第二十章__高效液相色譜(20110512)

1、 高壓液相色譜法在液相色譜普及之前，紙色譜法、氣相色譜法和薄層色譜法是色譜分析法的主流。到了20世紀(jì)60年代后期，將已經(jīng)發(fā)展得比較成熟的氣相色譜的理論與技術(shù)應(yīng)用到液相色譜上來(lái)，使液相色譜得到了迅速的發(fā)展。特別是填料制備技術(shù)、檢測(cè)技術(shù)和高壓輸液泵性能的不斷改進(jìn)，使液相色譜分析實(shí)現(xiàn)了高效化和高速化。這種分離效率高、分析速度快的液相色譜就被稱為高效液相色譜法，也稱高壓液相色譜法或高速液相色譜法。 輸液泵輸液泵高壓輸液泵是液相色譜儀的關(guān)鍵部件，其作用是將流動(dòng)相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。對(duì)于帶在線脫氣裝置的色譜儀，流動(dòng)相先經(jīng)過(guò)脫氣裝置再輸送到色譜柱。輸液泵的穩(wěn)定性直接關(guān)系到分析結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確

2、性。 . 對(duì)輸液泵的基本要求流量準(zhǔn)確可調(diào)。流動(dòng)相的流速在0.5-2mL/min，輸液泵的最大流量一般為5-10mL/min。輸液泵的流量控制精度通常要求小于0.5%。耐高壓。高效液相色譜柱是將很細(xì)顆粒（3-10um粒徑）的填料，在高壓下填充到柱管中，為了保證流動(dòng)相以足夠大的流速通過(guò)色譜柱，需要足夠高的柱前壓。通常要求泵的輸出壓力達(dá)到30-60MPa的高壓。液流穩(wěn)定。輸液泵輸出的液流應(yīng)無(wú)脈動(dòng)。泵的死體積小。為了快速更換溶劑和適于梯度洗脫，泵的死體積通常要求小于0.5mL。泵的結(jié)構(gòu)材料應(yīng)耐化學(xué)腐蝕。 輸液泵輸液泵按輸出液恒定的因素分恒壓泵和恒流泵。對(duì)液相色譜分析來(lái)說(shuō)，輸液泵的流量穩(wěn)定性更為重要，這

3、是因?yàn)榱魉俚淖兓瘯?huì)引起溶質(zhì)的保留值的變化，而保留值是色譜定性的主要依據(jù)之一。因此，恒流泵的應(yīng)用更廣泛。輸液泵按工作方式分為氣動(dòng)泵和機(jī)械泵兩大類。機(jī)械泵中又有螺旋傳動(dòng)注射泵、單活塞往復(fù)泵、雙活塞往復(fù)泵和往復(fù)式隔膜泵。 脫氣裝置脫氣裝置流動(dòng)相溶液往往因溶解有氧氣或混入了空氣而形成氣泡。氣泡進(jìn)入檢測(cè)器后會(huì)在色譜圖上出現(xiàn)尖銳的噪音峰。小氣泡慢慢聚集后會(huì)變成大氣泡，大氣泡進(jìn)入流路或色譜柱中會(huì)使流動(dòng)相的流速變慢或出現(xiàn)流速不穩(wěn)定，致使基線起伏。氣泡一旦進(jìn)入色譜柱，排出這些氣泡則很費(fèi)時(shí)間。在熒光檢測(cè)中,溶解氧還會(huì)使熒光淬滅。溶解氣體還可能引起某些樣品的氧化或使溶液pH值發(fā)生變化。目前，液相色譜流動(dòng)相脫氣使用較

4、多的是離線超聲波目前，液相色譜流動(dòng)相脫氣使用較多的是離線超聲波振蕩脫氣、在線惰性氣體鼓泡吹掃脫氣和在線真空脫氣。振蕩脫氣、在線惰性氣體鼓泡吹掃脫氣和在線真空脫氣。梯度洗脫裝置梯度洗脫裝置為什么要進(jìn)行梯度洗脫？在進(jìn)行多成分的復(fù)雜樣品的分離時(shí)，經(jīng)常會(huì)碰到前面的一些成分分離不完全，而后面的一些成分分離度太大，且出峰很晚和峰型較差。為了使保留值相差很大的多種成分在合理的時(shí)間內(nèi)全部洗脫并達(dá)到相互分離，往往要用到梯度洗脫技術(shù)。 梯度洗脫操作線性梯度線性梯度： 在某一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)而均勻增加流動(dòng)相強(qiáng)度。階梯梯度階梯梯度： 直接從某一低強(qiáng)度的流動(dòng)相改變?yōu)榱硪惠^高強(qiáng)度的流動(dòng)相。梯度洗脫時(shí)，流動(dòng)相的輸送就是要將幾種

5、組成的溶液混合后送到分離系統(tǒng)，因此，梯度洗脫裝置就是解決溶液的混合問題，其主要部件除高壓泵外，還有混合器和梯度程序控制器。根據(jù)溶液混合的方式可以將梯度洗脫分為高壓梯度和低壓梯度。(2)梯度淋洗裝置梯度淋洗裝置外梯度外梯度: 利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度內(nèi)梯度: 一臺(tái)高壓泵, 通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。 色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。色譜填料： 經(jīng)過(guò)制備處理后，用于填充色譜柱的物質(zhì)顆粒，通常是5-10微米粒徑

6、的球形顆粒。色譜柱管： 內(nèi)部拋光的不銹鋼管。典型的液相色譜分析柱尺寸是內(nèi)徑4.6mm，長(zhǎng)250mm。色譜柱： 也稱固定相，是將色譜填料填充到色譜柱管中所構(gòu)成的, 填料的結(jié)構(gòu)色譜填料是由基質(zhì)和功能層兩部分構(gòu)成?；|(zhì)： 又常稱作載體或擔(dān)體，通常制備成數(shù)微米至數(shù)十微米粒徑的球形顆粒，它具有一定的剛性，能承受一定的壓力，對(duì)分離不起明顯的作用，只是作為功能基團(tuán)的載體。常用來(lái)作基質(zhì)的有硅膠和有機(jī)高分子聚合物微球。功能層： 是通過(guò)化學(xué)或物理的方法固定在基質(zhì)表面的、對(duì)樣品分子的保留起實(shí)質(zhì)作用的有機(jī)分子或功能團(tuán)。填料的物理結(jié)構(gòu)： 分為微孔型（或凝膠型）、大孔型（全多孔型）、薄殼型和表面多孔型四種類型。 紫外紫外

7、-可見光檢測(cè)器可見光檢測(cè)器原理： 基于Lambert-Beer定律，即被測(cè)組分對(duì)紫外光或可見光具有吸收，且吸收強(qiáng)度與組分濃度成正比。UV-VIS檢測(cè)器既有較高的靈敏度，也有很廣泛的應(yīng)用范圍。由于UV-VIS對(duì)環(huán)境溫度、流速、流動(dòng)相組成等的變化不是很敏感，所以還能用于梯度淋洗。用UV-VIS檢測(cè)時(shí)，為了得到高的靈敏度，常選擇被測(cè)物質(zhì)能產(chǎn)生最大吸收的波長(zhǎng)作檢測(cè)波長(zhǎng)。二極管陣列檢測(cè)器 以光電二極管陣列（作為檢測(cè)元件的UV-VIS檢測(cè)器。它可構(gòu)成多通道并行工作，同時(shí)檢測(cè)由光柵分光，再入射到陣列式接受器上的全部波長(zhǎng)的信號(hào)，然后，對(duì)二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到的是時(shí)間、光強(qiáng)度和波長(zhǎng)的三維譜圖。與普通U

8、V-VIS檢測(cè)器不同的是，普通UV-VIS檢測(cè)器是先用單色器分光，只讓特定波長(zhǎng)的光進(jìn)入流動(dòng)池。而二極管陣列UV-VIS檢測(cè)器是先讓所有波長(zhǎng)的光都通過(guò)流動(dòng)池，然后通過(guò)一系列分光技術(shù)，使所有波長(zhǎng)的光在接受器上被檢測(cè)。 直接紫外檢測(cè)： 所使用的流動(dòng)相為在檢測(cè)波長(zhǎng)下無(wú)紫外吸收的溶劑，檢測(cè)器直接測(cè)定被測(cè)組分的紫外吸收強(qiáng)度。間接紫外檢測(cè)： 使用具有紫外吸收的溶液作流動(dòng)相，間接檢測(cè)無(wú)紫外吸收的組分。柱后衍生化光度檢測(cè)： 對(duì)于那些可以與顯色劑反應(yīng)生成有色配合物的組分，可以在組分從色譜柱中洗脫出來(lái)之后與合適的顯色劑反應(yīng)，在可見光區(qū)檢測(cè)生成的有色配合物。示差折光檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器原理：基于樣品組分的折射率與流動(dòng)

9、相溶劑折射率有差異，當(dāng)組分洗脫出來(lái)時(shí)，會(huì)引起流動(dòng)相折射率的變化，這種變化與樣品組分的濃度成正比。絕大多數(shù)物質(zhì)的折射率與流動(dòng)相都有差異，所以RI是一種通用的檢測(cè)方法。雖然其靈敏度比其他檢測(cè)方法相比要低1-3個(gè)數(shù)量級(jí)。對(duì)于那些無(wú)紫外吸收的有機(jī)物（如高分子化合物、糖類、脂肪烷烴）是比較適合的。在凝膠色譜中是必備檢測(cè)器，在制備色譜中也經(jīng)常使用。熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器原理： 許多有機(jī)化合物，特別是芳香族化合物、生化物質(zhì)，被一定強(qiáng)度和波長(zhǎng)的紫外光照射后，發(fā)射出較激發(fā)光波長(zhǎng)要長(zhǎng)的熒光。熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度、量子效率和樣品濃度成正比。有的有機(jī)化合物雖然本身不產(chǎn)生熒光，但可以與發(fā)熒光物質(zhì)反應(yīng)衍生化后檢測(cè)。特點(diǎn)：

10、有非常高的靈敏度和良好的選擇性，靈敏度要比紫外檢測(cè)法高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。而且所需樣品量很小，特別適合于藥物和生物化學(xué)樣品的分析。電導(dǎo)檢測(cè)器（電導(dǎo)檢測(cè)器（conductivitydetector,CD）原理： 基于離子性物質(zhì)的溶液具有導(dǎo)電性，其電導(dǎo)率與離子的性質(zhì)和濃度相關(guān)。 電導(dǎo)檢測(cè)器是離子色譜中必備的檢測(cè)器。電導(dǎo)池是其核心。電導(dǎo)池的結(jié)構(gòu)： 檢測(cè)體積可達(dá)到微升甚至納升級(jí)。基本結(jié)構(gòu)是在柱流出液中放置兩根電極，然后通過(guò)適當(dāng)?shù)碾娮泳€路測(cè)量溶液的電導(dǎo)。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 基于溶質(zhì)的光散射性質(zhì)的檢測(cè)器。由霧化器、加熱漂移管、激光光源和光檢測(cè)器等部件構(gòu)成。因?yàn)樯⑸涔鈴?qiáng)只與溶質(zhì)顆粒大小和數(shù)量有關(guān)，

11、而與溶質(zhì)本身的物理和化學(xué)性質(zhì)無(wú)關(guān)，所以ELSD屬通用型和質(zhì)量型檢測(cè)器。適合于無(wú)紫外吸收、無(wú)電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測(cè)。其靈敏度與載氣流速、汽化室溫度和激光光源強(qiáng)度等參數(shù)有關(guān)。與示差折光檢測(cè)器相比，它的基線漂移不受溫度影響，信噪比高，也可用于梯度洗脫。 三、三、影響分離的因素影響分離的因素 在高效液相色譜中, 速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/U較小，可以忽略不計(jì)，而只有兩項(xiàng)，即： H = A + C u 故高效液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示：影響分離的主要因素有流動(dòng)相的流量、性質(zhì)和極性。影響分離的主要因素有流動(dòng)相的流量、性質(zhì)和極性。1.影響分離的因素影響分離的因素流速流速 流速大于

12、0.5 cm/s時(shí), Hu曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實(shí)際操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整分離度和出峰時(shí)間的重要可選擇參數(shù)。2.固定相及分離柱固定相及分離柱 氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。 選擇合適的固定相，降低填料粒度可顯著提高柱效，但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。 選擇短柱、細(xì)內(nèi)徑提高分析速度； 研制高效柱填料是一活躍領(lǐng)域。液相色譜流動(dòng)相液相色譜流動(dòng)相3.流動(dòng)相及流動(dòng)相的極性流動(dòng)相及流動(dòng)相的極性 （1）可顯著改變組分分離狀況的流動(dòng)相選擇在液相）可顯著改變組分分離狀況的流動(dòng)相選擇在液相

13、色譜中顯得特別重要。色譜中顯得特別重要。液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑。洗液，洗脫劑。（2）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。柱也稱正相柱。（3）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。分離柱上的出峰順序相反。流動(dòng)相組成流動(dòng)相組成流動(dòng)相按組成不同

14、可分為單組分和多組分；流動(dòng)相按組成不同可分為單組分和多組分；按極性可分為極性、弱極性、非極性；按極性可分為極性、弱極性、非極性；按使用方式有固定組成淋洗和梯度淋洗。按使用方式有固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑常用溶劑:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。 吸附色譜的分離機(jī)理 隨著樣品在固定相上的吸附能力由大到小 在色譜柱上的保留由長(zhǎng)到短 吸附色譜

15、概述分離基于樣品的極性差異。洗脫次序 一般為正相，即：極性低的先被洗脫常用的流動(dòng)相 非極性有機(jī)溶劑，如己烷常用固定相 硅膠、氧化鋁。二、二、LSC固定相固定相 流動(dòng)相的選擇流動(dòng)相的選擇 應(yīng)用由于硅羥基活性點(diǎn)在硅膠表面常按一定幾何規(guī)律排列，因此吸附色譜用于結(jié)構(gòu)異構(gòu)體分離和族分離仍是最有效的方法。如農(nóng)藥異構(gòu)體分離、石油中烷、烯、芳烴的分離 分配色譜的分離機(jī)理基于樣品分子在流動(dòng)相和固定相間的溶解度不同（分配作用）而實(shí)現(xiàn)分離的液相色譜分離模式分配色譜概述反相色譜的主要類型，基于分子的極性分離洗脫次序：一般為反相，即極性高的先被洗脫常用的流動(dòng)相： 有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，水 應(yīng)用添加劑，成為離子對(duì)、離子抑

16、制方法常用固定相： 碳十八、碳八、胺基等基團(tuán) 反相色譜固定相多為鍵合相 鍵合相色譜柱以硅膠為基質(zhì)，通過(guò)化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)聯(lián)在基質(zhì)上，作為固定相。優(yōu)點(diǎn) 固定相穩(wěn)定，不易流失 應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑 消除硅羥基的不良影響缺點(diǎn) pH值不能小于3 同樣填料，各種牌號(hào)色譜柱不盡相同 反相HPLC由非極性固定相和極性流動(dòng)相所組成的液相色譜體系，與正相HPLC體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠，代表性的流動(dòng)相是甲醇和乙腈。是當(dāng)今液相色譜的最主要分離模式，幾乎可用于所有能溶于極性或弱極性溶劑中的有機(jī)物質(zhì)的分離。 （1）適用于分離幾乎所有類型的化合物）適用于分離幾乎所有類型的

17、化合物（2）特別適合于梯度洗脫，為復(fù)雜體系的分）特別適合于梯度洗脫，為復(fù)雜體系的分離創(chuàng)造了條件離創(chuàng)造了條件（3）有很好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性）有很好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性（4）柱效高，使用周期長(zhǎng)，分析重現(xiàn)性好）柱效高，使用周期長(zhǎng)，分析重現(xiàn)性好 離子交換樹脂的分離機(jī)理離子交換色譜概述適用于離子型化合物的分離分離基于離子的帶電特性洗脫次序受多種因素的影響 填料（離子交換樹脂）的種類 陰/陽(yáng)，強(qiáng)/弱，交換基團(tuán) 樣品分子特性 鹽的種類、濃度 溫度及pH值 有機(jī)溶劑 離子對(duì)色譜無(wú)機(jī)離子以及離解很強(qiáng)的有機(jī)離子通常可以采用離子交換色譜或離子排斥色譜進(jìn)行分離。有很多大分子或離解較弱的有機(jī)離子需要采用通常用于中

18、性有機(jī)化合物分離的反相（或正相）色譜。然而，直接采用正相或反相色譜又存在困難，因?yàn)榇蠖鄶?shù)可離解的有機(jī)化合物在正相色譜的硅膠固定相上吸附太強(qiáng)，致使被測(cè)物質(zhì)保留值太大、出現(xiàn)拖尾峰，有時(shí)甚至不能被洗脫。在反相色譜的非極性（或弱極性）固定相中的保留又太小。在這種情況下，就可采用離子對(duì)色譜。 離子對(duì)色譜在流動(dòng)相中加入適當(dāng)?shù)木哂信c被測(cè)離子相反電荷的離子，即離子對(duì)試劑，使之與被測(cè)離子形成中性的離子對(duì)化合物，此離子對(duì)化合物在反相色譜柱上被保留。保留的大小主要取決于離子對(duì)化合物的解離平衡常數(shù)和離子對(duì)試劑的濃度。離子對(duì)色譜也可采用正相色譜的模式，即可以用硅膠柱，但不如反相色譜效果好，多數(shù)情況下采用反相色譜模式，所

19、以離子對(duì)色譜也常稱反相離子對(duì)色譜。 固定相： 化學(xué)惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝膠、親水凝膠、無(wú)機(jī)多孔材料。流動(dòng)相：在凝膠色譜中，流動(dòng)相的作用不是為了控制分離，而是為了溶解樣品或減小流動(dòng)相粘度。凝膠過(guò)濾色譜： 以水或緩沖溶液作流動(dòng)相的凝膠色譜法。主要適合于水溶性高分子的分離。凝膠滲透色譜：以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相的凝膠色譜法。主要適合于脂溶性高分子的分離。如甲苯和四氫呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要用于合成高分子的分子量（分布）的測(cè)定。 液相色譜的方法開發(fā)第一步干什么?想辦法得到各種信息 向同行了解是否做過(guò)此類樣品，或有否類似樣品的分析方法 查文獻(xiàn)，如CA(化學(xué)文摘)對(duì)色譜柱有足夠的了解

20、掌握分離機(jī)理，自己開發(fā)方法充分了解您自己的樣品分析時(shí)要了解哪方面的情況？靈敏度的要求有多高? 樣品的本底是否很復(fù)雜? 有多少組份要分析? 對(duì)分析的精密度、準(zhǔn)確度等有多高要求? 是否因是日常檢驗(yàn)，而要求方法容易使用? 分離時(shí)要了解哪方面的情況？要分離（即制備）的樣品量有多大? 要分離的組份在樣品中的含量很高? 還是微量? 是否需要保持生物活性? 對(duì)分離產(chǎn)物純度的要求有多高? 純度或活性的鑒定如何完成?一般的具體步驟先用一根短的色譜柱用相對(duì)較高的流速使用盡可能純度高的標(biāo)準(zhǔn)品先用高強(qiáng)度的洗脫液調(diào)節(jié)柱長(zhǎng)度改變柱效及分離速度請(qǐng)記住請(qǐng)記住 每次改變一個(gè)參數(shù) 每次改變一個(gè)參數(shù)使用文獻(xiàn)方法色譜柱填料的種類、品

21、牌是否相同?注意文獻(xiàn)方法的流動(dòng)相 是否損害色譜柱? 如色譜填料品牌不同，需要調(diào)整流動(dòng)相注意色譜柱的規(guī)格：內(nèi)徑、柱長(zhǎng) 需要調(diào)整流速、進(jìn)樣量反相色譜的方法開發(fā)開發(fā)過(guò)程實(shí)例 色譜條件 色譜柱：C18，4mm30mm 流動(dòng)相：乙腈/水，不同的溶劑強(qiáng)度，60/40、50/50、40/60，由強(qiáng)漸弱 流速：1ml/min 樣品： 對(duì)羥基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 對(duì)羥基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 對(duì)羥基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)改變?nèi)萘恳蜃?K60/4050/5040/60譜圖改變選擇性a通過(guò)改變流動(dòng)相改變選擇性 同樣強(qiáng)度的不同溶劑改變色譜柱62:38/42:

22、58/72:28/2322，OHCNCHOHMeOHOHTHF離子型化合物的分離方式使用離子交換柱 離子交換法 主要用于“強(qiáng)”陰、陽(yáng)離子使用反相柱 離子抑制色譜法 通過(guò)改變流動(dòng)相的pH值，使樣品成中性 離子對(duì)色譜法 加入“對(duì)離子”，使樣品呈中性離子抑制色譜離子型化合物在反相色譜柱上不保留改變流動(dòng)相的pH值，抑制樣品離子的電離適用于弱酸性化合物的分離 降低流動(dòng)相的pH值，使樣品降低離子化使用條件應(yīng)在填料基質(zhì)的范圍內(nèi) 硅膠柱的pH在2-8（較保險(xiǎn)值3-7）內(nèi)常用緩沖液及其pH值離子抑制色譜實(shí)例在乙腈/水及pH=7時(shí)，多數(shù)保留時(shí)間很短，無(wú)法完全分離。CHOOHOCH3COONaCHOCOOHOCH31234離子抑制色譜的使用范圍如果：一些酸在pH低于2時(shí)還保持離子化一些堿在pH高于7時(shí)還保持離子化可以有以下的選擇 離子交換色譜 使用聚合物反相柱，在pH高于7時(shí)用離子抑制法 使用“離子對(duì)色譜法”離子對(duì)色譜法在反相色譜流動(dòng)相內(nèi)加入“離子對(duì)”試劑 與樣品中可電離的組份形成“對(duì)離子”