過氧化氫刺激人牙髓干細胞的衰老進程

1、過氧化氫刺激人牙髓干細胞的衰老進程210093 ; 2南通大學附屬醫(yī)院口腔徐克1,馮桂娟2,馮興梅2,黃丹2,鄭科2,唐恩溢1(1南京大學醫(yī)學院,江蘇省南京市科,江蘇省南通市226001)引用本文：徐克,馮桂娟,馮興梅,黃丹,鄭科,唐恩溢.過氧化氫刺激人牙髓干細胞的衰老進程J.中國組織工程研究,2021, 20(10):1481-1487.文章快速閱讀:DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2021.10.016ORCID: 0000-0002-2872-1905 (馮桂娟)徐克,男,1982年生, 江蘇省南通市人,漢族, 2006年南通大學畢業(yè), 主治醫(yī)師,主要從事口腔

2、 頜面外科及牙髓干細胞 生物學特性方面的研究.通訊 馮桂娟,醫(yī)師, 碩士,南通大學附屬醫(yī)院 口腔科,江蘇省南通市 226001中圖分類號：R394.2文獻標識碼：B文章編號：2095-4344(2021)10-01481-07稿件接受：2021-01-24文題釋義：牙髓干細胞：2000年,Gronthos等人利用酶消化的方法,從人第三磨牙中別離出比骨髓基質(zhì)干細胞具有更高克隆水平和增殖水平的牙髓干細胞.牙髓干細胞的鑒別主要依賴于它的生物學特性,包括細胞體積小、集落生成水平、高增殖水平、自我更新水平和多潛能分化水平.細胞衰老：指由DNA損傷、氧化應(yīng)激、基因表達紊亂和其他有害刺激導致的不可逆的細胞生

3、長停滯,它包含了細胞增殖及功能的改變,細胞的衰老促進了機體的老化和相關(guān)疾病的發(fā)生.研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)細胞衰老的機制有多種假說,例如端粒酶學說、DNA損傷學說、氧化應(yīng)激學說等.摘要背景：細胞移植治療受區(qū)存在氧化應(yīng)激過程,影響療效.研究氧化應(yīng)激對牙髓干細胞的影響及機制方面的報道較少.目的：別離培養(yǎng)人牙髓干細胞,分析參加過氧化氫(H2O2)對其衰老程度的影響.方法：牙髓干細胞分為3組,分別用PBS、100 g mol/L H2O2、200 g mol/L H2O2刺激2 h.倒置顯微 鏡下觀察細胞形態(tài),半乳糖普酶染色觀察細胞衰老程度,BrdU試劑盒和細胞計數(shù)法檢測細胞增殖能力,免疫熒光檢測細胞骨架排列情況

4、和sirt1蛋白的表達,Western Blot法測定sirt1、p16蛋白的表達.結(jié)果與結(jié)論：牙髓干細胞呈成纖維細胞樣梭形外觀.H2O2刺激后,細胞體積增大、3半乳糖普酶染色加深、細胞增殖水平降低,隨著H2O2濃度增加,牙髓干細胞衰老增強,在此過程中,p16表達上調(diào),sirt1表達受到抑制.結(jié)果說明H2O2刺激促進牙髓干細胞衰老,sirt1、p16參與了此過程,為牙髓干細胞移植提供了理論根底和實驗支持.關(guān)鍵詞：干細胞；培養(yǎng)；牙髓干細胞；過氧化氫；衰老；p16； sirt1；國家自然科學基金主題詞：牙髓；干細胞；過氧化氫；細胞衰老；組織工程基金資助：國家自然科學基金青年基金工程(8150080

5、9)Xu Ke, Attending physician, Medical School of Nanjing University, Nanjing 210093, Jiangsu Province, ChinaCorresponding author: Feng Gui-juan, Master, Physician, Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, ChinaHydrogen peroxide accelerate

6、s senescence of human dental pulp stem cellsXu Ke 1, Feng Gui-juan 2, Feng Xing-mei 2, Huang Dan 2, Zheng Ke 2, Tang En-yi 1 (1Medical School of Nanjing University, Nanjing 210093, Jiangsu Province, China; 2 Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangs

7、u Province, China)AbstractBACKGROUND: The process of oxidative stress that impacts the curative effect exists in the region which accepts cell transplantation. However, there are few reports about the effects of oxidative stress on human dental pulp stem cells and relevant mechanism.OBJECTIVE: To un

8、derstand the effect of hydrogen peroxide on the senescence of human dental pulp stem cells.METHODS: Human dental pulp stem cells were isolated and cultured in PBS, 100 and 200u mol/Lhydrogen peroxide for 2 hours, respectively. Cell morphology was observed under inverted microscope, degree of cell se

9、nesc ence monitored by- galactosidase staining, cell proliferation ability detected by BrdUkit and cell counting method, cytoskeleton of dental pulp stem cells and expression of sirt1 tested using immunofluorescence method, and expression of sirt1 and p16 proteins measured by western blot assay. RES

10、ULTS AND CONCLUSION:Dental pulp stem cells exhibited a fibroblast-like morphology withspindle-shaped appearance. After stimulated by hydrogen peroxide, the cell volume was enlarged, the 3galactosidase staining deepened and the proliferation of dental pulp stem cells reduced. The enhancement of senes

11、cence of dental pulp stem cells was accompanied with the increasing concentration of hydrogen peroxide, and in this process, the expression of p16 was raised while the expression of sirt1 was decreased. In conclusion, the senescence of human dental pulp stem cells can be promoted by the stimulation

12、of hydrogen peroxide, and sirt1 and p16 are involved in this process. Our findings may provide a theoretical and experimental foundation for autologous transplantation of dental pulp stem cells.Subject headings: Dental Pulp; Stem Cells; Hydrogen Peroxide; Cell Aging; Tissue Engineering Funding: the

13、National Natural Science Foundation of China, No. 81500809Cite this article: Xu K, Feng GJ, Feng XM, Huang D, Zheng K, Tang EY. Hydrogen peroxide accelerates senescence of human dental pulp stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2021;20(10):1481-1487.0 引言 Introduction牙髓是間充質(zhì)干細胞最理想的來源之一.2000年,Gr

14、onthos等1利用酶消化法,從人第三磨牙中別離出比 骨髓基質(zhì)干細胞具有更高克隆水平和增殖水平的干細 胞,并將其命名為牙髓干細胞.牙髓干細胞顯示多潛 能分化水平,可以分化為各種細胞,如成骨細胞、成 牙本質(zhì)細胞、成軟骨細胞、成脂肪細胞、神經(jīng)細胞和 成肌細胞等2-5.牙髓干細胞很容易被別離、培養(yǎng),且 具有低免疫原性,是理想的種子細胞3' 6-7.骨缺損等部位存在缺血、缺氧、炎細胞浸潤等因素8,產(chǎn)生大量活性氧,出現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài),損害細胞活性,影響牙 髓干細胞移植效果9.過氧化氫(hydrogen peroxide , H2O2)是活性氧簇的主要成員之一,可通過多種途徑損 害細胞10-12 o

15、既往研究顯示H2O2可以誘導間充質(zhì)干細胞 衰老13-17,研究氧化應(yīng)激對牙髓干細胞的影響及機制, 有利于提升細胞移植的療效.實驗采用不同濃度H2O2處理牙髓干細胞,觀察H2O2誘導應(yīng)激性衰老細胞形態(tài)、0-半乳糖甘酶活性、細胞增殖水平、細胞骨架變化及其作用機制,為優(yōu)化牙髓干細胞移植治療疾病提供理論依據(jù)和實驗根底.1 材料和方法 Materials and methods1.1 設(shè)計細胞學體外觀察實驗.1.2 時間及地點實驗于2021年10至12月在南通大學附屬醫(yī)院完成.1.3 材料過氧化氫刺激人牙髓干細胞衰老實驗所用主要試劑與儀器：試劑及儀器來源DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、100 U/mL 美國H

16、yClone公司 青霉素、100 mg/L鏈霉素3 g/L I型膠原酶、4 g/L分散酶美國Sigma公司伊半乳糖甘酶試劑盒碧云天公司BrdU試劑盒上海酶聯(lián)生物科技h2o2美國Santa Cruz公司F-actin武漢艾美捷科技兔抗GAPDH抗體、兔抗人p16抗體、兔抗人sirt1抗體、鼠抗兔生物素化二抗美國Santa Cruz公司熒光顯微鏡德國Leica公司1.4 實驗方法1.4.1 牙髓干細胞別離、培養(yǎng)、鑒定選擇正畸減數(shù)拔除的健康牙齒標本,告知患者拔除的牙齒將用于提取牙 髓干細胞,得到所有患者知情同意,并簽署?南通大學 附屬醫(yī)院知情同意書?.在超凈臺上用碘伏沖洗正畸減 數(shù)拔除的健康牙齒,再

17、用無菌生理鹽水沖洗至無血跡, 用咬骨鉗沿釉牙骨質(zhì)界翻開髓腔,鐐子取出牙髓,剪去 根部的牙髓組織.將 3 g/L I型膠原酶與4 g/L分散酶以 1 ： 1比例混合,兩種酶以1 ： 10的體積與剪碎的牙髓混 合消化1 h ,消化后的組織經(jīng) 1 000 r/min離心5 min ,棄 上清液,加完全培養(yǎng)液 體積分數(shù)為10%胎牛血清、1% 青霉素/鏈霉素、DMEM混勻、吹打,經(jīng) 70 am過濾網(wǎng) 過濾,獲得的細胞懸液接種于25 cm2培養(yǎng)瓶,參加完全培養(yǎng)液,之后三四天半量換液,細胞到達70%-80%融合后,用0.25%胰蛋白酶室溫消化 3 min , 1 000 r/min 離心5 min ,棄上清

18、,沉淀吹打均勻,以 1 : 3比例傳代. 牙髓干細胞進行成骨、成軟骨、成脂肪分化水平鑒定18.1.4.2 實驗分組第1組：牙髓干細胞用 PBS刺激作為對照組.第2組：牙髓干細胞用100心mol/L H2O2刺激, 持續(xù)時間為2 h.第3組：牙髓干細胞用200 m mol/L H2O2 刺激,持續(xù)時間為2 h 01.4.3 3半乳糖普酶染色取對照組和H2O2刺激組牙髓干細胞,按1X105/孔接種到24孔板中,重復3孔,進 行&半乳糖普酶染色.根據(jù)歹半乳糖普酶染色試劑盒說 明書進行操作：小心吸去 24孔板里的培養(yǎng)液,每孔參加 500心晴洗液A液,清洗生長中的細胞外表；去除孔 里的清洗液后每

19、孔參加 500心L固定液B液,孵育5 min ； 吸去固定液,每孔參加 500心瞰性液C液,重復1次后 去除C液,每孔參加400心L染色液,放入37 c培養(yǎng)箱孵 育5 ho在光學顯微鏡下觀察和計數(shù),0-半乳糖昔酶陽性細胞呈藍色.1.4.4 細胞計數(shù)BrdU染色法：牙髓干細胞以3X104/孔接種于6孔板 內(nèi),PBS或不同濃度H2O2刺激2 h后,去除H2O2,繼續(xù)用 普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,用BrdU試劑盒檢測增殖情況.牙 髓干細胞培養(yǎng)液中參加 100 11 mol/L BrdU酶標液于37 C 孵化4 h,移除細胞培養(yǎng)液,固定細胞,FixDenat溶液使DNA變性,參加抗BrdU-POD 工作

20、液,370 nm波長處 測定裂解液的吸光度值,每組取6個平行樣本進行統(tǒng)計.細胞計數(shù)法：牙髓干細胞以3X104/孔接種于6孔板 內(nèi),PBS或不同濃度H2O2刺激2 h后,去除H2O2,繼續(xù) 用普通的培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h ,鏡下觀察,統(tǒng)計細胞數(shù),每組取6個平行樣本進行統(tǒng)計.1.4.5 F-actin免疫熒光染色免疫熒光觀察H2O2刺激后牙髓干細胞的細胞骨架變化.取牙髓干細胞進行固 定,PBS清洗,血清封閉后孵育F-actin , DAPI染色液復染30 min ,熒光顯微鏡下觀察.1.4.6 Western Blot檢測sirt1和p16蛋白表達 收集牙 髓干細胞,用Western Blot分析s

21、irt1和p16表達.常規(guī)裂 解液裂解細胞,離心后收集上清,樣品進行 SDS-PAGE 電泳,280 mA恒流轉(zhuǎn)PVDF月190 min ,含5%脫脂奶粉 緩沖液封閉,分別用一抗 兔抗人sirt1、兔抗人p16、二 抗生物素化二抗鼠抗兔IgG進行孵育及顯色觀察、掃描 分析結(jié)果.1.4.7 免疫熒光檢測sirt1蛋白表達收集牙髓干細胞,用免疫熒光分析sirt1表達.分別用一抗兔抗人sirt1、 二抗生物素化二抗鼠抗兔IgG進行孵育,DAPI染色液 復染30 min ,熒光顯微鏡下觀察.1.5 主要觀察指標牙髓干細胞形態(tài).牙髓干細胞3半乳糖昔酶活性.牙髓干細胞增殖情況.牙髓干 細胞骨架排列情況.牙

22、髓干細胞衰老相關(guān)蛋白表達.1.6 統(tǒng)計學分析采用SPSS 16.0軟件處理,數(shù)據(jù)用x太表示.組間比擬采用t檢驗,P < 0.05為差異有顯著 性意義.2 結(jié)果 Results2.1 H2O2對牙髓干細胞形態(tài)的影響原代細胞一兩天貼壁,第4, 5天細胞呈集落樣生長,取第3代牙髓干細胞置于倒置顯微鏡下觀察,細胞形態(tài)呈成纖維細胞樣梭 形外觀圖1A.經(jīng)過100, 200心mol/L H2O2刺激2 h, 細胞體積增大,變扁平,失去紡錘體樣形態(tài)圖1B和C.2.2 H2O2處理牙髓干細胞后&半乳糖普酶活性增加B-半乳糖普酶試劑盒檢測100, 200 m mol/L H2O2刺激2 h后牙髓干細

23、胞中衰老細胞數(shù),對照組為18.0 21% , 100 心 mol/L H2O2組為42.0 24% , 200 心 mol/L H2O2 組為79.0 +2.5% ,與對照組相比,100, 200心mol/LH 2O 2刺激后0-半乳糖昔酶陽性細胞數(shù)比例顯著增加圖2A-D.2.3 H2O2處理抑制牙髓干細胞增殖不同?度H2O2作用對牙髓干細胞增殖影響的吸光度值檢測結(jié)果見圖3A o與對照組相比,隨著H2O2濃度增加,吸光度值呈濃度依 賴性降低.細胞計數(shù)法分析100, 200 amol/L H 2O2對牙髓干細胞增殖的影響,隨著H2O2刺激濃度增加,牙髓干 細胞數(shù)降低圖3B.圖1H2O2刺激下牙髓

24、干細胞形態(tài)學改變刀00Figure 1 The morphology change of dental pulp stem cells stimulated by hydrogen peroxide 200 x圖注：圖中A為對照組牙髓干細胞呈成纖維細胞樣梭形外觀；B, C為100, 200 m mol/L H2O2刺激后牙髓干細胞失去成纖維細胞樣梭形外觀,細胞體積增大,變扁平,且細胞形變程度隨H2O2濃度增大而增大.H2O2 mol/L對照組 1002002 0 8 6 4 2 0000值度光吸AB1003t80乂60數(shù) 胞細40200對照組 100200圖2 H2O2處理牙髓干細胞后B-半乳

25、糖普酶活性增加Figure 2 The activation of -galactosidase was increased by hydrogen peroxide stimulation圖注：圖中A-C為對照組,1001 mol/L H2O2組,200 u mol/L H2O2組 加半乳糖普酶染色,隨H2O2濃度增加,3半乳糖昔酶陽性細胞數(shù)比例顯著增加刀00; D為小半乳糖普酶陽性細胞百分比與對照組比擬,aP < 0.05 0圖3 H2O2處理抑制牙髓干細胞增殖Figure 3 Dental pulp stem cells grew more slowly after stimula

26、tion with hydrogen peroxide 圖注：圖中A為BrdU染色法分析細胞增殖情況 與對照組比擬,aP < 0.05; B為細胞計數(shù)法分 析細胞增殖情況與對照組比擬,aP < 0.05 0乩029mol/L乩02 mol/L200;H2O2刺激后牙髓干細胞骨圖4 H2O2處理導致牙髓干細胞骨架排列紊亂刀00Figure 4 F-actin distribution was abnormal in dental pulp stem cells after stimulation with hydrogen peroxide 圖注：圖中 A-C分別為PBS、100 u

27、 mol/L、200mol/L H2O2刺激牙髓干細胞,F-actin免疫熒光染色可見架排列紊亂.2.4 H2O2處理影響牙髓干細胞骨架排列細胞免疫熒光顯示100, 200 11 mol/L H2O2刺激牙髓干細胞后,細胞 骨架排列紊亂圖4A-C.2.5 H2O2誘導牙髓干細胞衰老后相關(guān)蛋白表達應(yīng)用Western Blot檢測牙髓干細胞 sirt1和p16蛋白表達水平,結(jié)果顯示：與對照組相比,隨著H2O2濃度增加,sirt1表達水平呈濃度依賴性降低,p16表達水平呈濃度依賴性增高圖5A, B.免疫熒光結(jié)果進一步驗證,200心mol/LH2O2刺激組牙髓干細胞中sirt1的表達水平較對照組顯著下

28、降圖6A-F.Sirt p16GAPDHA H2O2( m mol/L)對照組100200B1.6丁 1.2水空0.8表白蛋0.40對照組100200H2O2( m mol/L)圖5 H2O2處理抑制牙髓干細胞中sirt1表達,促進p16表達Figure 5 Dental pulp stem cells stimulated with hydrogen peroxide had the lower level of sirt1 and the higher level of p16圖注：圖中A為Western Blot法分析各組牙 髓干細胞 sirt1和p16的表達；B顯示H2O2 組與對照組

29、比擬差異有顯著性意義,aP <0.05 .圖6 H2O2處理抑制牙髓干細胞中sirt1表達(刀00)Figure 6 Dental pulp stem cellsstimulated with H 2O2 had the lower level ofsirt1 ( 200)圖注：圖中A-C為PBS刺激牙髓干細胞,免 疫熒光法分析sirt1表達；D-F為200 u mol/L H 2O 2刺激牙髓干細胞,免疫熒光法分析 sirt1 表達水平較對照組顯著下降.3 討論 Discussion牙髓干細胞具有多向分化和高增殖水平,與骨髓間 充質(zhì)干細胞比擬,其增殖水平、成骨分化水平和成軟骨 分化水平

30、更高18.牙髓干細胞不僅可以應(yīng)用于牙缺失、 骨缺損的修復,而且可以應(yīng)用于關(guān)節(jié)炎、心臟疾病、肌 肉萎縮等治療,取得了良好的治療效果19-21 O雖然牙髓干細胞的治療已經(jīng)取得了一些進展,但成功的細胞移植 治療還取決于牙髓干細胞體外培養(yǎng)條件和體內(nèi)移植的 局部微環(huán)境.損傷區(qū)的缺血、缺氧、炎細胞浸潤等因素, 可導致出現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài),過量的活性氧損害細胞活 性,降低其在損傷區(qū)的存活率,極大限制了牙髓干細胞 的移植效率22-24 OH2O2是活性氧簇的主要成員之一,可通過多種途 徑損害細胞,使細胞膜脂質(zhì)過氧化,抑制蛋白質(zhì)的功能, 破壞核酸和染色體等25-26 o既往研究顯示異常增高的活 性氧不利于干細胞靜息

31、狀態(tài)的維持和干細胞增殖,適量 增加活性氧那么有利于局部類型干細胞的增殖和分化.此外,干細胞內(nèi)低濃度活性氧是維持其靜息狀態(tài)的重要保 證,適當增高活性氧濃度那么可促進干細胞的分化成熟與 增殖,但濃度過大那么會損傷細胞的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸,導致細胞凋亡27.此項研究采用不同濃度H2O2處理牙髓干細胞,觀察細胞形態(tài)、小半乳糖甘酶活性、細胞增殖活性、細胞骨架變化及其作用機制,為優(yōu)化牙髓干細 胞移植治療疾病提供理論依據(jù)和實驗根底.既往研究顯 示H2O2可以誘導間充質(zhì)干細胞衰老14' 28.最新的研究發(fā)現(xiàn)100, 200 m mol/L H2O2可以促進骨髓間充質(zhì)干細 胞發(fā)生衰老,400 m mol

32、/L H2O2刺激導致其死亡,所以 實驗選擇100, 200 11 mol/L H2O2刺激牙髓干細胞11. 細胞衰老包括兩種類型：一種是細胞在體外培養(yǎng)過程中會逐漸到達一個增生的極限,此時細胞會停止分裂增 殖,進入衰老狀態(tài),即復制性衰老；二是外界局部因素 對細胞的刺激逐漸積累而導致細胞喪失了自我增殖分 化或修復的功能,通常被稱為早熟性衰老,主要受環(huán)境 的影響29 o課題組利用 H2O2短刺激牙髓干細胞使其在 氧化應(yīng)激作用下誘導產(chǎn)生早熟性衰老.衰老的細胞表現(xiàn)為細胞變扁平、細胞體積增大、B-半乳糖甘酶高表達、細胞周期停滯和細胞骨架紊亂30,同時也會激活 p16、p53等衰老信號通路的活化,進而啟動

33、衰老反響.實驗 結(jié)果顯示,與對照組相比,H2O2作用2 h后牙髓干細胞 體積增大,變扁平,失去紡錘體樣形態(tài).卜半乳糖甘酶活性能反映細胞溶酶體的功能狀態(tài),被公認為是細胞衰 老程度的重要標志之一.實驗結(jié)果說明,與對照組相比,100, 200 m mol/L H2O2刺激后0-半乳糖甘酶陽性細胞 數(shù)顯著增加,牙髓干細胞呈現(xiàn)衰老征象.利用 BrdU試 劑盒和細胞計數(shù)法檢測 H 2O 2刺激對牙髓干細胞增殖的 影響,結(jié)果顯示,隨著 H2O2刺激濃度增加,牙髓干細 胞數(shù)降低.活性氧的產(chǎn)生可以促進DNA損傷31-34 o在老齡鼠的幾乎所有器官都出現(xiàn)DNA損傷,通過p16信號通路促進細胞衰老35.p16基因是

34、衰老誘導基因,可以直接 引起細胞衰老,p-Rb磷酸化,cyclinDI與cyclin依賴 激酶4和cyclin依賴酶6結(jié)合成復合體來限制細胞周 期Gi期進入S期進程,而此過程可以被cyclin依賴激酶抑制劑調(diào)節(jié),如 p16蛋白36.結(jié)果顯示,隨著H2O2濃度增加,p16表達水平呈濃度依賴性增高.sirt1作為組蛋白去乙酰酶,不僅調(diào)節(jié)著組蛋白去乙?；?還調(diào)節(jié) 著一些和細胞周期密切相關(guān)的基因,進而影響細胞的壽 命.作為可能潛在的衰老抑制基因,它可能與其他衰老 和細胞周期調(diào)控基因一樣,在某種程度上通過調(diào)節(jié)多個 基因,在細胞水平上調(diào)節(jié)哺乳類動物細胞生命的進程37.既往研究報道sirt1基因的過表達和白

35、藜蘆醇的激活可以 在WI38細胞和2BS細胞中顯著降低 p16基因的活性, 提升Rb的磷酸化,進而增加2BS細胞傳代壽命,增加 了 Gi期細胞的比例,細胞生長加快,延緩了衰老38.研究發(fā)現(xiàn)sirt1/ERK/S6K1可能是衰老的原因之一,而且磷酸化的 ERK/S6K1 可以通過提升細胞分化抑制蛋 白或DNA結(jié)合抑制蛋白的表達,降低 p16的基因活性 進而抑制衰老38.實驗結(jié)果亦發(fā)現(xiàn) H2O2刺激組牙髓干 細胞sirt1表達水平呈濃度依賴性降低.作者奉獻：實驗設(shè)計為唐恩溢,實驗實施為徐克,實 驗評估為馮興梅,資料收集為鄭科.利益沖突：所有作者共同認可文章內(nèi)容不涉及相關(guān)利 益沖突.倫理問題：選擇正

36、畸減數(shù)拔除的健康牙齒標本,告知 患者拔除的牙齒將用于提取牙髓干細胞,得到所有患者知 情同意,并簽署?南通大學附屬醫(yī)院知情同意書?.文章查重：文章出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻檢測 系統(tǒng)進行3次查重.文章外審：本刊實行雙盲外審制度,文章經(jīng)國內(nèi)小同 行外審專家審核,符合本刊發(fā)稿宗旨.作者聲明：文章第二作者對研究和撰寫的論文中出現(xiàn) 的不端行為承當責任.論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù) 包括 計算機數(shù)據(jù)庫記錄及樣本已根據(jù)有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷 毀,可接受核查.文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議.4參考文獻References1 Gronthos S, Mankani M, Brah

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39、dental pulp stem cells: a useful source of living autologous fibrous bone tissue (LAB). J Bone Miner Res. 2005;20(8):1394-1402.5 Laino G, Carinci F, Graziano A, et al. In vitro bone production using stem cells derived from human dental pulp. J Craniofac Surg. 2006;17(3):511-515.6 Arora V, Arora P ,

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