D半乳糖合并半高脂飼料致認(rèn)知功能障礙大鼠模型的建立及評價(jià)

1、【摘要】目的建立復(fù)合因素所致認(rèn)知功能障礙大鼠模型，并從行為學(xué)、病 理形態(tài)學(xué)、 細(xì)胞凋亡、 氧化損傷和炎癥因子等角度進(jìn)行評價(jià)。 方法 選用雌性正 常SD大鼠，采用皮下注射D半乳糖及飼喂半高脂飼料，制備6 w及8 w不同 時(shí)程的認(rèn)知功能障礙動物模型。采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)及物體識別實(shí)驗(yàn)檢測各 組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力；采用HE染色及電鏡觀察海馬組織病理形態(tài)；測定腦中丙 二醛(MDA)、氧化低密度脂蛋白(ox LDL)、腫瘤壞死因子a (TNF a )及tl細(xì)胞介素6 (IL 6)的含量；比較不同時(shí)程認(rèn)知功能障礙模型大 鼠之間及與正常大鼠的差異。結(jié)果6 w末時(shí)，認(rèn)知功能障礙模型大鼠在物體識 別實(shí)驗(yàn)中，

2、分辨指數(shù)較空口組明顯下降(P0.05),但水迷宮實(shí)驗(yàn)成績與空白 組比較無明顯差異；而8 w末時(shí)，模型動物在分辨指數(shù)下降(P0.01)的同 時(shí)，水迷宮成績亦明顯下降，逃避潛伏期明顯延長(PV0.01),穿臺次數(shù)明顯 減少(P0.05)；8 w末與6 w末相比，水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期明顯延長(P 0.01):造模后， 能引起海馬神經(jīng)細(xì)胞的退行性改變及早期凋亡現(xiàn)象， 且存 在著進(jìn)行性加重的病理變化；6、8 w模型組大鼠腦組織的TNF a、IL 6水 平顯著升高(P0. 05, P0.01),同時(shí)8 w大鼠IL 6水平高于6 w模型組(P0. 05) ； 6、8 W模型組ox LDL、MDA水平均顯著升

3、高(P0 05, P 0.01) o結(jié)論以該方法復(fù)制的認(rèn)知功能障礙大鼠模型，在一定程度上模擬了認(rèn) 知功能障礙發(fā)生、發(fā)展的多環(huán)節(jié)病理變化，可為認(rèn)知功能障礙的治療，特別是 其早期干預(yù)打下基礎(chǔ)。【關(guān)鍵詞】D半乳糖； 半高脂飼料； 認(rèn)知功能障礙； 大鼠模型Establishmentand evaluation on rat model of cognitive impairment achieved by D galactoseand semi high fat diet YAO Ming Jiang, LI Hao, ZHAO Wen Ming, et al Xiyuan Hospital , Ch

4、inaAcademy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100091, China AbstractObjective To establish rat model of cognitive impairment with compositefactor, and evaluate the model on praxiology, pathomorpho1ogy, apoptosisand oxidative damage Methods Female SD rats were received dailyhypodermic injection of

5、D galactose with the concentration of 50 mg/kgand fed with semi high fat diet for 6 and 8 weeks The abilities of learningand memory were tested by Morris water maze, the pathomorphologic ofhippocampus was observed by HE staining and electron microscope Thelevels of MDA, ox LDL, TNF Q and IL 6 in bra

6、in were detected, and thedifference between rat model of cognitive impairment and normal rat indifferent course were analyzed Results After 6 weeks, resolution indexof model group was decreased than that of normal group (P0.03) in objectrecognition test, but there was no difference in water maze res

7、ults After8 weeks, both resolution index and water maze results of model group weredecreased than those of normal group, and escape latency was extended(P0.01) , times of crossing platform was reduced (P0.03) Escape latencywas also extended at 8 weeks compared with that at 6 weeks (P0.01) Inthe two

8、model groups, degeneration and early apoptosis were observed inneurocyte ofhippocampus, and the changes were aggravated progressive!y. The levelsof TNF a and IL 6 in model groups were elevated （P 0.03， P0.01） ,and the level of IL 6 in 8 weeks model group was higher than that in 6weeks model group （P

9、0.05）, the levels of ox LDL and MDA in model groupswere elevated compared with those in normal group （P0.03, P0.01）Conclusions Rat model of cognitive impairment achieved by this methodcould imitate the genesis and progression of cognitive impairment in someextent, and could provide research foundati

10、on for early intervention ofcognitive function impairment 【Key words D galactose; Semi high fatdiet;Cognitive impairment; Rat model隨著我國逐漸進(jìn)入老齡化社會，認(rèn)知功能障礙的人口正逐年增加， 許多中老年人及其家人正在經(jīng)受認(rèn)知功能障礙所帶 來的痛苦，同時(shí)也為整個(gè)社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)（1） o U前，D半乳糖模 型已成為國內(nèi)公認(rèn)的衰老和腦老化動物模型之一（2） o同時(shí)，多項(xiàng)研究分析表 明，心腦血管病危險(xiǎn)因素與認(rèn)知功能障礙相關(guān)，如高血壓、房顫、血脂異常、糖尿病等，不僅是

11、血管性癡呆（VD）,而且也是老年性癡呆（AD）和輕度認(rèn)知 功能損傷（MCI）的危險(xiǎn)因素（3） o因此，本實(shí)驗(yàn)在皮下注射D半乳糖誘導(dǎo) 腦老化的基礎(chǔ)上，加喂半高脂飼料，旨在建立一種簡便易行、 便于重復(fù)并且能 較好地重現(xiàn)人類認(rèn)知功能障礙發(fā)生、 發(fā)展病理變化的動物模型。1材料與 方法1 1實(shí)驗(yàn)材料SPF級雌性SD大鼠48只，體重180200 g,由北 京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，許可證編號SCXK（京）20070001 o D半乳糖ill Sigma公司提供（G0625）:半高脂飼料（配方：5%豬油+0. 5%膽固 醇+概蛋黃粉+89. 5%基礎(chǔ)飼料）山北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供；氧化低密度

12、 脂蛋白（ox LDL） （ELISA）測定試劑盒由美國TPI公司提供（批號：TE212）:丙二醛（MDA）測定試劑盒山南京建成生物工程研究所提供（批號：20070814）；考馬斯亮藍(lán)蛋口測定試劑盒III南京建成生物工程研究所提供 （批 號：20070814）。Morris水迷宮系統(tǒng)DMS2（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院）；MultiskanMK3 Thermo（雷伯）酶標(biāo)儀、Wellwash MK2 Thermo（雷伯）洗板機(jī)（芬蘭）；恒溫 水浴箱（上海儀器廠）；OLYMPUS BH 2光學(xué)顯微鏡（日本）；日立H 600型透射電鏡（日本）1.2方法1.2.1認(rèn)知功能障礙大鼠模型的制備SPF級雌性SD大鼠適

13、應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，按隨機(jī)方法分為4組，即6 w模型組、6 w空白組、8 w模型組、8 w空口組，每組12只。每組6只用于海馬組織勻 漿相關(guān)指標(biāo)檢測；另外6只用于灌注固定后海馬組織病理檢測。6 w模型組： 每日頸背部皮膚75%酒精消毒后，皮下注射D半乳糖50 mg/kg體重，并自第3周起同時(shí)給予半高脂飼料喂食，至第6周末。6 w空白組：每日頸背部皮膚75%酒精消毒后，皮下注射等量生理鹽水，并飼喂普通飼料，至第6周末。8 w模型組：每日頸背部皮膚75%酒精消毒后， 皮下注射D半乳糖50 mg/kg體 重， 并自第5周起同時(shí)給予半高脂飼料喂食，至第8周末。8 w空口組：每日 頸背部皮膚75%酒精消毒

14、后，皮下注射等量生理鹽水，并飼喂普通飼料，至第8周末，死亡1只。1. 2. 2行為學(xué)實(shí)驗(yàn)1. 2. 2. 1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 山定位航行實(shí)驗(yàn)與空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分組成。定位航行實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)水深30 cm,水溫（251） C,將大鼠從第二象限標(biāo)記處逐一放入水池中，放入時(shí)將大 鼠面向池壁，自動錄像系統(tǒng)記錄大鼠從入水至找到平臺并爬上平臺所需的時(shí)間（以四肢爬上平臺為準(zhǔn)），即逃避潛伏期（PLL） o如大鼠在3 min內(nèi)未找到平 臺，則山實(shí)驗(yàn)者將其引導(dǎo)至平臺。潛伏期最長時(shí)間為180 so待大鼠爬上平臺 并在平臺上休息10 s后，再進(jìn)行下一只大鼠的實(shí)驗(yàn)。每天進(jìn)行1次，連續(xù)訓(xùn)練5 d,記錄每天的FLL?？?/p>

15、間探索實(shí)驗(yàn)：第5天下午，撤除平臺，隨機(jī)選取一 點(diǎn)，面向池壁將大鼠放入水池中，攝像系統(tǒng)自動記錄大鼠3 min內(nèi)進(jìn)出原平臺區(qū)的次數(shù)作為評價(jià)大鼠學(xué)習(xí)成 績的指標(biāo)。1. 2. 2. 2物體識別實(shí)驗(yàn)參考Ennaceur等（4）及Aggieton等（5）的方法進(jìn)行物體識別實(shí)驗(yàn)。裝置主要由一個(gè)測試盒（自制）與2套（每 套2只） 測試物體組成， 測試物體在實(shí)驗(yàn)前經(jīng)篩選有近似的大鼠喜好程度。 測 試盒以1 mXlmX0.5 m的木制盒自制而成，內(nèi)面漆成灰色，底面鋪一層鋸 屑。A套物體與B套物體材料及顏色需不同，高度約1518 cm,兩物體均足夠 重以防止大鼠推動。測試主要分適應(yīng)期、熟悉期和識別期。第1天：適應(yīng)期

16、。 將鼠放入測試盒正中，盒內(nèi)未放任何物體。自行活動10 mine第2天：熟悉 期。盒中放入兩個(gè)相同物體（AA或BB）,兩物體處于對角線上，距兩側(cè)壁各10 cm,將鼠仍從正中放入盒中，距兩物體等距。共活動10 mine測試者分別 用2只秒表記錄鼠在每個(gè)物體上的探索時(shí)間，即鼠嘴湊近物體2 cm內(nèi)和/或用 鼻觸物體，只在附近走動及趴在物體上則不計(jì)入時(shí)間。第3天： 測試期。 將盒 中物體其中之一換為另一套物體中之一， 即AB或BL共活動10 min,同上法 計(jì)時(shí)，記錄每只大鼠探索新、舊物體的時(shí)間，并以探索時(shí)間計(jì)算分辨指數(shù)（DI）評價(jià)其識別能力，DI計(jì)算公式：DI二（X F） /（N+F） X100%,

17、式中N為 探索新物體所用的時(shí)間，F(xiàn)為探索舊物體所用的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)中，A套物體為綠色 塑料物體，B套物體為紅色玻璃物體。1.2.3組織樣品處理 大鼠進(jìn)行全部行為學(xué)測試后，禁食12 h, 10%水合氯醛腹腔麻醉后，每組6只隨即斷頭 處死，在低溫下快速取出全腦， 分離出大腦皮層和海馬， 隨機(jī)選2只大鼠， 取 海馬組織1 mm3放入4%戊二醛磷酸緩沖液中固定，以備電鏡檢測；其余分別稱 重后，置液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)存于-80C冰箱。取海馬組織，于冰浴下超聲波破 碎制成10%勻漿，離心3 000r/min, 4C, 10 min,取上清液，以待生化指標(biāo) 檢測。剩余6只大鼠剖開胸腔及腹腔，暴露心臟，剪開右心耳，

18、經(jīng)升主動脈用0.01%肝素生理鹽水沖凈血液（2 min內(nèi)） ，繼用預(yù)冷為4C的含4%多聚甲醛的 固定液（PBS配制，pH7.4）進(jìn)行灌注固定1 h,直到動物全身呈僵直狀態(tài)，灌 流結(jié)束后，斷頭取全腦，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，選取海馬部位，將蠟 塊切成4 um冠狀切片，以備病理染色。1.2.4病理形態(tài)學(xué)觀察組織切片常規(guī)HE染色，置光學(xué)顯微鏡下形態(tài)觀察。取4%戊二醛磷酸緩沖液固定的 海馬組織，進(jìn)行常規(guī)電鏡包埋，1 um半薄切片下定位，超薄切片染色后，日 立H 600型透射電鏡觀察海馬超微結(jié)構(gòu)改變并照像。山中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能 所協(xié)助檢測。1 .2. 5海馬勻漿生化指標(biāo)檢測1. 2. 5. 1腫瘤

19、壞死因子a （TNF a）及白細(xì)胞介素6（IL 6）含量測定釆用放射免疫法測定TNF a和IL 6的含量，由解放軍總醫(yī)院提供放免試劑盒并協(xié)助檢測。1. 2. 5. 2 MDA及ox LDL含量測定釆用免疫比濁法測定MDA的含量，酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測ox LDL的含量，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。1.3數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)以xs表示，采用SPSS13. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有 數(shù)據(jù)均經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)及方差分析。2結(jié)果2.1 6W末和8 W末各組大鼠水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表lo重復(fù)測量設(shè)計(jì)方差分析,6 w模型組PLL延長，但和6 w空口組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.

20、05） ；8 w模型組PLL明顯延長，與8 w空口組相比有顯著性差異（P 0.01）；與6 w模型組比較亦有顯著性差異（P0. 05） o表1各組水迷宮定位航行實(shí) 驗(yàn)PLL比較（略）2.2 6w末和8 w末各組大鼠水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)和物體識別實(shí)驗(yàn)分辨指數(shù)結(jié)果見表2。6 w模型組穿臺次數(shù)與6 w空白組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05） : 8 w模型組穿臺次數(shù)明顯減少，與8 w空口組比 較有顯著性差異（P0.05）,與6 w模型組相比無顯著性差異（P0. 05） o 6 w和8 w動物的分辨指數(shù)明顯降低，和空口組比較有顯著差異（P0. 05, P0. 05）o表2各組水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)穿臺次數(shù)

21、和物體識別實(shí)驗(yàn)DI比較（略）2. 3 6 w末和8 w末大鼠海馬組織病理形態(tài)學(xué)變化動物造模后，光鏡下可見模型組大鼠海馬病理形態(tài)顯示神經(jīng)元數(shù)量減少，突起明顯稀疏，8 w模型組與6 w模型組比較，核固縮明顯；空口組神經(jīng)元數(shù)量多，突起致密，神 經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞少而?。ㄒ妶D1）o動物造模后，電鏡下超微結(jié)構(gòu)顯示6 w模型組 大鼠海馬細(xì)胞核萎縮，線粒體萎縮，核膜相對完整；8 w模型組細(xì)胞核中染色 質(zhì)呈邊集現(xiàn)象，為塊狀，核周岀現(xiàn)空暈，線粒體萎縮，結(jié)構(gòu)變化差于6 w模型 組；而空白組細(xì)胞基本呈正常結(jié)構(gòu)，形狀橢圓，核內(nèi)清晰，核膜結(jié)構(gòu)清晰，線 粒體結(jié)構(gòu)尚可；6 w空口組與8 w空口組無明顯差別（見圖2） o 2.4海馬

22、 勻漿TNF Q及IL 6含量結(jié)果 見表3o 6 w.8 w模型組大鼠海馬組織的TNF a. IL 6水平顯著升高，與空白組比較差異顯著（P0.05, P0. 01） :8 w大鼠IL 6水平明顯高于6 w模型組（P0. 05）。表3各組海馬TNF a、IL 6含量比較（略）2. 5海馬勻漿MDA及ox LDL含量結(jié)果見表4。6 w、8 w模型組大鼠海馬組織的MDA及ox LDL的含量顯著升高，與 空白組比較差異顯著（P0. 05, P0.01） o表4各組海馬MDA、ox LDL含 量比較（略）3討論國內(nèi)外許多學(xué)者針對VD、AD等認(rèn)知功能障礙疾病建立了一系列動物模型（6）,如基底前腦注射鵝蒿蕈氨酸（IB0）致癡呆大鼠模 型、東奩君堿致膽堿能損傷致癡呆動物模型、三氧化鋁動物模型、自然衰老動 物模型、快速老化小鼠、轉(zhuǎn)基因動物模型、D半乳糖皮下注射致腦老化動物模 型等，各有其優(yōu)勢，但都面臨同一個(gè)問題， 即只是針對其病理的某一方面造 模， 因而只能模擬其諸多病理變