化妝品用化學(xué)原料體外3T3中性紅攝取光毒性試驗方法

1、化妝品用化學(xué)原料體外3t3中性紅攝取光毒性試驗方法 化妝品用化學(xué)原料 體外 3t3 中性紅攝取光毒性試驗方法 一、范圍 本方法規(guī)定了化妝品用化學(xué)原料體外3t3中性紅攝取光毒性試驗的范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語和定義、試驗原理、試驗材料與試劑、試驗步驟、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。 本方法推薦適用于評價化妝品用化學(xué)原料的潛在光毒性。 二、規(guī)范性引用文件 下列文件中的條款通過本方法的引用而成為本方法的條款。注明日期的引用文件，其后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本方法，但是，鼓勵使用單位對修訂部分的引用進行研究，并提出意見。研究是否可使用這些文件的最新版本。未注明日期的引用文件，其最新版本適用于

2、本方法。 經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（oecd）guidelines for the testing of chemicals: 3t3 nru phototoxicity test. no. 432 三、術(shù)語和定義 下列術(shù)語和定義適用于本方法。 （一）光毒性（phototoxicity） 皮膚一次接觸化學(xué)物質(zhì)后，繼而暴露于長波紫外線照射下所引發(fā)的一種皮膚毒性反應(yīng)。 （二）細胞活性（cell viability） 測量某一細胞群總活性的參數(shù)（如細胞溶酶體攝取活性染料中性紅），其數(shù)值取決于測定的終點和試驗所用的設(shè)計方案，并與細胞總數(shù)和/或細胞活力相關(guān)。 （三）相對細胞活性（relative cell v

3、iability） 通過與溶劑（陰性）對照組的相關(guān)性來表達的細胞活性，對照組除了未經(jīng)受試化學(xué)物質(zhì)處理外，整個試驗過程與試驗組一樣（或+irr或-irr）。 （四）光刺激因子（photo irritation factor; pif） 受試物分別在無光照(-irr)和有光照(+irr，無細胞毒性的紫外光/可見光（uv/vis）照射)條件下獲得兩組平行有效的細胞毒性濃度(ic 50 )，通過比較ic 50 的值得到的因子。 （五）半數(shù)抑制濃度（ic50） 使細胞活性下降50%的受試化學(xué)物質(zhì)的濃度。 （六）平均光效應(yīng)（mean photo effect; mpe） 受試物分別在無光照(-irr)和有

4、光照(+irr，無細胞毒性的uv/vis照射)條件下獲得兩組濃度反應(yīng)曲線，通過數(shù)學(xué)分析導(dǎo)出的數(shù)值。 （七）預(yù)測模型（prediction model） 將毒性試驗結(jié)果轉(zhuǎn)換為預(yù)測毒性潛力的算法。在本方法中，pif和mpe可用于把體外3t3中性紅攝取光毒性試驗的結(jié)果轉(zhuǎn)換為對光毒性潛力的預(yù)測。 四、試驗原理 光毒性是指應(yīng)用于機體的物質(zhì)經(jīng)暴露于光線后誘發(fā)或增強（在低劑量水平時明顯）的毒性反應(yīng)，或全身應(yīng)用一種物質(zhì)后由皮膚光照引起的反應(yīng)。中性紅是一種弱的陽離子染料，極易以非離子擴散的方式穿透細胞膜并在細胞溶酶體內(nèi)聚集。某些化學(xué)物質(zhì)和外界條件作用可引起細胞表面或溶酶體膜敏感性的改變導(dǎo)致溶酶體脆性增高等不可逆

5、的細胞毒性變化，從而導(dǎo) 致細胞吸收中性紅的能力下降。 本試驗方法通過測定3t3成纖維細胞經(jīng)化學(xué)物質(zhì)和紫外線照射聯(lián)合作用后細胞吸收中性紅的能力或細胞毒性的變化來判斷該化學(xué)物質(zhì)是否具有光毒性。 五、試驗材料與試劑 （一）光源類型 選擇合適的光源必須符合的標(biāo)準(zhǔn)包括：光源發(fā)射的光波長能被受試物吸收（吸收光譜），光的劑量（在一個合理的暴露時間內(nèi)能達到的劑量）能滿足已知光毒性化學(xué)物質(zhì)的檢測。此外所有的波長和劑量不能有損于試驗系統(tǒng)，如（紅外區(qū)域）熱量散發(fā)或類似 uvb 波長的高細胞毒性的干擾，因此光源要求能夠穩(wěn)定地釋放 uva 和可見光波長。 由于所有的太陽光模擬器都發(fā)射出相當(dāng)數(shù)量的 uvb，應(yīng)經(jīng)過適當(dāng)?shù)倪^

6、濾使 uvb0.1j/cm 2 。透過 96 孔組織培養(yǎng)板蓋的光強度建議為1.7mw/cm 2 光強度（即 5j/cm 2 ）劑量。 （二）細胞株 選用永生化小鼠成纖維細胞系balb/c 3t3成纖維細胞。要求細胞來源必須是具有公信力的機構(gòu)且能確保細胞品質(zhì)穩(wěn)定。 由于細胞對uva的敏感性隨傳代數(shù)的增加可能增高，建議用于試驗的balb/c 3t3成纖維細胞傳代次數(shù)最好少于100次。 測試單位若自行培養(yǎng)細胞株，則須定期檢測細胞株對uv光的敏感性，并確保無支原體污染。 （三）培養(yǎng)基 采用dmem培養(yǎng)基、胎牛血清或小牛血清（10%）、谷氨酰胺（4mmol/l）、抗生素（青霉素和鏈霉素，濃度分別為100

7、iu和100g/ml）， 在36.537.5, 5%7.5%co 2 條件下培養(yǎng)。 （四）溶劑的選擇 在測定前，應(yīng)首先評價受試物的溶解度，以選擇最佳溶劑體系。溶劑必須不與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不影響細胞活性。 能溶于水且濃度達1000g/ml的受試物可溶于預(yù)先加溫（37）和滅菌的磷酸鹽緩沖液（ebss或pbs）。水中溶解度有限的受試物（1000g/ml）可用二甲基亞砜（dmso）或乙醇（etoh）等溶劑溶解。使用dmso或etoh作為溶劑時，其終濃度不得超過總體積的1%（v/v），陰性對照組和受試物組溶劑的體積比例應(yīng)相同。 （五）受試物的配制 受試物必須在使用前新鮮配制。建議所有的化學(xué)物質(zhì)操作和

8、細胞處理初期都應(yīng)避免受試物在光激活或光降解的光線條件下進行。 每次實驗應(yīng)設(shè)空白對照、溶劑對照和陽性對照（推薦使用氯丙嗪）。加樣示意圖見附錄b。 （六）受試物劑量的設(shè)置 需通過預(yù)實驗確定有光照和無光照條件下受試物的濃度范圍。用溶劑將受試物原液使用同一常數(shù)稀釋因子（如 10 3.16）稀釋成8個濃度，相關(guān)濃度范圍應(yīng)包括從最大細胞毒性至幾乎無細胞毒性濃度（細胞存活率在20%100%的范圍）。 如果預(yù)實驗結(jié)果表明在濃度等于 1000g/ml 時仍未出現(xiàn)細胞毒性，則建議最高濃度為 1000g/ml；若出現(xiàn)細胞毒性的濃度低于 1000g/ml時，有細胞毒性的濃度少于三種，則需要進行重復(fù)試驗或使用更小的稀釋

9、因子，直至出現(xiàn)有細胞毒性的濃度至少三種。如果根據(jù)受試物的溶解度，最高濃度不能達到 1000g/ml，則以最大溶解度時的濃度作為最高濃度， 避免受試物在任何濃度出現(xiàn)沉淀。 如果在無光照條件下(-irr)受試物在最高濃度時仍然不具有細胞毒性，而在有光照條件下(+irr)出現(xiàn)強烈細胞毒性，則在-irr試驗和+irr試驗中可采用不同的試驗濃度。 （七）中性紅（neutral red，nr） 化 學(xué) 名 為 3- 氨 基 一 7 一 二 甲 氨 基 一 2 一 甲 基 吩 嗪 鹽 酸 鹽(3-amino-7-dime-2-thylamino-2-methylphenazine hydrochloride

10、) ， cas 編號:553-24-2；或國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，編號：100460。 （八）中性紅溶液 1中性紅原液。稱取0.4g中性紅染料，溶于100ml蒸餾水（室溫條件下可保存2個月） 2中性紅使用液。在79ml dmem培養(yǎng)液中加入1ml中性紅原液，即為使用液。中性紅終濃度為50g/ml。 （九）中性紅解吸附溶液 將蒸餾水、乙醇、乙酸按49:50:1比例配制（現(xiàn)用現(xiàn)配，儲存不超過1小時）。 六、試驗步驟 （一）加100l培養(yǎng)基于96孔組織培養(yǎng)板的外圍孔（空白對照），在其余孔中加入100l密度為110 5 個細胞/ml的細胞懸液（即110 4 細胞/孔）。每次試驗制備兩個板，包括相同的受試物濃

11、度系列、溶劑對照、空白對照和陽性對照，一個板用于確定細胞毒性（-irr），另一個板用于確定光毒性（+irr）。 （二）培養(yǎng)細胞24小時（5%7.5%co 2 ，37）直至它們形成單層半飽和細胞。該培養(yǎng)過程允許細胞恢復(fù)和粘連。 （三）去除培養(yǎng)液，用150l ebss或pbs輕柔沖洗細胞一次或兩次。加入100l含適當(dāng)濃度受試物或溶劑的緩沖液到孔中。培養(yǎng)細胞1小時（5%7.5%co 2 ，37）。 （四）在室溫下將其中一個板進行光照（+irr）暴露，以1.7mw/cm 2光強度透過96孔板蓋照射細胞50分鐘；同時將另一個平板無光照（-irr）置于暗盒內(nèi)50分鐘。 （五）去除受試溶液，用150l eb

12、ss或pbs仔細沖洗細胞兩次。加入100l培養(yǎng)液，培養(yǎng)過夜（1822小時，5%7.5%co 2 ，37）。 （六）在相差顯微鏡下檢查細胞，記錄受試物細胞毒性所致細胞形態(tài)學(xué)的改變，用于排除試驗誤差。 （七）中性紅吸收（nru）測量。細胞吸收中性紅進入溶酶體和活細胞體內(nèi)空泡，可用作細胞數(shù)量和活性的定量指標(biāo)。 1用150l預(yù)溫的ebss或pbs沖洗細胞一次或兩次。輕柔拍打平板，去除沖洗溶液。加入100l含50g/ml中性紅的培養(yǎng)液，在5%7.5%co 2 ，37和濕度適宜的環(huán)境下培養(yǎng)細胞3小時。 2去除中性紅培養(yǎng)液，用150l ebss或pbs沖洗細胞一次或兩次。 3輕輕倒出并吸干全部ebss或pb

13、s。 4準(zhǔn)確加入150l中性紅解吸附溶液。 5在微量滴定平板振蕩器上震蕩96孔板10分鐘，直至中性紅從細胞內(nèi)被提取出來，并形成均勻溶液。 6用分光光度計或酶標(biāo)儀測定中性紅提取物溶液在540nm波長處的光密度。用空白孔作為參考對照。 七、結(jié)果評判標(biāo)準(zhǔn) （一）確定以光刺激因子（pif值）為基礎(chǔ)的預(yù)測模型 1通過分析在有光照（+irr）和無光照（-irr）兩種情況下獲得的細胞毒性濃度反應(yīng)曲線，確定能抑制50%細胞活性的受試物濃度（ic 50 ），按下列公式計算光刺激因子（pif）。 pif ic 50 （-irr） ic 50 （+irr） 評判標(biāo)準(zhǔn)：pif2：預(yù)測"無光毒性'；p

14、if5：預(yù)測"有光毒性'。pif介于25之間，需進行重復(fù)試驗；如果pif仍介于25之間，預(yù)測"有潛在光毒性'。 2如果受試物在有光照（+irr）時有細胞毒性，無光照（-irr）時無細胞毒性，且細胞毒性試驗所使用的濃度已達最高受試濃度（cmax）時，可按照下列公式計算pif： pifcmax（-irr）/ ic 50 （+irr） 評判標(biāo)準(zhǔn)為：如果只獲得一個"pif'，那么任何pif 1的值都能提示"有潛在光毒性'。 3受試物在最高濃度時仍未顯示任何細胞毒性，用"pif*1'表示，提示"無潛在光毒

15、性'。 （二）確定以平均光效應(yīng)（mpe值）為基礎(chǔ)的預(yù)測模型 通過在濃度網(wǎng)格上比較有光照（+irr）和無光照（-irr）兩種情況下獲得的細胞毒性濃度反應(yīng)曲線（i1，.，n）可得到平均光效應(yīng)（mpe），細胞毒性濃度反應(yīng)曲線的染毒濃度需在有光照（+irr）和無光照（-irr）試驗共有的濃度范圍內(nèi)選擇。濃度ci的光效應(yīng)（pei）等于濃度效應(yīng)（cei）和反應(yīng)效應(yīng)（rei）的乘積。使用專門的軟件"photo32或更高版本'求得平均光效應(yīng)（mpe），建立以平均光效應(yīng)（mpe）為基礎(chǔ)的預(yù)測模型。 通過將mpe與臨界閾值mpec比較，預(yù)測化學(xué)物潛在光毒性的預(yù)測模型。 閾值mpec0.1

16、 評判標(biāo)準(zhǔn)： 如果mpe0.1：預(yù)測無潛在光毒性； 如果mpe0.15：預(yù)測有潛在光毒性。 如果mpe介于0.10.15之間，需進行重復(fù)實驗；如果mpe仍介于0.10.15之間，預(yù)測有潛在光毒性。 附錄 a nru pt 試驗流程圖 時間 步驟 0 小時 接種 96 孔平板：110 4 個細胞/孔培養(yǎng)（37、5%7.5%co 2 、24h）。 24 小時 去除培養(yǎng)液，用 150l ebss/pbs 輕柔沖洗細胞一次或兩次。 24 小時 分別用 100l 8 種不同濃度的受試物處理細胞，培養(yǎng)細胞 1h（37、5%7.5%co 2 ）。 25 小時 光毒性：室溫下暴露于有光照（+irr）（1.7m

17、w/cm 2 ）50 分鐘（即 5j/cm 2 ） 細胞毒性：室溫下將另一個平板置于黑暗環(huán)境 50 分鐘。 25 小時 50 分鐘 去除受試溶液，用 150l ebss 或 pbs 仔細沖洗細胞兩次，再用培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞（37、5%7.5%co 2 、18h22h 過夜）。 48 小時 顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)改變；去除培養(yǎng)液，用 150l ebss 或 pbs 沖洗細胞一次或兩次，加入 100l 含 50g/ml 中性紅的培養(yǎng)液培養(yǎng)（37、5%7.5%co 2 、3h）。 51 小時 去除中性紅培養(yǎng)液，用 150l ebss 或 pbs 沖洗細胞一次或兩次，加入150l 中性紅解吸附溶液。 51

18、 小時 震蕩平板 10 分鐘。 51 小時 10 分鐘 檢測在 540nm 波長下細胞對中性紅的吸收情況（反映細胞活性）。 附錄 b 96 孔板加樣示意圖 1建議使用如下式樣 96 孔板。如使用軟件 nru-pit 進行數(shù)據(jù)分析，則必須按以下所示，準(zhǔn)確設(shè)計 96 孔板的加樣。 2鑒于在平板四周外圍孔可能發(fā)生蒸發(fā)作用，建議將四邊這些孔作為空白對照，以糾正可能出現(xiàn)的塑膠材料對中性紅吸收所造成的結(jié)果干擾。 396 孔的加樣示例如下： b b b b b b b b b b b b b uc c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 uc b b uc c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 uc b b uc c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 uc b b uc c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 uc b b uc c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 uc b b uc c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 uc b b b b b b b b b