生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)2教案

1、酵母核糖核酸的分離及組分鑒定時間安排:3學(xué)時目的類型:驗(yàn)證目的要求:1、了解核酸的組分2、掌握鑒定核酸組分的方法實(shí)驗(yàn)原理:酵母核酸中RNA含量較多。RNA可溶于堿性溶液，在堿提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。RNA含有核糖、喋吟堿、喀咤堿和磷酸各組分。加硫酸煮沸可使其水解，從水解液中可以測出上述組分的存在。儀器:研缽錐形瓶量筒滴管試管及試管架燒杯玻璃棒表面皿電子天平離心機(jī)恒溫水浴鍋重要實(shí)驗(yàn)步驟與教學(xué)設(shè)計(jì):1.將2.5g酵母懸浮于5ml 0.04mol/L氫氧化鈉溶液中，并在乳缽中研磨均勻，至少15分鐘。將懸浮液轉(zhuǎn)移至 150ml錐形瓶中，再用15ml0

2、.04mol/L氫氧化鈉溶液兩次洗滌乳缽。在沸水浴上加熱 30分鐘后，冷卻。離心(3000r/min ) 15分鐘，將上清液緩緩傾入15ml酸性乙醇溶液中。注意要一邊攪拌一邊緩緩傾入。待RNA沉淀完全后，離心(3000r/min ) 3分鐘。棄去清液，轉(zhuǎn)移到表面皿中， 沉淀在沸水浴上干燥， 即為酵母RNA 的粗制品。2.將沉淀轉(zhuǎn)移至小燒杯中，加入 3當(dāng)量/升硫酸6ml ,在沸水浴中加熱10分鐘制成水 解液并進(jìn)行組分的鑒定。喋吟堿：取水解液 1ml加入約1ml 0.1mol/L 硝酸銀溶液，然后加入過量濃氨水，觀察有無喋吟堿的銀化合物沉淀。核糖：取一支試管加入水解液1ml、三氯化鐵濃鹽酸溶液1m

3、l和苔黑酚乙醇溶液0.2ml。放沸水浴中10分鐘。注意溶液是否變成綠色，說明核糖的存在。磷酸：取一支試管，加水解液1ml和定磷試劑1ml。在水浴中加熱，觀察溶液是否變成藍(lán)色，說明磷酸是否存在。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):苔黑酚顯色的特異性較差，凡戊糖都有此反應(yīng)。準(zhǔn)微量 DNA無影響，較多DNA存在有干擾，在試劑中加入適量的CuCl2可減少DNA的干擾。小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的比較時間安排:3學(xué)時目的類型:綜合目的要求:1、學(xué)習(xí)分光光度計(jì)的原理和使用方法。2 .學(xué)習(xí)測定淀粉酶活力的方法。3 .了解小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的變化。實(shí)驗(yàn)原理:種子中貯藏的糖類主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解為麥芽糖。麥芽糖有

4、還原性，能使3,5-二硝基水楊酸還原成棕色的 3-氨基5-硝基水楊酸。后者可用分光光度計(jì)法測定。休眠種子的淀粉酶活力很弱，種子吸脹萌發(fā)后，酶活力逐漸增強(qiáng)，并隨著發(fā)芽天數(shù)的增長而增加。本實(shí)驗(yàn)觀察小麥種子萌發(fā)前后淀粉酶活力的變化。儀器:25ML刻度試管吸管研缽離心管分光光度計(jì)離心機(jī)重要實(shí)驗(yàn)步驟與教學(xué)設(shè)計(jì):1 .種子發(fā)芽小麥種子浸泡2.5小時后，放入25 c恒溫箱內(nèi)發(fā)芽。2 .酶液提取取發(fā)芽第三天的幼苗 5株，放入予冷的乳缽內(nèi)，加海砂少許，加1%氯化鈉溶液10mL,用力磨碎。在室溫下放置 20分鐘，攪拌幾次。然后將提取液離心6分鐘，3000r/min 。將上清液倒入量筒， 測定酶提取液的總體積。 取

5、1ml酶液，用緩沖液稀釋 10倍。取干燥種子5粒作為對照，(提取步驟同上)。3 .酶活力測定(1)取試管4支，編號。按下表要求加入各試劑(各試劑須在25 c預(yù)熱10分鐘)。將各管混勻，放在 25 c水浴中，保溫 3分鐘后，立即向各管中加入 1%3, 5-二 硝基水楊酸溶液2mL。(2)取出各試管，放入沸水浴中加熱5分鐘。冷至室溫，加 3.5mL蒸儲水稀釋一倍，混勻。(3)用空白管作對照：在 A500nm 處測定各管的光吸收值，將讀數(shù)填入下表。4 .計(jì)算本實(shí)驗(yàn)規(guī)定：25 c時3分鐘內(nèi)水解淀粉釋放 1mg麥芽糖所需的酶量為1個酶活 力單位。根據(jù)溶液的濃度與光吸收值成正比的關(guān)系，A標(biāo)準(zhǔn)=c標(biāo)準(zhǔn)總活力

6、單位=c酶Xn酶XV酶實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):酶液提取時，要使用-20 C預(yù)冷的乳缽酶的特性時間安排:3學(xué)時目的類型:綜合目的要求:加深對酶的性質(zhì)的認(rèn)識內(nèi)容：本實(shí)驗(yàn)由溫度對酶的活力的影響；pH對酶活力的影響；酶的激活劑及抑制劑三組實(shí)驗(yàn)組成。（一）溫度對酶活力的影響實(shí)驗(yàn)原理:酶的催化作用受溫度的影響，在最適溫度下，酶的反應(yīng)速度最高。大多數(shù)動物酶 的最適溫度為3740 C ,植物酶的最適溫度為 5060 C。酶對溫度的穩(wěn)定性與其存在形式有關(guān)。有些酶的干燥制劑，雖加熱到100 C,其活性并無明顯改變，但在 1100 c的溶液中卻很快地完全失去活性。低溫能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。儀器:試管及試管架恒

7、溫水浴冰浴沸水浴重要實(shí)驗(yàn)步驟與教學(xué)設(shè)計(jì):取3支試管，編號后按下表加入試劑：卷 號123淀粉搟敕（升1.51.51.5捧烽唾液1套升）11一米沸過的輔野唾渣（毫升）! *1搖勻后，將1號、3號兩試管放人 37 c恒溫水浴中，2號試管放人冰水中。10分鐘后取出，（將2號管內(nèi)液體分為兩半）用碘化鉀一碘溶液來檢驗(yàn) 1、2、3管內(nèi) 淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。記錄并解釋結(jié)果，將二號管剩下的一半銘液放人37 c水浴中繼續(xù)保溫10分鐘后，再用碘液實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如何？（二）pH對酶活性的影響實(shí)驗(yàn)原理:酶的活力受環(huán)境pH的影響極為顯著；不同酶白最適pH值不同。本實(shí)驗(yàn)觀察pH對唾液淀粉酶活性的影響，唾液淀粉酶的最適p

8、H約為6. 8。儀器:試管及試管架吸管滴管50毫升錐形瓶恒溫水浴重要實(shí)驗(yàn)步驟與教學(xué)設(shè)計(jì):從四個試劑瓶中各取緩沖液 3毫升，分別注入4支帶有號碼的試管中，隨后于每個試管中添加0.5 %淀粉溶液2毫升和稀釋50倍的唾液2毫升。向各試管中加入稀釋唾液的時間間隔各為1分鐘。將各試管內(nèi)容物混勻，井依次置于37 c恒溫水浴中保溫。第四管加入唾液2分鐘后，每隔I分鐘由第3管取出一滴混合液，置于白瓷板上， 加1小滴碘化鉀一碘溶液，檢驗(yàn)淀粉的水解程度。待混合液變?yōu)樽攸S色時，向所有試管依次添加12滴碘化鉀一碘溶液。添加碘化鉀一碘溶液的時間間隔，從第一管起，亦均為1分鐘。觀察各試管內(nèi)容物呈現(xiàn)的顏色，分析pH對唾液淀

9、粉酶活性的影響。（三）唾液淀粉酶的活化和抑制實(shí)驗(yàn)原理:酶的活性受活化劑或抑制劑的影響。氯離子為唾液淀粉酶的活化劑，銅離子為其抑制劑。儀器:恒溫水浴試管及試管架重要實(shí)驗(yàn)步驟與教學(xué)設(shè)計(jì):管 號1234入1%旋就博液（毫升）L $ J1.51. 5*奔唾液（亳拜）0.5】整茂酸銅溶MK毒升1Q.5H1%氨化鈉序僮（亳升）Qm 5-1望麒船海福（亳升0.5嘉圖水（再升）-一 10.53丁0恒溫水港，保溫10分界注膜化腳一碟溶液 O2-3!'2-32-3 -J3現(xiàn)*!在保溫酎鐮可根據(jù)各人嚼液淀粉廉活力輯整.解釋結(jié)果，說明本實(shí)驗(yàn)第 3管的意義。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):碘化鉀-碘溶液只需加兩滴，否則看不到明顯

10、的顏色變化。實(shí)驗(yàn)后記SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳時間安排:3學(xué)時目的類型:演示目的要求:1、學(xué)會SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法原理2、掌握用SDS-PAGE凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)分子量的操作技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理:SDS是十二烷基磺酸鈉的簡稱，它是一種陰離子表面活化劑，加入到電泳系統(tǒng)中能使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，使各種蛋白質(zhì) -SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)原有的電荷差別。這樣就使電泳遷移率只取決于分子大小這一因素，于是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)和遷移率所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可求得未知物的分子量。儀器與基本操作:電泳儀

11、垂直板電泳槽移液管100ML燒杯細(xì)長頭的吸管微量注射器重要實(shí)驗(yàn)步驟與教學(xué)設(shè)計(jì):1 .準(zhǔn)備步驟：將凝膠板依次用水、SDS、水、無水乙醇、水洗滌干凈，然后使其自然風(fēng)干或烘干。梳子臨用前用無水乙醇擦拭，讓其揮發(fā)至干。滅菌槍頭、離心管2 制備凝膠：安裝玻璃板、板條、 并將玻璃板固定在電泳槽中，以 5% 瓊脂封底。配制 10% 的分離膠：依次將8ML 蒸餾水，6.7ML30% 丙烯酰胺儲存液，5ML1.5MOL/LTRIS 溶 液 ，0.2ML10%SDS 溶 液 ，0.2ML10% 過 硫 酸 銨 ，0.008MLTEMED 混合，充分混勻2MIN ，立即灌膠?；旌虾蟮哪z溶液，用細(xì)長頭的吸管加至玻璃

12、板間的窄縫內(nèi)，加膠高度距樣品模板梳齒下緣1CM 。用吸管在凝膠表面沿玻璃邊緣加一層蒸餾水，用于隔絕空氣，使膠面平整。分離膠凝固后，可看到水與膠面有折射率不同的界限。倒掉蒸餾水，用吸水紙吸去多余的水。在分離膠聚合的過程中，配制 5% 的積層膠：依次混合5.5ML 蒸餾水， 1.3ML30%丙烯酰胺貯存液，1.0ML1.0MOL/LTRIS 溶液， 0.08ML10%SDS 溶液， 0.08ML10%過硫酸銨，0.008TEMED 。 TEMED 應(yīng)在灌膠前加入。分離膠聚合完全后，倒去正丁醇，用蒸餾水沖洗膠面數(shù)次，用濾紙吸干膠面上的殘余水。灌注積層膠，立即插入干凈的梳子，避免產(chǎn)生氣泡。積層膠聚合完

13、全后，小心拔出梳子，用移液器吸取電極緩沖液清洗加樣孔數(shù)次，除去未聚合的丙烯酰胺。在上下電泳槽中加入足夠的電泳緩沖液。3 、樣品的制備3-4MG/ML在蛋白溶液中加入等體積德2 倍樣品緩沖液，使蛋白的終濃度為混合液在沸水浴中加熱 3分鐘，冷卻后即可上樣。4、上樣用微量進(jìn)樣器上樣，每加入一種樣品，應(yīng)在下槽中洗滌加樣器數(shù)次，最后在空白加樣孔中加入等體積德 SDS樣品溶解液。5、電泳裝好冷凝水系統(tǒng)，打開電源，初始電壓為100-120V ,當(dāng)染料進(jìn)入分離膠后，將電壓提高到200-220V ,繼續(xù)電泳直到染料到達(dá)離膠底部1CM處。6、后處理固定：從電泳裝置上卸下玻璃板，用鐐子小心撬開玻璃板，除去積層膠部分

14、，將 分離膠移入固定液中固定，直至染料由藍(lán)綠色變?yōu)辄S色。染色：除去固定液，加入染色液，室溫染色 8小時。脫色：回收染色液，將凝膠浸泡于脫色液中，直至背景脫至無色，其間更換脫色 液3-4次。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):N, N-亞甲雙丙烯酰胺為神經(jīng)毒性物質(zhì)，可經(jīng)皮膚直接吸收，使用時應(yīng)避免其直接接觸皮膚，必要時應(yīng)戴手套，但其凝固后就變成無毒物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)后記酶的專一性時間安排:3學(xué)時目的類型:驗(yàn)證目的要求:加深對酶的性質(zhì)的認(rèn)識實(shí)驗(yàn)原理:酶具有高度的專一性。本實(shí)驗(yàn)以唾液淀粉酶和蔗糖酶對淀粉和蔗糖的作用為例，來說明酶的專一性。淀粉和蔗糖無還原性，唾液淀粉酶水解淀粉生成有還原性的麥芽糖，但不能催化蔗糖的水解，蔗糖酶能催化

15、蔗糖水解產(chǎn)生還原性葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解，用 Benedict 試劑檢查糖的還原性。儀器:恒溫水浴沸水浴試管及試管架重要實(shí)驗(yàn)步驟與教學(xué)設(shè)計(jì):(1)淀粉酶的專一性：管 號1 .23,2二81%淀酚諄液t滿）4-4-4>2%謊槽港液摘J'4-414稀野唾液（毫升） .1J煮沸過的雅新睡融亳升）一1流潮水（亳升JI1一_ _ 3一37.口恒城水浴15令鐘Benedict成劑（超升11J1 1.1 '1沸水浴2T分鐘現(xiàn)孰1 1解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果（提示：唾液除含淀粉酶外近合有少旦麥芽糖酶）。（2）蔗糖酶的專一性:管 號11 2345fl1%淀粉 清）4j 4一L4-2%蔗糖溶

16、液（清）4*一4速精弊謔狀（亳升）-1一11盤腦近前勰嗝甯液 （亳升）vnrSHTTT11蒸謂本（整升）11."*1恒溫水浴5分加BBtdim氏試劑（亳升）111111沸水塔2-3分錚解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):蔗糖酶從酵母粉中提取，需保存冰箱中備用實(shí)驗(yàn)后記:維生素C的定量測定1.學(xué)習(xí)維生素C定量測定法的原理和方法2.進(jìn)一步熟悉、掌握微量滴定法的基本操作技能實(shí)驗(yàn)原理:還原型抗壞血酸能還原染料2, 6二氯酚靛酚鈉鹽，本身則氧化成脫氫抗壞血酸。在酸性溶液中，2, 6二氯酚靛酚呈紅色，被還原后變?yōu)闊o色。ci<>一ONM 藍(lán)色:ClHO-C I OHQCIH C HO-CHICH

17、,OHOH 11H+。Y>-N<7-OHCi力的-二氨酚能酚（紅色）還原型抗壞血酸+_A yCZ）-OHCl 卜還原型2,6 二氯酚院酚（無色）0 1C I O >。-d H - C - HOCH CHjOH 脫乳抗壞血酸因此，可用2, 6二氯酚滴定樣品中還原型抗壞血酸。當(dāng)抗壞血酸全部被氧化后, 稍多加一些染料，使埔定液呈談紅色，即為終點(diǎn)。如無其他雜質(zhì)干擾，樣品提取液所 還原的標(biāo)準(zhǔn)染料量與樣品中所合的還原型抗壞血酸量成正比。儀器:乳缽吸量管酸式滴定管錐型瓶容量瓶 紗布重要實(shí)驗(yàn)步驟與教學(xué)設(shè)計(jì):制備含維生素C的樣品提取液稱取30g綠豆芽在乳缽中研磨，放置10分鐘，用2層紗布過濾，

18、將濾液濾入50ML容量瓶中。最后，用酸化的蒸儲水定容，混勻，備用。量取樣品提取液10ml于錐形瓶中，以2, 6二氯酚靛酚溶液滴定樣品提取液，呈微弱的玫瑰色，持續(xù)5秒鐘不褪為終點(diǎn)，記錄所用2, 6二氯酚靛酚的 ml數(shù)，整個滴定過程不要超過 2分鐘。另取10ml用10%鹽酸酸化的蒸儲水做空白對照滴定。樣品提取液和空白對照各做三份。計(jì)算：y xT二-乂 100 = lOOg樣品中含抗壞血酸mg數(shù)，V=滴定時所用去染料 ml數(shù)。T=1m1染料能氧化抗壞血酸 mg數(shù)。W = 10 ml樣液相當(dāng)于含樣品之 g數(shù)。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):1整個操作過程要迅速，防止還原型抗壞血酸被氧化。滴定過程一般不超過2分鐘。2提取

19、得漿狀物如不易過濾，亦可離心，留取上清液進(jìn)行滴定。實(shí)驗(yàn)后記:凝膠過濾法測定蛋白質(zhì)的相對分子量時間安排:3學(xué)時1 .學(xué)習(xí)凝膠過濾法的操作方法2 .學(xué)習(xí)使用凝膠過濾法測定蛋白質(zhì)的相對分子量實(shí)驗(yàn)原理:葡聚糖凝膠過濾法測定蛋白質(zhì)分子量的原理，主要是依據(jù)這種凝膠具有分子篩作用，一定型號的凝膠具有大體上一定大小的孔徑。在一定的凝膠柱內(nèi)， 凝膠孔隙所占的體積稱為內(nèi)水容積vi,凝膠顆粒間的自由空間所占的體積稱為外水容積v0。當(dāng)樣品流經(jīng)凝膠柱時，大于孔隙的大分子完全不滲入到凝膠內(nèi)部，只需v0體積的洗脫液便可將其由一端洗脫到另一端，相反，如果樣品體積小于孔隙，則需要 v0+vi體積的洗脫液，才能將它們由一端洗 脫

20、到另一端。中等分子所需洗脫液體積介于兩者之間。如果假定蛋白質(zhì)分子近于球形，同時沒有顯著的水合作用， 則不同大小分子量的蛋白質(zhì)，進(jìn)入凝膠篩孔的程度不同，其洗脫體積決定于分子大小。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子量在10000-15000 時，蛋白質(zhì)在葡聚糖凝膠柱上層析的洗 脫體積和分子量的對數(shù)呈直線關(guān)系。若用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在一定型號葡聚糖凝膠柱 上層析，精確測其洗脫體積， 并以洗脫體積ve對分子量的對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知分子量的蛋白質(zhì)在相同條件下層析，根據(jù)其洗脫體積即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。試劑準(zhǔn)備:牛血清白蛋白(MR67000),胃蛋白酶(MR未知)，溶菌酶(MR 14300 ),細(xì)胞色素

21、C (MR12800 )重要實(shí)驗(yàn)步驟與教學(xué)設(shè)計(jì):一 溶脹凝膠取葡聚糖凝膠G-1003 克， 加 200ml 蒸餾水，沸水浴中溶脹5 小時。 待溶脹平衡后，傾去上層清液，包括細(xì)顆粒，然后再放些蒸餾水?dāng)噥y，靜置使凝膠下沉，再傾去上層清液， 至無細(xì)顆粒為止。溶脹平衡和漂洗凈的凝膠經(jīng)減壓抽氣除去氣泡，即可準(zhǔn)備裝柱。二 裝柱層析柱必須粗細(xì)均勻，柱管大小可根據(jù)試劑需要選擇。一般柱直徑為1 厘米，如果樣品量較多，最好用直徑2-3 厘米的柱。通常柱越長，分離效果越好，但柱過長，實(shí)驗(yàn)時間長而且樣品稀釋度大，易擴(kuò)散，反而分離效果不好。當(dāng)用作脫鹽時，柱高度為 50 厘米比較合適，在進(jìn)行分級分離時，100 厘米高度就

22、夠了。裝柱時，將柱垂直于鐵架上。在柱中加約1/3 柱體積的洗脫液，并趕凈濾板下方氣泡，然后將柱的出口關(guān)閉。把已經(jīng)溶脹好的凝膠調(diào)成薄漿，傾入柱內(nèi)，膠粒逐漸擴(kuò)散下沉。當(dāng)沉積的膠床至2-3 厘米高時，打開柱的出口，并注意控制操作壓以均勻不變的流速直到膠裝完為止。柱裝好后，在床的上面蓋上一張大小小于柱內(nèi)徑的濾紙片。再以洗脫液平衡柱層，直至層析的膠床高不變?yōu)橹?。?上樣稱取 2 毫克藍(lán)色葡聚糖2000 四份， 分別放在稱量瓶中，再稱取標(biāo)準(zhǔn)蛋白牛血清白蛋白，胃蛋白酶，溶菌酶，細(xì)胞色素c各40毫克，分別放在各稱量瓶中，各瓶加入n-乙酰酪氨酸乙酯飽和溶液2ml ，使混合物溶解后分別上柱。上柱時盡量保持床面的穩(wěn)

23、定。先打開柱的出口，待柱中洗脫液流至距床表面1-2 毫 米時，關(guān)閉出口，用滴管將樣品緩緩加至柱床表面，打開出口并開始計(jì)算流出體積，當(dāng)樣品滲入床中接近床表面 1毫米時關(guān)閉出口，小心的加入少量洗脫液，再打開柱的出口，使床表面的樣品也全部滲入柱內(nèi)。在床的表面再小心的加洗脫液，使高出床表面3-5厘米。四收集和鑒定層析開始，在柱的出口處以試管分管收集流出液，流速為 0.4ml/min,4ml/ 管，收集 液在280nm 處測od值。最高的一個 od值時的體積為吸收山I的洗脫液體積VE,當(dāng)n-乙酰酪氨酸乙酯洗脫峰出現(xiàn)后，按同樣的方法進(jìn)行第二個標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品的上柱，操作方法和步驟同前。將各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)測得的洗

24、脫液體積對它們的分子量對數(shù)作圖，則應(yīng)獲得一線性的標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):1根據(jù)層析柱的容積和所選用的凝膠溶脹后容積，計(jì)算所需凝膠干粉的重量，以將 用作洗脫劑的溶液使其充分溶脹。2裝柱要均勻，不要過松也不要過緊，最好在要求的操作壓下裝柱，流速不易過快， 但也不要過慢，使柱裝得過松，使層析過程中，凝膠床高度下降。3始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水分揮發(fā)，凝膠變干。實(shí)驗(yàn)后記:微機(jī)模擬蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn)時間安排:3學(xué)時目的類型:設(shè)計(jì)目的要求:3 .通過微機(jī)模擬蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生對幾種常用的生物大分子分離純化技術(shù)有一 個更全面的認(rèn)識。4 .建立起對生物大分子分離純化的比較嚴(yán)謹(jǐn)?shù)乃伎挤椒ā?實(shí)驗(yàn)原理:

25、“Protein”軟件有36個任務(wù)，即36組待分離純化的蛋白。任務(wù)要求利用軟件提供的幾種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，提純每一個目的蛋白，最終達(dá)到單向電泳一條帶，雙向電泳一個點(diǎn)，而且使用的人時和經(jīng)費(fèi)（根據(jù)提取步驟計(jì)算得到）不得超過一個特定值。在每個任務(wù)開始時，軟件給出 目的蛋白的一些性質(zhì)，如熱穩(wěn)定的溫度范圍和pH穩(wěn)定范圍等，利用這些信息，可以使實(shí)驗(yàn)少走彎路?！癙rotein”提供的分離純化方法有七種：熱變性；硫錢沉淀；排阻層析（凝膠色譜）；離子交換層析；吸附層析；聚焦層析；制備電泳。例如，在使用層析方法時，可在 Chromatography菜單下點(diǎn)選上述四種層析方法，彈出 相應(yīng)的參數(shù)對話框，此時要求輸入柱長、內(nèi)徑

26、、柱填料類型、緩沖液組分及 pH值和洗脫速 度等。如果采用梯度洗脫，還要求輸入梯度洗脫的初始和終末濃度及洗脫體積，在輸入?yún)?shù)之后，計(jì)算機(jī)模擬洗脫過程，并且畫出A280洗脫曲線和酶活曲線，此時，可以根據(jù)分離的情況和酶活的峰位來收集組份， 在收集之前還可以用電泳查看洗脫曲線上某一部位的分離效 果。在確認(rèn)收集之后，“Protein”軟件記錄該步操作的條件，計(jì)算回收率、純化倍數(shù)以及消 耗的人時和經(jīng)費(fèi)等。經(jīng)過反復(fù)多次的模擬實(shí)驗(yàn)，初步純化了目的蛋白， 在雙向電泳圖上能夠確定該蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)之后，還需要重新對其各步驟的實(shí)驗(yàn)條件，尤其是離子交換層析、排阻層析和制備電泳等實(shí)驗(yàn)步驟的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行修改,以找

27、到適合該蛋白質(zhì)的最佳分離純化實(shí)驗(yàn)方案和實(shí)驗(yàn)條件。在“Protein”所提供的各種分離純化方法中，熱變性法和鹽析法是比較好的粗提方法，在提純的早期使用效果較好。 層析是各種方法中最強(qiáng)有力的方法，制備電泳雖然純化倍數(shù)高，但是回收率低。在各種層析方法中， 又以離子交換層析最為有效和易于使用，并且耗費(fèi)的人時和經(jīng)費(fèi)也較少。排層層析和聚焦層析耗費(fèi)較大， 但在某些特定情況下，這兩種方法是不可 替代的?！癙rotein”提供了四種電泳方法：即， SDS-PAGE、PAGE、等電聚焦電泳和雙向電泳。這些電泳方法不但可以用以檢測樣品的純度，而且也給出了樣品的一些信息，如分子量、等電點(diǎn)等，這些信息對于后續(xù)提純有重要

28、的參考價(jià)值，等電聚焦電泳和PAGE還可以用于制備。儀器:電腦重要實(shí)驗(yàn)步驟與教學(xué)設(shè)計(jì):以酸性條件下穩(wěn)定的蛋白（ Windows 10號酶）為例：10號酶在56c以下穩(wěn)定，穩(wěn)定 pH范圍26.7 （酸性條件）（1）分離純化步驟：A）硫錢沉淀：初始百分飽和度0,終末百分飽和度 40% （質(zhì)量分?jǐn)?shù)），收集溶液組分B）熱變性：水浴溫度 55 C,水浴時間60minC）離子交換層析：填料 DEAE Sephadex A-50,柱長：10cm,柱內(nèi)徑：2.0cm,緩沖體系：磷酸氫二鈉 -Citrate （2.2 8.0）, pH 6.5 ,流速：0.3ml/min ,離子強(qiáng)度梯度洗脫：0.01mol/L-0.15mol/L ,洗脫體積：300ml管100ml管，做如下檢驗(yàn)。（2）檢測純化結(jié)果:A）二維電泳，pH 310,分離膠濃度10% （體積分?jǐn)?shù)），濃縮膠濃度3% （體積分?jǐn)?shù)）。電泳端圖B）PAGE:分離膠濃度10% （體積分?jǐn)?shù)），濃縮膠濃度3% （體積分?jǐn)?shù)）,緩沖體系