果與理論值完全相符。 02550751000255075100Input methylation index (%)Measured methylationindex(%)6、檢測(cè)腫瘤細(xì)胞株p16基因甲基化程度與表達(dá)水平 采用上述方法檢測(cè)了經(jīng)脫甲基化試劑5-Aza-CdR 處理前后腫瘤細(xì)胞的p16基因的甲基化程度（MI），同時(shí)用RT-PCR檢測(cè)了p16基因的轉(zhuǎn)錄水平。腫瘤細(xì)胞株中p16基

34、因的甲基化程度與其表達(dá)水平呈逆相關(guān)。 四、結(jié)論 本文建立了一種基于錯(cuò)配雜交-化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的p16基因啟動(dòng)子區(qū)特定CpG位點(diǎn)過(guò)甲基化的定量分析方法。可用于定量檢測(cè)外周血血清/血漿中p16基因啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化，此外本方法還可用于腫瘤治療效果的評(píng)價(jià)、預(yù)后觀察、腫瘤復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)、高危人群的篩查以及其它的甲基化有關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。 第四部分第四部分p16基因基因CpG島過(guò)甲基化島過(guò)甲基化與其轉(zhuǎn)錄失活的研究與其轉(zhuǎn)錄失活的研究 一、目的 本文利用甲基化特異性PCR(MSP)、RT-PCR以及本研究小組建立的DNA甲基化的定量檢測(cè)方法研究了四株腫瘤細(xì)胞 (T-24、SPC-A1、BIU-87、Hep-G2) 的

35、p16基因的甲基化狀態(tài)，以及經(jīng)過(guò)脫甲基化試劑5-氮雜胞苷（ 5-Aza-CdR）處理前后p16基因表達(dá)水平的變化，比較、探討了四株細(xì)胞甲基化程度對(duì)其表達(dá)失活的影響。 二、方法1 、細(xì)胞培養(yǎng)、脫甲基化處理及DNA、RNA的提取。2、外周血白細(xì)胞DNA提取。3、 基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾。4、甲基化特異性PCR（MSP）定性檢測(cè)腫瘤細(xì)胞p16基因甲基化。5、利用本文建立的甲基化定量檢測(cè)方法定量分析脫甲基化處理前后甲基化程度的改變。6、RT-PCR法檢測(cè)脫甲基化處理前后p16基因表達(dá)水平的變化。三、結(jié)果三、結(jié)果 1、MSP法檢測(cè)結(jié)果（脫甲基化處理前及處理后） 2、RT-PCR檢測(cè)脫甲基化處理前后

36、p16基因表達(dá)水平 3、定量檢測(cè)脫甲基化處理前后甲基化程度（MI）變化 S P C - A 1 H e p - G 2 T-24 BIU-87 Methylation (untreated) 64 36 98 index (%) (treated) 11 7 10 P16/-actin (untreated) 0.480.05 0.590.04 0 ( t re a te d ) 0 . 8 6 0 . 0 3 0 . 9 2 0 . 0 5 0.580.03 四、結(jié)論四、結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)研究了腫瘤細(xì)胞株T-24、SPC-A1、BIU-87、Hep-G2的甲基化狀態(tài)及其表達(dá)，其中SPC-A1、BI

37、U-87尚未見(jiàn)報(bào)道。BIU-87在用5-Aza-CdR處理前后通過(guò)MSP都未有目的條帶擴(kuò)增出，通過(guò)RT-PCR也未見(jiàn)p16基因的表達(dá)，在BIU-87中可能是存在p16基因的缺失。其它三種細(xì)胞通過(guò)MSP顯示都有不同程度的甲基化，其中T24甲基化程度最高，因?yàn)樵谟胮16M、p16U兩對(duì)引物擴(kuò)增過(guò)程中，只有p16M有目的條帶，顯示了該株腫瘤細(xì)胞p16基因CpG島發(fā)生了完全程度的甲基化。另外兩種細(xì)胞株SPC-A1，Hep-G2用p16M和p16U都有目的條帶擴(kuò)增出來(lái)，顯示這兩種細(xì)胞株的p16基因CpG島存在不同程度的甲基化。 用RT-PCR檢測(cè)四種腫瘤細(xì)胞P16基因的表達(dá)，除BIU-87外，其它三株腫

38、瘤細(xì)胞在用5-Aza-CdR處理后比處理前P16基因表達(dá)有了顯著升高，甲基化程度的高低與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物呈明顯的逆相關(guān)。同時(shí)形態(tài)學(xué)觀察上也發(fā)現(xiàn)用5-Aza-CdR處理后通過(guò)脫甲基化使細(xì)胞增殖明顯減緩，倍增時(shí)間明顯延長(zhǎng)。 第五部分第五部分定量檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌病人血清中定量檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌病人血清中p16基因過(guò)基因過(guò)甲基化甲基化 一、目的 腫瘤相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)是腫瘤發(fā)生的一個(gè)早期敏感指標(biāo)，是一種有前景的腫瘤分子標(biāo)志物（biomarker）。特別是由于腫瘤細(xì)胞可以釋放大量游離DNA到外周血、腫瘤累及器官相關(guān)的體液（如唾液、痰等）中，因此痰、外周血等無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)樣品都可以作為檢測(cè)異常甲基化的標(biāo)本，這將給檢測(cè)

39、帶來(lái)極大的便利。本研究旨在通過(guò)篩選與肺癌相關(guān)性高的腫瘤相關(guān)基因（p16基因），定性、定量檢測(cè)它們?cè)谕庵苎逯械募谆癄顟B(tài)，探討基因啟動(dòng)子區(qū)過(guò)甲基化在肺癌早期診斷中的應(yīng)用。 二、方法1 、血清中游離DNA的提取。2、正常人外周血白細(xì)胞DNA提取。3、 基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾。4、甲基化特異性PCR（MSP）定性檢測(cè)腫瘤細(xì)胞p16基因甲基化。5、利用本文建立的甲基化定量檢測(cè)方法定量分析脫甲基化處理前后甲基化程度的改變。三、結(jié)果1、nMSP法檢測(cè)結(jié)果 nMSP法肺癌組外周血血清中p16基因的甲基化陽(yáng)性率為75.8%，良性肺病變組為9.5%，兩者有顯著性差異（p0.01），在12例健康對(duì)照組中

40、未檢測(cè)到甲基化的p16基因。40例鱗癌（SCC）與22例腺癌（ADC）p16基因的甲基化陽(yáng)性率分別為78 %(31/40) 和72.7% (16/22)，無(wú)顯著性差異（p0.05）。期肺癌病人與期肺癌病人p16基因的甲基化陽(yáng)性率分別為71.1% (32/45) 和88.2% (15/17)，無(wú)顯著性差異（p0.05）。 P N H2O Bp MK M U M U M U M U M U 2、錯(cuò)配雜交-化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)血清中p16基因的過(guò)甲基化 利用本研究建立的DNA甲基化的定量分析方法檢測(cè)了47例甲基化陽(yáng)性血清中p16基因的過(guò)甲基化指數(shù)（Methylation Index，MI%），肺癌組M

41、I為11.82.2%（范圍1.3615.5%），良性肺病變組為0.30.15% (范圍0.150.47%)，兩者有顯著性差異（p0.01），在12例健康對(duì)照組中未檢測(cè)到甲基化的p16基因。本法檢測(cè)結(jié)果與MSP法檢測(cè)結(jié)果顯著相關(guān)(p0.005)。31例陽(yáng)性鱗癌（SCC）與16例陽(yáng)性腺癌（ADC）p16基因的MI分別為12.45.6%和10.63.8%，無(wú)顯著性差異（p0.05）。期肺癌病人與期肺癌病人p16基因的甲基化陽(yáng)性率分別為71.1% (32/45) 和88.2% (15/17)，無(wú)顯著性差異（p0.05）。 TableDetection p16 methylation by nMSP a

42、nd Bis-CL in serum from NSCLC . Total nMSP Bis-CLa Group of number Mb Ub rate (%) n MI (%)c Overall Lung Cancer 62 47 15 47/62(75.8) 47 11.82.2d Benign lung diease 23 2 21 3/23(9.5) 2 0.30.15 Healthy control 12 0 12 0/12 (0) Histological type SCC 40 31 9 31/40(78) 31 12.45.6 ADC 22 16 6 16/22(72.7)

43、16 10.63.8 TNM Stage 45 32 13 32/45(71.1) 32 11.34.7 17 15 2 15/17(88.2) 15 12.86.6 a The quantitative analysis technique based on mismatch hybridization and chemilumiscence. b The number of p16 methylated cases(M) and unmethylated cases(U). c Methylation Index (%). dxs 四、結(jié)論 本文將nMSP法及本研究建立的DNA甲基化的定量

44、檢測(cè)方法用于檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌（NCSLC）病人血清中p16基因甲基化檢測(cè)，并比較了肺癌不同組織細(xì)胞類型、不同TNM分期之間甲基化的差異；而且用定量方法的檢測(cè)結(jié)果與nMSP法結(jié)果高度相關(guān)。本研究中，由于樣品的收集遇到較多困難，未能收集到被檢肺癌患者在手術(shù)或放、化療后的血液標(biāo)本，若能同時(shí)收集到治療前后的血液標(biāo)本，分別檢測(cè)治療前后的甲基化水平，將為腫瘤的治療、預(yù)后判斷等提供大量有價(jià)值的信息。論文總結(jié)（主要內(nèi)容與創(chuàng)新點(diǎn)）論文總結(jié)（主要內(nèi)容與創(chuàng)新點(diǎn)） 1、將巢式PCR技術(shù)應(yīng)用于DNA甲基化的檢測(cè)，用改進(jìn)的巢式甲基化特異性PCR法檢測(cè)了腫瘤組織、石蠟包埋組織及腫瘤患者血清中p16基因的甲基化狀態(tài)。與傳統(tǒng)的

45、MSP法相比，改進(jìn)的巢式甲基化特異性PCR法（nMSP）具有更高的靈敏度與特異性； 2、建立了一種基于錯(cuò)配雜交、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的DNA甲基化定量分析方法，可廣泛用于腫瘤相關(guān)基因的甲基化程度分析； 3、利用RT-PCR技術(shù)及新建立的甲基化定量檢測(cè)方法研究了4株腫瘤細(xì)胞在脫甲基試劑處理前后p16基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的變化以及p16基因甲基化程度的改變，探討了p16基因轉(zhuǎn)錄失活與DNA過(guò)甲基化之間的關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)p16基因的過(guò)甲基化是導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄失活的重要方式； 4、利用新建立的甲基化定量檢測(cè)方法研究了非小細(xì)胞肺癌患者外周血血清中p16基因的甲基化狀態(tài)，探討了p16基因的過(guò)甲基化在腫瘤的早期診斷及其他

46、方面的應(yīng)用。 致謝致謝( (Acknowledgements)Acknowledgements)值此論文完成之際，謹(jǐn)向三年來(lái)幫助關(guān)心過(guò)我的諸多良師益友表示最衷心的感謝！ （二）（二）DNADNA甲基化與基因表達(dá)調(diào)控甲基化與基因表達(dá)調(diào)控1、DNA甲基化與印跡（imprinting）基因;2、DNA甲基化與胚胎的正常發(fā)育;3、DNA甲基化與雌性個(gè)體X染色體失活;4、DNA甲基化與基因轉(zhuǎn)錄失活. （3）特異性與靈敏度 腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多步驟多因素參與的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，涉及到許多基因的異常，如癌基因的激活以及抑癌基因的失活等，是多種遺傳變異的積累所致。對(duì)于絕大多數(shù)腫瘤，這些基因都是腫瘤相關(guān)性的，而非腫瘤特異性的。雖然不同種類的腫瘤中可能都存在某一基因的異常甲基化，但是不同類型的腫瘤中不