西安地區(qū)漢族亞甲基四氫葉酸還原酶的兩種基因多態(tài)性

1、如文檔對您有幫助，歡迎下載支持，謝謝！西安地區(qū)漢族亞甲基四氫葉酸還原酶的兩種基因多態(tài)性【關鍵詞】 聚酶鏈反應【Abstract 】 AIM: To find out two genetic polymorphisms of MTHFR among the Han people in Xian area. METHODS: PCRRFLP technique was used to detect C677T and A1298C polymorphisms of MTHFR. RESULTS: The allele frequencies of 677T and 1298C were 45% a

2、nd 20%, respectively and the homozygote frequencies of 677TT and 1298CC were 18% and 3%, respectively. The frequence of combined heterozygosity for the C677T and A1298C mutations was 21%. CONCLUSIONT:he genetic polymorphism of MTHFRfrom our study is different from those previously reported by others

3、, which may due to differences between populations.【 Keywords】 RFLP; MTHFR; genes, polymorphism【摘要】目的：了解西安地區(qū)漢族人 MTHF匪因C677T和A1298c兩個位點的遺傳多態(tài)性.方法：應用聚合酶鏈反應限制性片 段長度多態(tài)性（PCRRFD查西安地區(qū)96個漢族人的基因型分布.結 果：677T等位基因的分布頻率為45% TT純合子占18% 1298c等位 基因的分布頻率為20%. CCa子占3%雙雜合子677CT, 1298AC占21%. 結論： 調查顯示這兩個位點的遺傳多態(tài)性與文獻報道不同， 可

4、能具有 群體差異性 .【關鍵詞】 限制性片段長度多態(tài)性； 亞甲基四氫葉酸還原酶；基因，聚酶鏈反應0 引言亞甲基四氫葉酸還原酶（ 5， 10methylenetetrahydrofolatereductase , MTHFR 是人體內同型半胱氨酸（homocysteine, Hcy ） 復甲基化的關鍵酶.由于MTHF塞因缺陷，造成該酶活性障礙，會影 響體內同型半胱氨酸的正常代謝， 使其血液濃度增高 1 . 而大量研 究表明，體內Hcy濃度每升高5 wmol・L-1 ,男、女患冠心病 的風險就會分別增加 1.6 和 1.8 倍 2 . 除此以外，高濃度的 Hcy 還是其他動靜

5、脈血栓形成及神經(jīng)管缺陷的致患因素 3 ， 4 . 經(jīng)過十 余年的研究，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人類 MTHFR勺15種點突變類型5.其中最 常見最重要的一個是第677位5T突變.此位點多態(tài)性不僅可以引起 酶活性下降，還與MTHFR勺熱敏感Ti有關6,是上述疾病的易感因 子.A1298c是該基因的另一個常見多態(tài)位點，此點突變也影響酶的活 性， 但與熱敏感性無關 4 . 不同國家和地區(qū)的多項研究表明， 人群中MTHFR!因C677T多態(tài)和A1298c多態(tài)的分布存在群體差異，這種差 異可能造成人群對疾病的易感性不同.本研究我們應用PCRRFL技術 檢測這兩處突變，了解西安地區(qū)漢族人MTHF塞因的分子遺傳學特征.1

6、對象和方法1.1 對象 200111/200206 間選取 96（ 男 58，女 38） 例，年齡3778（平土勻57.29）歲.互無血緣關系的漢族健康者，在西安地區(qū)長 期居住 （20 a 以上 ）.1.2 材料 DNAtt提試劑:STE液（10 mmol・L-1 Tris HCL,pH 8.0; 100 mmol・L-1 NaCl, 1 mmol・L-1 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA), 100 mL・L-1 Tween 20), TKM液(50mmol・L-1 Tris, pH 7.

7、5;0.15 mol・L-1 KCl; 5mmol・L-1 MgCl2) ， 100 g・ L-1 十二烷基磺酸鈉 (SDS)，4 mol・L-1 NaCl, 無水乙醇， 700 mL・L-1 乙醇，飽和酚氯仿， TE 緩沖液( 10 mmol・L-1 Tris HCL, pH 8.0; 1mmol・L-1 EDTA) . PCRRFLP 試齊ij C677T 引物 P1: 5 'TTTGAGGCTGACC TGAAGCACTTGAA

8、GGA，GP2 ：5GACTGGTAGCCCTGGATGGGAAAG，ATAC1C2C9G8P3 ：CTTTGGGGAGCTGAAGGAC TACTA C CACTTTGTGACCATTCCG GTTTG海生工合成）；4 xdNTPs, MgCl2, 10X Buffer, Taq酶（購自華美）； 限制性內切酶 Hinf I, Mbo H （日本 TaKaRa公司）；25g・L-1 瓊脂糖和 200 mL・L-1 聚丙烯酰胺、溴化乙錠.主要儀器：PCRT增儀（PE公司，480型）等.1.3 方法1.3.1 酚氯仿法提取DNA采檸檬酸鈉抗凝血 2 mL

9、,用STE細胞裂解液使紅細胞腫脹破裂，離心沉淀白細胞后，TKM重懸，依次加入SDS及NaCl破解白細胞，使蛋白析出，用飽和酚氯仿抽提12次，取上清加冰無水乙醇使 DNA析出，12 000 g離心30 s后以700 mL・L-1乙醇洗去鹽，晾干，最后用TE緩沖液（10 ： 1） 60止 L 溶解 DNA.1.3.2 PCRRFL砧檢測基因型 C677T PC皈應體系25 L, 含 5 nmol・L-1 的引物，200 區(qū) L・L-1 的 dNTP§ 25 mmol・L-1 MgCl2, 10X Bu

10、ffer , 2 U Taq 聚合酶及 100 ng 基 因組 DNA.反應條件：95 c 5 min7 （95 C 30 s, 65 c 30 s, 72 c 15 s） X35-72C 7 min.擴增產物長度為173 bp.限制性內切片段多 態(tài)性分析（RFLP）:總體積 10 wL,力口 4 U Hinf I 及 10X Buffer , 37 c 消化過夜，產物經(jīng) 25 g・L-1 瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察電泳條帶，分析其基因型.A1298C: PCR反應體系25 wL,含5 nmol・L-1 的引物，200L・L

11、-1 的 dNTPs, 25mmol・L-1 MgCl2, 10X Buffer , 2 U Taq 聚合酶及 100 ng 基 因組 DNA.反應條件：95 c 5min7 （95C 30s, 55 C 30 s, 72 C 15 s） X35-72C 7 min. 擴增產物長度為163 bp. RFLP總體積10"L,加4 U Mbo II及10 x Buffer , 37 c消化過夜，產物經(jīng) 200 g・L-1聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）電泳，澳化已錠染色后在紫 外燈下觀察結果，分析其基因型.2 結果2.1MTHFRC677TR!

12、MTHFRA1298寸增結果和基因型分析 MTHFRC677T增產物為 173 bp ,被 Hinfl 酶切成 128 bp 和 45 bp 2 條條帶，根據(jù)此判斷3種基因型，即純合未突變 CC雜合CT和純合 突變TT型；MTHFRA1298C增產物為163 bp,無突變發(fā)生時，可以被 Mbo II酶切成56, 28, 31, 30 和18 bp 5條條帶，突變后可產生 84, 31,30和18 bp 4條條帶，據(jù)此將其基因型分為 AA AQ CC.2.2MTHFRC677T口 MTHFRA1298C因型的分布及其相互關聯(lián)關系（Tab 1, 2）其中677T等位基因在人群中的分布頻率為 45%

13、 1298C等位基因在人群中的分布頻率為20%，女性略低于男性，但不具有顯著性差別 .表 1MTHFRC677T MTHFRA1298c因型的分布（略）Tab 1Distribution of MTHFRGenotype in Case and Controls（ 略）表2c677T和A1298c基因型之間關系的分布（略）Tab 2Relationship between MTHFR Genotype in C677T andA1298c （略）3 討論MTHFR8因在人群分布呈遺傳多態(tài)性，并按孟德爾常染色體隱性方式遺傳. 歐洲人 677T 等位基因頻率是24%-40%,日本人是26%-37%

14、非洲美洲人約11% TT純合子約占10%7; 1298c等位基因在人群中的發(fā)生率約 33%4,8 . 我們在對 96 例漢族人進行基因分型后發(fā)現(xiàn)，西安地區(qū)漢族人其 677T等位基因頻率為45%, TT純合子 占18%女性水平稍低于男性（P>0.05 ） . 1298C等位基因占20%, 純合子僅發(fā)現(xiàn)3例，均為男性，占總人數(shù)的3%. 677T等位基因及突變 純合子TT頻率高于日本人和非洲美洲人，但1298c等位基因頻率卻較 文獻報道低，提示這兩個位點存在基因多態(tài)性的群體變異，而且有可能和性別有一定的聯(lián)系 . Van der Put 和 Weisberg 4,6 等認為突變等位基因6

15、77T和1298c在染色體上呈反式排列，即這兩個突變等位基 因一般情況下不會同時存在于一條染色體上，并推測如果二者同時存在于一條染色體上，將對酶的活性產生較大影響. 所以 677 和 1298位點的突變具有明顯的連鎖不平衡性. 我們調查了 96 例僅發(fā)現(xiàn)有1例呈677TT/1298AC這種雙雜合子類型，占人群的1%與文獻報道相 近 6 ，也符合上述推測.本實驗建立了快速抽提 DNA勺方法，應用PCRRFL時MTHFR 的兩個SNP®行分析，可在兩天內完成.此項方法不用放射性物質， 只需凝膠染色即可直接觀察到基因型，避免了耗資、耗時的雜交及測序技術，已成為分析MTHFRI因多態(tài)性白常用

16、方法.利用這一技術可 對人群進行MTHFRI因分型，為研究MTHFRI因多態(tài)性對北方漢族人 的影響，建立數(shù)據(jù)庫. 同時為臨床指導使用何種形式的葉酸增補劑來治療高同型半胱氨酸血癥提供了依據(jù).【參考文獻】 1 Moyers S, Bailey LB. Fetal malformations and folate metabolism: Review of recent evidence Review J . Nutr Rev,2001;59 (7) :215-224. 2 Boushey CJ, Beresford SA, OmennGS, Motulsky AG.A quantitative a

17、ssessment of plasma homocysteine as a risk factor for vascular disease: Probale benefits of increasing folic acid intakes J . JAMA, 1995;274 ： 1049-1057. 3 DiazArrastia R. Homocysteine and neurologic disease J . Arch Neurol, 2000;57(10):1422-1429. 4 Van der Put NM, Gabreels F, Stevens EMB, SmeitinkJ

18、AM, Trijbels FJM, Eskes TKAB, van den Heuvel LP, Blom HJ. A second common mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase gene: An additional risk factor for NeuralTube defects J . Am J Hum Genet, 1998;62:1044-1051. 5 Goyette P, Pai A, Milos R, Frosst P, Tran P, Chen Z, Chan M, Rozen R. Gene structure of human and mouse methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) J . MammGenome, 1998;9:652-656. 6 Weisberg IS, Jacques PF, Selhub J, BostomAG, Chen Z, Curtis Ellison R, Eckfeldt JH, Rozen R. The 1298AC