體外診斷試劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則

1、附件 1：體外 診 斷試劑 生產(chǎn) 及 質(zhì)量控制技術(shù) 指 導(dǎo)原 則 酶聯(lián) 免疫診斷試 劑生產(chǎn)及質(zhì) 量控制 技 術(shù)指導(dǎo)原則酶聯(lián)免疫診斷試劑 是指在酶標(biāo)板上包被相關(guān)的抗原（或抗體）后，利用直接或間 接的方法與待測樣品中的相關(guān)抗體（或抗原）反應(yīng)，形成的抗原抗體復(fù)合物再與相應(yīng)的酶標(biāo)記的抗體和/或抗原進(jìn)一步反應(yīng)，經(jīng)過酶催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)，由形成的顏色的強弱來判斷樣本中相應(yīng)的 抗體或抗原的存在。為了規(guī)范酶聯(lián)免疫 診斷試劑的生產(chǎn)和質(zhì)量控制，制定本技術(shù)指導(dǎo)原則。本指導(dǎo)原則適用于 應(yīng)用酶聯(lián)免疫法的第三類診斷試劑（病原微生物）的生產(chǎn)和質(zhì)量控制，其他類酶聯(lián)免疫診斷試劑（如第二類等）參考本指導(dǎo)原則執(zhí)行。國家藥品監(jiān)督管

2、理部門將依據(jù)科學(xué)技術(shù)發(fā)展的需要，適時組織修訂。1、 基 本原則（一）酶聯(lián)免疫診斷試劑 生產(chǎn)用的各種原料、輔料等應(yīng)制定其相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)， 并應(yīng)符合有關(guān)法規(guī)的要求。（二）酶聯(lián)免疫診斷試劑 的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)具備相應(yīng)的專業(yè)技術(shù)人員、儀器設(shè)備以及適宜的生產(chǎn)環(huán)境，獲得醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證；同時，應(yīng)按照體外診斷試劑生產(chǎn)實施細(xì)則（試行）的 要求建立相應(yīng)的質(zhì)量管理體系 ，形成文件和記錄，加以實施并保持有效運行；還應(yīng)通過體外診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量管理體系考核評定標(biāo)準(zhǔn)（試行 ）的 考核。企業(yè)應(yīng) 對試劑的使用范圍作出明確規(guī)定，并經(jīng)國家藥品管理部門批準(zhǔn)。（三）酶聯(lián)免疫診斷試劑在研制時，應(yīng)當(dāng)遵循科學(xué)、規(guī)范的原則，各反應(yīng)條件的選擇

3、和確定應(yīng)符合基本的科學(xué)原理。（四）酶聯(lián)免疫診斷試劑 生產(chǎn)過程中所用的各種材料及工藝，應(yīng)充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。（五）生產(chǎn)和質(zhì)量控制的 總體目標(biāo)：保證試劑使用安全、質(zhì)量穩(wěn)定、工藝可控、 檢測有效。2、 原 材料質(zhì) 量控 制（一）主要生物原 料與診斷試劑的質(zhì)量 最密切相關(guān)的生物原料主要包括各種生物活性抗原、重組抗原 、單克隆杭體、多克隆抗體以及多肽類、激素類等生物原科。這類原料可用于包被酶標(biāo)反應(yīng)板、標(biāo)記相關(guān)酶（辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）、中和反應(yīng)用抗原或抗體、制備校準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品）等。 使用前應(yīng)按照工藝要求對這類生物原料進(jìn)行質(zhì)量檢驗，以保證其達(dá)到規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。主要生物原料若為企業(yè)自

4、己生產(chǎn)，其工藝必須相對穩(wěn)定；若購買，其供應(yīng)商要求相對固定，不能隨意變更供應(yīng)商 ，如果主要原料（包括工藝）或其供應(yīng)商有變更，應(yīng)依據(jù)國家相關(guān)法規(guī)的要求進(jìn)行變更申請。主要生物原料的常 規(guī)檢驗項目一般包括：1外觀分 生物原料為澄清透明的液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀或顆粒；或者為白色粉末，不含有其他顏色的雜質(zhì)；特殊生物原料應(yīng)具備相應(yīng)外觀標(biāo)準(zhǔn)。2純度和分子量主要經(jīng)SDS-PAGE電泳后，利用電泳掃描儀進(jìn)行分析，也可用其他適宜的方法，如 高效液相法等。根據(jù)所檢測生物原料的分子量選擇適宜丙烯酸胺凝膠濃度進(jìn)行電泳。一般情況下，每個電泳道加樣量為5g同時用已知分子量的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作參照，采用合適的電泳電流，電

5、壓和電泳 時間；電泳后的凝膠可用考馬斯亮藍(lán)染色或銀染法染色。染色后的 凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量，純度應(yīng)達(dá)到相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，分子量大小應(yīng)在正確的條帶位置。3蛋白濃度蛋白濃度可通過Lowry法、280nm光吸收法' 雙縮版方法等進(jìn) 行檢測。4效價效價的測定一般根 據(jù)蛋白含量測定結(jié)果，通過倍比稀釋法進(jìn)行。效價應(yīng)達(dá)到規(guī)定的 要求。5功能性實驗功能性實驗是指生 物原料用于試劑盒實際生產(chǎn)中的情況，一般考查使用該原料的 試劑的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性等，并比較其與上批次原料的相關(guān)性。（二）生物輔料生物輔料指的是 在生產(chǎn)過程中作為蛋白保護(hù)劑用途的一類生物 原料，主要包括 小牛血清、山羊血清

6、、牛血清白蛋白和酪蛋白等。這些生物原料均 應(yīng)按照中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn) （200弭版）所規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行檢驗，達(dá)到相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后方應(yīng)用于 生產(chǎn)。建議作以下檢驗：1 .牛血清或羊血清外觀：為淺黃色 澄清稍粘稠的液體，無溶血或異物無菌試驗：將血 清直接放37度培養(yǎng)7天，放在明亮處觀察，不得 出現(xiàn)混濁?？偟鞍缀浚河秒p縮月尿方法來測定，標(biāo)準(zhǔn)為不小于32mg/ml。球 蛋白含量：取 待測血清1ml,加入0.85%的NaCl溶液。 加入飽和硫酸鏤1ml,置4C, 2小時，8000rpm離心10分鐘，棄上清。 沉淀溶于0.85%NaCl溶液，至1ml,用Lowry方法測定蛋白含量，不 能

7、大于2mg/ml。2 .牛血清白蛋白：外觀：應(yīng)為淺黃 色凍干粉末無吸潮，無結(jié)塊，無肉眼可見的其 它雜質(zhì)顆粒。溶解性：將牛血 清白蛋白配成10%溶液，溶解時間在18-26度時應(yīng)不大于15分鐘。1%水溶液的p H值應(yīng)為6.5 74總蛋白含量：用 雙縮月尿方法來測定，其標(biāo)準(zhǔn)為大于等于 95%。 總蛋白中的BSA含量：采用硝酸 纖維素膜電泳法，其標(biāo)準(zhǔn)為95%。BSA的凈含量：總蛋白含量乘總蛋白中的BSA含量，其標(biāo)準(zhǔn)為>90%3 . 酪蛋白：酸度應(yīng)符合生產(chǎn)所 需的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。4標(biāo)記用酶應(yīng)在產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo) 準(zhǔn)中明示所使用的標(biāo)記用酶的名稱（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時應(yīng)根據(jù)不同生產(chǎn)廠家的檢驗方法

8、和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗，酶的純度RZ® （OD403n /O 280n ）應(yīng)大于 m Dm3.0。對于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應(yīng)進(jìn)行功能性實驗， 即以其為原料配制一定濃度的稀釋液作為樣品，進(jìn)行酶聯(lián)免疫測定 ，均不得出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。生物輔料的供應(yīng)商 同樣要求相對固定，不得隨意變更供應(yīng)商。（三）化學(xué)原材料參照中國生物制 品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（ 2000年 版 ）分析純級別進(jìn)行檢驗 。主要的檢測指標(biāo)包括：外觀、一般鹽類檢測、溶液pH值、溶解情況、干燥失重、熾灼殘渣等。主要化學(xué)原材料的 供應(yīng)商要求相對固定，不得隨意發(fā)生變更?；瘜W(xué)原材料在購入 時，原材料的生產(chǎn)商必須提供

9、該批次化學(xué)原材料的質(zhì)量保證材料和質(zhì)量檢驗報告，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)達(dá)到生產(chǎn)所需的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。（四）其他物料1酶標(biāo)板 外觀明亮處用肉眼觀察 板條的外觀質(zhì)量。如有欠注、飛邊、骯臟、表面光潔度差， 底部有波紋及劃傷等應(yīng)剔除。 吸附能力和精密性用一定濃度的正 常人IgG包被板條，再用一定濃度的抗人IgG酶 結(jié)合物吸附，通過顯色反應(yīng)，雙波長酶標(biāo)儀（主波長450nm ， 參考波長630nm）讀數(shù)。計算CV直，批內(nèi)CVC5%,批間CVC 1%。2液體試劑裝量瓶包括陰陽性對照 、 樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等液體組分，均應(yīng)有相應(yīng)的裝量瓶，并建立相應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)， 如不同的液體試劑所用的裝

10、量瓶規(guī)格、裝量瓶的顏色、瓶蓋的顏色等。3其他材料包括試劑瓶標(biāo)簽、 粘膠紙、鋁箔袋、襯墊、可密封塑料袋、說明書、干燥劑和包裝外盒等，應(yīng)參照國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則和醫(yī)療器械說明書、標(biāo)簽和包裝標(biāo)識管理規(guī)定建立相應(yīng)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。（五）企業(yè)質(zhì)控品企業(yè)質(zhì)控品一般包 括陰陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、橢性（均一性）、hook效應(yīng)等質(zhì)控樣品，對于定量檢測試劑，還包括線性質(zhì)控品樣品。如該產(chǎn)品具有國家標(biāo)準(zhǔn)品或參考品，應(yīng)使用國家標(biāo)準(zhǔn)品 （參考品）進(jìn)行標(biāo)化；若該診斷試劑沒有國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品 ），則 企業(yè)參考品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能低于國家藥品監(jiān)督管理部門已經(jīng)批準(zhǔn)的 同類試劑的

11、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。企業(yè)質(zhì)控品的基質(zhì) 應(yīng)與診斷試劑的待測樣品的基質(zhì)基本一致，如待測樣品為血清/血漿，質(zhì)控品基質(zhì)也應(yīng)為血清/血漿。三、 試 劑盒各組分 的 生產(chǎn)酶聯(lián)免疫診斷試劑 盒主要組分的生產(chǎn)包括酶標(biāo)記物的制備及滴配過程（酶工作液濃度確定 ）、各 種工作溶液的配制 、 包被酶標(biāo)反應(yīng)板、分裝及包裝等步驟；并通過產(chǎn)品的半成品檢驗和成品檢驗兩個質(zhì)控過程來保證其質(zhì)量符合規(guī)定。（一）各種工作液的配制酶聯(lián)免疫診斷試劑研制生產(chǎn)過程中所用的工作液一般包括：包被液、封閉液、陰 性陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液、終止液等，對定量檢測試劑，還包括標(biāo)準(zhǔn)品（或校準(zhǔn) 品）溶液。若陰性、陽性對照或

12、其他液體組分涉及生物安全性問題 ，制備時應(yīng)在相應(yīng)的生物安全實驗室完成。各種工作液在配制過程中應(yīng)嚴(yán)格按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的配方進(jìn)行配制，充分混勻確保液體 中的各種成分均勻，同時進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量檢驗并達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后 ， 方可使用或者分裝。對于定量檢測試劑，其標(biāo)準(zhǔn)品（或校準(zhǔn)品）溶液應(yīng)該在量值上具有溯源性。應(yīng)對配制過程及配 制的液體進(jìn)行的質(zhì)量控制，主要包括酶結(jié)合物的功能性實驗 及穩(wěn)定性；各種溶液的外觀、pH值等；酶作用的底物應(yīng)測定在無相 應(yīng)酶的情況下自身顯色的情況，并制定合理的限定 指標(biāo)；終止液應(yīng) 對其終止酶促反應(yīng)的能力進(jìn)行測定。（二）包被酶標(biāo)反應(yīng)板包被前應(yīng)對酶標(biāo)反應(yīng)板進(jìn)行質(zhì)量檢驗，如尺寸、外觀、包裝、 吸附性

13、能、精密性等，并記錄酶標(biāo)反應(yīng)板的批號、數(shù)量、標(biāo)識。酶 標(biāo)反應(yīng)板經(jīng)檢驗合格后方能用于包被。不同批號的板條不能混用。選擇經(jīng)檢驗合格的包被原料（如抗原、抗體等），定的方法 確定最佳包被濃 度和酶結(jié)合物工作濃度，按照診斷試劑的生產(chǎn)規(guī)程， 配制包被緩沖液、封閉液，經(jīng)檢驗合格后，包被酶標(biāo)反應(yīng)板，經(jīng)干燥后，已包被的酶標(biāo)反應(yīng)板用鋁箔紙封閉（內(nèi)置干燥劑），才慎空后, 保存于2 8C。應(yīng)對包被過程進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量控制，如包被用原料（抗原或者抗體等生物活性 原料）的質(zhì)量檢驗、包被液和封閉液的質(zhì)控（如配 方、外觀、pH值）、例過程的監(jiān)控（包括包被和封閉的體積、溫度、濕度、時間等）、例均一性檢驗、干燥過程的監(jiān)控等。（三）

14、分裝和包裝樣品稀釋液、洗 滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等溶液應(yīng)嚴(yán)格 按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的量進(jìn)行無菌處理后再分裝，分裝量的誤差應(yīng)小于5%。分裝及包裝均應(yīng) 按照相應(yīng)的SOP的要求進(jìn)行。包裝前，應(yīng)嚴(yán)格檢查試劑盒的品名、批號等，核對各試劑盒各組分的數(shù)量，并在關(guān)盒前進(jìn)行復(fù)核。四、質(zhì)量控制（一）半成品質(zhì)量控制1 .半成品抽樣檢驗人員按試劑 的批號，根據(jù)抽樣申請單抽取規(guī)定數(shù)量的半成 品各組分，作號標(biāo)記、待檢。2 .半成品檢驗利用上一批檢驗 合格的試劑盒的相應(yīng)組分，對本批生產(chǎn)出的各種試劑盒組分分 別進(jìn)行檢驗，檢驗結(jié)果達(dá)到產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。半成品檢驗，一般使用國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）或經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）

15、標(biāo)化 后的企業(yè)質(zhì)控品。若某類試劑沒有國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），貝使用企業(yè)參考品，但該企業(yè)參考品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能低于國 家藥品監(jiān)督管理 部門已經(jīng)批準(zhǔn)的同類試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。檢測所抽樣的半 成品的試劑盒性能，包括陰陽性參考品的符合率、靈敏度（最 低檢出量）、痛性等，均應(yīng)達(dá)到相 應(yīng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要 求，對精密性，一般情況下CV不得高于15% （采用競爭抑制法的 診斷試劑CV不得高于20%）。對t量檢測試劑，同時應(yīng)分析其線性 相關(guān)系數(shù)和校準(zhǔn)品檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。企業(yè)應(yīng)該對每一批試劑的半成品進(jìn)行穩(wěn)定性研究。試劑盒各組 分應(yīng)留樣，2 8c定期作穩(wěn)定性考核，同時作 37c熱穩(wěn)定性試驗， 試驗結(jié)果應(yīng)符合 產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。（二）成品質(zhì)量控制產(chǎn)品包裝完成后， 質(zhì)檢人員根據(jù)試劑的批號、實際包裝量、抽樣申請單的要求進(jìn)行抽樣，同時填