病原學(xué)、免疫學(xué)及生化檢測(cè)

1、病原學(xué)、免疫學(xué)及生化檢測(cè) 微生物是存在于自然界中的一群體形細(xì)小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、肉眼直接看不見、必須借助光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡放大幾百倍、幾千倍甚至幾萬(wàn)倍才能觀察到的微小生物。 使用油鏡時(shí)，需在玻片上滴加香柏油。這是因?yàn)橛顽R的放大倍數(shù)較高，而透鏡很小，光線通過不同密度的介質(zhì)物體（玻片空氣透鏡）時(shí)，部分光線會(huì)發(fā)生折射而散失，進(jìn)入鏡筒的光線少，視野較暗，物體觀察不清。如在透鏡與玻片之間滴加和玻璃折射率（n=1.52）相仿的香柏油（n=1.515），則使進(jìn)入油鏡的光線增多，視野亮度增強(qiáng)，物象清晰。 一、微生物分類 微生物雖然個(gè)體微小，但具有一定的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能，所以按其結(jié)構(gòu)和組成的差異分為三大類 1、

2、非細(xì)胞型微生物：體積微小，能通過濾菌器，只能在活細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，如病毒、噬菌體； 2、原核細(xì)胞型微生物：僅有原始核，無核仁和核膜，缺乏完整的細(xì)胞器，如細(xì)菌、放線菌、支原體、衣原體； 3、真核細(xì)胞型微生物：細(xì)胞核的分化程度較高，有核膜、核仁和染色體，胞質(zhì)內(nèi)有完整的細(xì)胞器，如霉菌、酵母菌、藻類等。二、細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的條件 1、充足的營(yíng)養(yǎng)。水、碳源、氮源、無機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子。 2、合適的酸堿度。大多數(shù)為中性或弱堿性，即PH7.2-7.6。個(gè)別細(xì)菌在較堿性的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。 3、適宜的溫度。分為嗜冷菌、嗜熱菌、嗜溫菌。 4、必要的氣體環(huán)境。主要是氧與二氧化碳。三、細(xì)菌群體的生長(zhǎng)繁殖分期 1、遲緩期。此期

3、中細(xì)菌體積增大，代謝活躍但不分裂，菌數(shù)并不增多。此期長(zhǎng)短不一，從數(shù)小時(shí)到數(shù)天不等，視菌種、菌齡與接種菌量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同而異。 2、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)或指數(shù)期。此期中細(xì)菌生長(zhǎng)迅速，以恒定的速度進(jìn)行分裂繁殖，菌數(shù)以幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)，增長(zhǎng)極快。研究細(xì)菌的性狀最好選用此期的細(xì)菌。 3、穩(wěn)定期。對(duì)數(shù)期后，細(xì)菌繁殖速度逐漸下降，細(xì)菌繁殖數(shù)與死亡數(shù)幾近相等，活菌數(shù)保持穩(wěn)定。 4、衰亡期。活菌數(shù)急劇減少。四、細(xì)菌的染色 1、分為單染法、復(fù)染法、特殊染色法、負(fù)染色法、熒光染色體法等。 單染法：只用一種染液，可顯示細(xì)菌的形態(tài)與排列，不能顯示細(xì)菌的結(jié)構(gòu)與染色反應(yīng)的特性。 原理：由于細(xì)菌在中性環(huán)境中一般帶負(fù)電荷，所以通常采用堿性

4、染料如美藍(lán)、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫、孔雀綠、番紅等進(jìn)行染色。這類染料解離后，染料離子帶正電荷，使細(xì)菌著色。 復(fù)染法：用兩種以上不同顏色的染料進(jìn)行染色，除可觀察細(xì)菌的形態(tài)、排列、大小外，還能將細(xì)菌染成不同的顏色。 常用的革蘭氏染色法和抗酸染色法即為復(fù)染法。 2、革蘭氏染色法 2.1原理：依據(jù)的是細(xì)菌的細(xì)胞壁組成成分和結(jié)構(gòu)的不同，革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁肽聚糖層厚，交聯(lián)而成的肽聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)致密，經(jīng)乙醇處理發(fā)生脫水作用，使孔徑縮小，通透性降低，結(jié)晶紫與碘形成大分子復(fù)合物保留在細(xì)胞內(nèi)而不被脫色，結(jié)果使細(xì)胞呈現(xiàn)紫色。而革蘭氏陰性菌肽聚糖層薄，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)交聯(lián)少，而且類脂含量較高，經(jīng)乙醇處理后，類脂被溶解，細(xì)胞壁孔徑變

5、大，通透性增加，結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物被溶出細(xì)胞壁，因而細(xì)胞被染色，再經(jīng)番紅復(fù)染后細(xì)胞呈紅色。 2.2試劑： 2.2.1堿性染料 草酸銨結(jié)晶紫液； 2.2.2媒染劑 碘液，其作用是增強(qiáng)染料與菌體的親和力，加強(qiáng)染料與細(xì)胞的結(jié)合； 2.2.3脫色劑 乙醇，將染料溶解，使被染色的細(xì)胞脫色。利用不同細(xì)菌對(duì)染料脫色的難易程度不同，而加以區(qū)分； 2.2.4復(fù)染液 番紅溶液，目的是使經(jīng)脫色的細(xì)菌重新染上另一種顏色，以便與未脫色菌進(jìn)行比較。 2.3操作過程 標(biāo)本經(jīng)固定后，先用結(jié)晶紫染色、再加碘液媒染、然后用乙醇脫色，最后用沙黃或復(fù)紅復(fù)染。 2.4意義 依據(jù)革蘭氏染色可將細(xì)菌分為陽(yáng)性和陰性兩大類。由于陽(yáng)性、陰性細(xì)胞

6、壁等結(jié)構(gòu)上的差別可造成對(duì)抗生素的敏感性不同，臨床上依據(jù)此，可選擇性針對(duì)用藥。l1.涂片固定涂片固定w2.單單染染染色染色 1min 3.媒染媒染-溶溶液浸液浸濕濕30S4. 脫色脫色進(jìn)行進(jìn)行顏色洗脫顏色洗脫5.復(fù)復(fù)染染第第二次二次染色染色 2.5注意事項(xiàng) 2.5.1制片是染色的關(guān)鍵，載片要清潔，不得沾污油脂，菌株才能涂布均勻。注意初次涂片時(shí)，取菌量不應(yīng)過大，以免造成菌體重疊。 2.5.2注意水流不得直接沖在涂菌處，以免將菌體沖掉。 2.5.3脫色是革蘭氏染色的關(guān)鍵，必須掌握乙醇的脫色程度。若脫色過度則陽(yáng)性菌被誤染為陰性菌，而脫色不夠時(shí)陰性菌被誤染為陽(yáng)性菌。（拉絲試驗(yàn)未斷裂DNA螺旋）1884年

7、丹麥醫(yī)師年丹麥醫(yī)師Gram所發(fā)明所發(fā)明紫色者為紫色者為G菌，紅色者為菌，紅色者為G菌菌l呈現(xiàn)第二次染色的效果呈現(xiàn)第二次染色的效果；稱五、細(xì)菌的培養(yǎng)和分離 大多數(shù)細(xì)菌可以用人工方法培養(yǎng)，但必須根據(jù)不同細(xì)菌采取各自適宜的條件，如無菌技術(shù)、接種和分離方法、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等 1、樣品處理 標(biāo)本采集是否符合要求，直接影響細(xì)菌的檢測(cè)結(jié)果，因此要求除糞、痰、咽拭子等標(biāo)本，其他樣本均應(yīng)以無菌技術(shù)采集。 標(biāo)本盛于無菌容器內(nèi)，根據(jù)目的菌的種類采用不同的方法采集，標(biāo)本采集后及時(shí)冷藏送檢。 2、無菌技術(shù) 2.1細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)必須隨時(shí)防止污染和病原菌的擴(kuò)散，為達(dá)到此目的而采取的技術(shù)就是無菌技術(shù)或無菌操作，在進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)檢

8、查過程中，無論是標(biāo)本采集或培養(yǎng)操作，均需嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作技術(shù)。 2.2所用器具、培養(yǎng)基等必須嚴(yán)格滅菌，使用過程中不得與未經(jīng)消毒物品接觸，忌長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣手中，有蓋的應(yīng)迅速蓋上。 2.3滅菌的試管、玻璃等在打開蓋后及關(guān)閉前，口部應(yīng)在火焰上通過1-2次，以殺滅可能從空氣中落入的雜菌；接種環(huán)或接種針每次使用前后，均應(yīng)在火焰上燒灼滅菌，金屬棒或玻璃棒部分亦須轉(zhuǎn)動(dòng)通過火焰3次。 2.4進(jìn)行細(xì)菌檢驗(yàn)的全過程應(yīng)在無菌室、接種罩或生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。 2.5檢驗(yàn)時(shí)忌用手接觸標(biāo)本及已滅菌的器材內(nèi)部，也勿用口吹以防其他雜菌混入培養(yǎng)物中。 2.6打開瓶塞及試管塞時(shí)，應(yīng)將塞子上端夾持于手指間適當(dāng)位置，不得將棉塞任意放

9、置別處。 3、接種、分離及結(jié)果觀察 接種細(xì)菌應(yīng)用接種環(huán)（針）來蘸取細(xì)菌標(biāo)本，進(jìn)行接種，其程序可分為：滅菌接種環(huán) 冷卻 蘸取細(xì)菌標(biāo)本 進(jìn)行接種 接種環(huán)滅菌5個(gè)程序。細(xì)菌的接種與分離技術(shù)細(xì)菌的接種與分離技術(shù) 平板分區(qū)劃線法 每劃完一區(qū)，要將接種環(huán)滅菌 2 斜面接種法-常用于雙糖管接種 3 液體接種法-糖類微量生化管 4 穿刺法 -常用于半固體接種 5 傾注平板法-自來水細(xì)菌計(jì)數(shù) 6 涂布接種法-紙片法藥敏試驗(yàn)六、生化反應(yīng) 1、各種細(xì)菌具有各自獨(dú)特的酶系統(tǒng)，因而在代謝過程中所產(chǎn)生的分解和合成的代謝產(chǎn)物也不同，這些分解或合成代謝產(chǎn)物又各有不同的生化特點(diǎn)，利用此生化特點(diǎn)來檢查代謝產(chǎn)物以鑒別細(xì)菌的方法，稱

10、為生化反應(yīng)。 2、生化反應(yīng)主要分為糖類的代謝試驗(yàn)、蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)、有機(jī)酸鹽和銨鹽的利用試驗(yàn)、呼吸酶類試驗(yàn)及其他酶類試驗(yàn)。2.1碳水化合物的代謝試驗(yàn)碳水化合物的代謝試驗(yàn) 糖、醇、苷發(fā)酵試驗(yàn)糖、醇、苷發(fā)酵試驗(yàn) 糖細(xì)菌生長(zhǎng)分解糖產(chǎn)酸PHn不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗(yàn)。淀粉水解試驗(yàn)淀粉水解試驗(yàn) 某些細(xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。 O/F（葡萄糖）試驗(yàn)（葡萄糖）試驗(yàn) 細(xì)菌分解葡萄糖時(shí)利用分子氧細(xì)菌分解葡萄糖時(shí)利用分子氧氧化型氧化型(O)無氧降解無氧降解發(fā)酵型發(fā)酵型

11、(F)不分解葡萄糖不分解葡萄糖產(chǎn)堿型產(chǎn)堿型(-)一管加石臘油一管加石臘油 FO堿ONPG試驗(yàn) 鄰-硝基酚-半乳糖（黃色 ）-半乳糖苷酶 細(xì)菌鄰-硝基-半乳糖 陽(yáng)性-黃色陰性對(duì)照-無色本試驗(yàn)可同時(shí)觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。1.下黃上不黃下黃上不黃 為分為分解解葡萄糖，不分解乳糖葡萄糖，不分解乳糖2.上下均黃上下均黃 為分解為分解葡萄糖、乳糖葡萄糖、乳糖3.上下均不黃上下均

12、不黃 為非發(fā)為非發(fā)酵菌酵菌4.中間變?yōu)楹谏珵楫a(chǎn)中間變?yōu)楹谏珵楫a(chǎn)H2S沙門氏菌的沙門氏菌的TSI試驗(yàn)試驗(yàn)VP、MR試驗(yàn) 葡萄糖丙酮酸乙酰甲醇二乙酰胍基紅色 VP陽(yáng)性 肺炎克雷伯菌甲酸、乙酸PH甲基紅試劑紅色 MR陽(yáng)性 大腸埃希菌VPMR陽(yáng)陰陽(yáng)對(duì)對(duì)V-P試驗(yàn)試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱VP（+）反應(yīng)。甲基紅（甲基紅（Methyl Red）試驗(yàn)）試驗(yàn)?zāi)c桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，

13、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。2.2蛋白質(zhì)和氨基酸代謝試驗(yàn) 吲哚試驗(yàn) 細(xì)菌 （色氨酸酶）蛋白胨水吲哚柯氏試劑紅色靛基質(zhì)（靛基質(zhì)（Imdole）試驗(yàn)）試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對(duì)二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。 尿素試驗(yàn) 細(xì)菌NH3、PH紅色紅色 尿素陽(yáng)性尿素尿素酶（尿素酶（Urease）試驗(yàn)）試驗(yàn)有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個(gè)分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。n1、未接種n2、尿素酶陽(yáng)性n3、尿素酶陰性苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn) n苯丙氨酸細(xì)菌苯丙

14、酮酸FeCI3綠色 氨基酸脫羧酶試驗(yàn) 石蠟油葡萄糖溴甲酚紫精aa葡萄糖溴甲酚紫賴aa葡萄糖溴甲酚紫烏aa葡萄糖溴甲酚紫對(duì)照管2.3碳源和氮源利用試驗(yàn) 枸櫞酸鹽試驗(yàn) 細(xì)菌檸檬酸三鈉Na2CO3PH深藍(lán)色 枸椽酸鹽試驗(yàn)枸椽酸鹽試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌能利用枸椽酸鹽作為碳源，及磷酸銨作為氮源，將枸椽酸鹽分解為二氧化碳，培養(yǎng)基反應(yīng)后成堿性，由于指示劑的作用，培養(yǎng)基變?yōu)樘m色。硝酸鹽還原試驗(yàn) n細(xì)菌NO3- NO2 NO2對(duì)氨基苯磺酸（甲液）對(duì)重氮基苯磺酸 對(duì)重氮基苯磺酸-萘胺（乙液）紅色（） NO3細(xì)菌甲、乙液無色（-）鋅粉（還原劑）n紅色為陰性 n無色為陽(yáng)性 nNO3細(xì)菌NO2N2NH32.4酶類試驗(yàn)n細(xì)菌血漿

15、結(jié)合凝固酶 纖維蛋白肉眼可見凝集n細(xì)菌血漿 游離凝固酶纖維蛋白血漿凝固 CAMP試驗(yàn)試驗(yàn) B群鏈球菌產(chǎn)生群鏈球菌產(chǎn)生CAMP因子，促進(jìn)因子，促進(jìn)金葡溶血更好金葡溶血更好 凝固酶試驗(yàn)七、血清學(xué)試驗(yàn) 1、基本概念 1.1血清學(xué)試驗(yàn)是利用抗原抗體在適宜條件下的體外特異反應(yīng)，可作為抗原抗體的檢測(cè)。 1.2抗原：是一種刺激機(jī)體引起免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體和（或）致敏淋巴細(xì)胞，并能在體外與其相應(yīng)的抗體（或）致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)。具有免疫原性和反映原性。 1.3抗體：是機(jī)體在抗原物質(zhì)刺激下所形成的一類具有與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的有特定結(jié)構(gòu)的球蛋白。 2、基本特性 高度特異性:此類反應(yīng)是由于抗

16、原決定族與抗體結(jié)合部位之間的物理化學(xué)特性相對(duì)應(yīng)而相互結(jié)合的，故有特異性。 高度敏感性：檢測(cè)限可達(dá)到納克級(jí)甚至皮克級(jí)，其中以放免測(cè)定的敏感性最高，較差的是凝集反應(yīng)和各種沉淀反應(yīng)。 合適比例：當(dāng)抗原抗體的量比例合適時(shí)出現(xiàn)明顯的反應(yīng)，且反應(yīng)速度快，不合適的比例即不出現(xiàn)反應(yīng)，屬于抑制帶。 可逆性：抗原與抗體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合，是非共價(jià)鍵的結(jié)合，這樣結(jié)合雖相當(dāng)牢固，但在一定條件下兩者可以解離，如在復(fù)合物中加入酸、堿、過高的溫度等。 反應(yīng)過程的二階段性：第一階段為抗原抗體的特異性結(jié)合，需時(shí)很短，但無可見現(xiàn)象。第二階段形成可見反應(yīng)，需時(shí)較長(zhǎng)，從數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)不等。 3、影響因素 溫度：合適的溫度可加快反

17、應(yīng)，特別是第二階段受溫度影響較大，一般以15-40攝氏度為宜，37攝氏度最適宜。 電解質(zhì)：抗原抗體結(jié)合可不需要電解質(zhì)，但復(fù)合物的相互凝集出現(xiàn)可見反應(yīng)則需要電解質(zhì)的存在。 PH：可影響反應(yīng)的電離和點(diǎn)和性質(zhì)，血清反應(yīng)最適宜為6-8. 振搖和攪拌：可加速反應(yīng)物的相互碰撞和接觸，從而增快形成可見反應(yīng)的速度。 4、反應(yīng)基本類型 4.1凝結(jié)反應(yīng) 4.1.1細(xì)菌等顆粒性抗原加入相應(yīng)抗體在適量電解質(zhì)存在下，發(fā)生特異性反應(yīng)，形成肉眼可見的凝集小塊。可分為直接和間接兩大類。 4.1.2直接凝集反應(yīng)：指顆?？乖苯优c相應(yīng)抗體結(jié)合而出現(xiàn)肉眼可見的凝集小塊，具體有玻片法和試管法。 玻片凝集反應(yīng)為定性反應(yīng)，常用于細(xì)菌的鑒定與分型。 4.1.3間接凝集反應(yīng)：是將可溶性抗原或抗體吸附于一種與免疫無關(guān)的一定大小的微粒上，使成致敏微球，然后與相應(yīng)的抗體或抗原作用所發(fā)生的凝集。 微球應(yīng)用最多的是人O型紅細(xì)胞及羊紅細(xì)胞。 4.2沉淀反應(yīng) 可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有電解質(zhì)存在的條件下，形成可見的沉淀物。 其反應(yīng)機(jī)制與凝集反應(yīng)基本相同，不同點(diǎn)是凝集反應(yīng)的抗原是比較大的