硒的檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

1、硒的檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展硒的檢測(cè)方法研究始于20世紀(jì)90年代，所研究和應(yīng)用的方法有比色法、熒光分光光度法、原子吸收光譜法、石墨爐原子吸收光譜法、氫化物一原子吸收光譜法、氫化物一原子熒光光譜法、催化動(dòng)力學(xué)法、高效液相一熒光法、氣相色譜法、電感耦合等離子體一質(zhì)譜法等，由于含硒樣品種類(lèi)繁多，且每種測(cè)定方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，所以根據(jù)不同的分析樣品，選擇合適的測(cè)定方法，有著非常重要的意義。硒在生物體中的存在形式分為有機(jī)態(tài)和無(wú)機(jī)態(tài)，其檢測(cè)方法的研究和發(fā)展也分為兩個(gè)方面：一類(lèi)總硒的檢測(cè)，另一類(lèi)是有機(jī)硒的形態(tài)分析檢測(cè)，現(xiàn)將各種方法分別簡(jiǎn)述如下：1總硒的測(cè)定1.1比色法3，3一二氨基聯(lián)苯胺（3，3 - Diaminob

2、enzidine）在酸性條件下與四價(jià)硒反應(yīng)生成黃色化合物，在pH7左右時(shí)能被甲苯萃取，進(jìn)行比色定量。水樣需要經(jīng)酸混合液消解后，將四價(jià)以下的無(wú)機(jī)和有機(jī)硒氧化成四價(jià)硒，再與鹽酸反應(yīng)將六價(jià)硒還原至四價(jià)硒，然后再測(cè)定總硒含量。該法樣品中若存在大量鐵、銅、鉬及釩等重金屬離子時(shí)，可用Na2 - EDTA消除干擾，強(qiáng)氧化劑能將3，3一二氨基聯(lián)苯胺試劑氧化產(chǎn)生棕紅色，因此水樣用混合酸消解時(shí)一定要加熱至大量酸被趕掉，少量的強(qiáng)氧化劑可用鹽酸羥胺消除。本法最低檢出限為2.5 g.L-1，測(cè)定上限為50 g.L-1，靈敏度較低。1.2熒光分光光度法2，3一二氨基萘（2，3 - diaminonaphthalene，縮

3、寫(xiě)為DAN）在pill.5 -2.0的酸性溶液中，選擇性地與四價(jià)硒離子反應(yīng)生成4，5一苯并苤硒腦(4，5一ben- zopiaselenol)綠色熒光物質(zhì)，被環(huán)已烷萃取后，以368 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，在520 nm處測(cè)定，所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與四價(jià)硒含量成正比。水樣經(jīng)硝酸一高氯酸混合酸液消解，將四價(jià)以下的無(wú)機(jī)和有機(jī)硒氧化為四價(jià)硒，再經(jīng)鹽酸消解將六價(jià)硒還原為四價(jià)硒，然后測(cè)定總硒含量，本法最低檢出量為0. 005 g，取20 mL水樣測(cè)定，硒的最低檢出濃度為0.25 g.L-1，現(xiàn)為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法第二法。1.3氫化物一原子熒光法樣品消解后，將溶液中的硒還原成四價(jià)硒，用硼氫化鉀( KBH4)作為還原劑，將四

4、價(jià)硒在鹽酸介質(zhì)中還原成硒化氫( Sell4)，由載氣（氬氣）帶入原子化器中進(jìn)行原子化，在硒空心陰極燈照射下，基態(tài)硒原子被激發(fā)至高能態(tài)，再去活化回到基態(tài)時(shí)，發(fā)射出特征波長(zhǎng)的熒光，其熒光強(qiáng)度與硒的含量成正比，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。該法在最佳條件下，方法檢出限為每毫升0. 22 ng，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%，樣品測(cè)定硒的加標(biāo)回收率為97.7%一100.9%。該方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，能滿(mǎn)足日常對(duì)硒樣品的檢驗(yàn)要求，現(xiàn)為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法第一法。1.4火焰原子吸收法消解樣品中的硒元素被載氣吸入火焰中，處于原子狀態(tài)，讓硒空心陰極燈發(fā)出的特定波長(zhǎng)的光從其中通過(guò)，因原子數(shù)目的多少可以影響光被吸收的程度，所以測(cè)定吸光度

5、可以度量出被分析元素的濃度。該法操作簡(jiǎn)單，但因硒空心陰極燈發(fā)射的特征譜線(xiàn)在196.0 nm處，接近真空范圍，因此信號(hào)不穩(wěn)定，易產(chǎn)生波動(dòng)，靈敏度不高，現(xiàn)已被氫化物一原子吸收法代替。1.5氫化物一原子吸收法樣品經(jīng)硝酸一高氯酸消化后，加入鹽酸將六價(jià)態(tài)硒還原為四價(jià)態(tài)硒，以稀鹽酸作載流液載帶試樣溶液，試樣溶液在反應(yīng)管中與硼氫化鉀溶液混合并發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，四價(jià)態(tài)硒被還原為硒化氫氣體，被載氣帶入電加熱石英管原子化器中，硒被原子化成基態(tài)原子蒸氣。當(dāng)硒空心陰極燈發(fā)射的特征譜線(xiàn)( 196.0 nm)通過(guò)石英管時(shí)，被基態(tài)原子所吸收。在一定實(shí)驗(yàn)條件下，其吸光度與試樣溶液中硒濃度呈正比，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。其分析線(xiàn)波長(zhǎng)1

6、96.0 nm，光譜通帶0.4 nm，燈電流5.0 mA，測(cè)量方式為峰高，硼氫化鉀濃度5g.L-1，鹽酸載液濃度0.5 mol. L-1，載氣流速200 ml/min，石英管加熱電壓120v。該法檢出限為每毫升0.19 ng，線(xiàn)性范圍為每毫升0.8 -28.0 ng，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0% -4.1%，樣品加標(biāo)回收率為89.9% - 99.3%。方法具有靈敏度高，選擇性好，簡(jiǎn)便快速，試劑和樣品用量少，精密度和準(zhǔn)確度均較高等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿(mǎn)足常規(guī)樣品的分析。1.6石墨爐一原子吸收法將試樣或消解處理過(guò)的試樣直接注入石墨爐，在石墨爐中形成的基態(tài)原子對(duì)特征電磁輻射產(chǎn)生吸收，將測(cè)定的試樣吸光度與標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸

7、光度進(jìn)行比較，確定試樣中被測(cè)元素的濃度。該方法檢測(cè)限為0. 003 mgL-1，測(cè)定范圍為0.015-0.2 mgL-1，但在金屬離子和非金屬離子達(dá)到一定濃度時(shí)均會(huì)對(duì)硒的測(cè)定產(chǎn)生干擾。1.7催化動(dòng)力學(xué)光度法在鹽酸介質(zhì)中痕量Se()能催化H202氧化甲基紅退色，由此建立了一種測(cè)定痕量硒的催化動(dòng)力學(xué)新方法。該方法的最大吸收波長(zhǎng)為520 nm，線(xiàn)性范圍為0 -52tg.L-1，檢出限為1.6 g.L-1。該法用于茶葉等樣品中硒的測(cè)定，結(jié)果滿(mǎn)意。1.8高效液相色譜法四價(jià)硒離子與2，3一二氨基萘反應(yīng)生成4，5一苯并苤硒腦綠色熒光物質(zhì)，被環(huán)已烷萃取后，在乙腈一水體系中的熒光強(qiáng)度比在甲醇一水體系中的熒光強(qiáng)度

8、強(qiáng)，在100%乙腈中熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，且峰分離最好，靈敏度最高，所以選用100%乙腈為流動(dòng)相，選用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)波長(zhǎng)，硒含量在0 -20 g范圍內(nèi)與峰高呈線(xiàn)性關(guān)系，加樣回收率為94. 3% - 103%。采用該法的優(yōu)勢(shì)在于：通過(guò)色譜柱能夠?qū)?，5一苯并苤硒腦與其它雜質(zhì)產(chǎn)生的熒光物質(zhì)分離，消除了雜質(zhì)與2，3一二氨基萘形成的熒光物質(zhì)的干擾，從而使檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。其次，有研究者采用微波消解法對(duì)試驗(yàn)樣品進(jìn)行消解，分別通過(guò)ICP - MS法、HPLC/熒光法和3，3一二氨基聯(lián)苯胺比色法三種方法測(cè)定了富硒蛹蟲(chóng)草菌絲體中硒的含量，對(duì)上述幾種硒含量測(cè)定方法的工作條件、檢出限和精確度進(jìn)行了對(duì)比研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：ICP

9、 - MS法、HPLC/熒光法和3，3一二氨基聯(lián)苯胺比色法的檢出限分別為0. 2607，0.1821和10.4859 g.L-1ICP - MS法的檢出限最低，3，3一二氨基聯(lián)苯胺比色法的檢出限最高。在精密度方面，對(duì)同一樣品以ICP - MS法測(cè)硒的標(biāo)準(zhǔn)差為最低，以3，3一二氨基聯(lián)苯胺比色法測(cè)硒為最高。建議當(dāng)分析樣品中硒含量很低時(shí)，可選用HPLC/熒光法和ICP - MS法，如分析樣品含硒量相對(duì)較大，可采用3，3一二氨基聯(lián)苯胺比色法。2有機(jī)硒的檢測(cè)方法硒在生物體內(nèi)主要以有機(jī)硒化合物的形態(tài)存在，主要包括硒氨基酸、硒蛋白、硒核酸和硒多糖等。硒代氨基酸最主要的是硒代胱氨酸( Se - Cys)和硒代

10、蛋氨酸( Se - Met)，其次是硒甲基半胱氨酸，其檢測(cè)方法發(fā)展很快，主要進(jìn)展如下：2.1高效液相色譜(HPLC)法硒代氨基酸也是氨基酸，能夠與6一氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基一氨基甲酸酯(AQC)、鄰苯二甲醛(OPA)、異硫氰酸苯酯(PICT)等多種衍生劑反應(yīng)生成具有紫外吸收和熒光的衍生物，通過(guò)高效液相色譜儀分離，利用紫外或熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。利用該方法我實(shí)驗(yàn)室也做了大量的研究工作，發(fā)現(xiàn)存在的主要問(wèn)題是樣品水解后會(huì)產(chǎn)生大量的非含硒氨基酸，不論是采用柱前衍生還是柱后衍生的方法，都無(wú)法消除其它氨基酸的干擾，其它氨基酸的大峰會(huì)使實(shí)際樣品中的含硒氨基酸無(wú)法檢測(cè)，盡管有研究者采用電磁消解的方法來(lái)增

11、強(qiáng)含硒氨基酸的檢測(cè)信號(hào)，因此，該法適合于硒代氨基酸原料藥的檢測(cè)，在農(nóng)副產(chǎn)品中應(yīng)用依然十分困難。2.2液質(zhì)聯(lián)用(LC - MS)法2.2.1高效液相色譜一電感耦合等離子體質(zhì)譜(RP- IPHPLC)法用反相離子對(duì)高效液相色譜( RP - IPHPLC)分離含硒化合物，用電感耦合等離子體質(zhì)譜( ICP - MS)在線(xiàn)分析硒含量，與標(biāo)準(zhǔn)化合物的色譜圖和工作曲線(xiàn)對(duì)照進(jìn)行定性和定量分析，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)硒酸鈉、亞硒酸鈉、硒代胱氨酸、硒代胱胺、硒代蛋氨酸、硒代尿素和三甲基硒離子等7種生物體常見(jiàn)的含硒小分子的分析，檢出限為0.11.5g.L-1；線(xiàn)性范圍為1-100g.L-1，應(yīng)用于人血清、尿、肝組織細(xì)胞質(zhì)溶膠等

12、樣品中含硒小分子的形態(tài)分析，所需進(jìn)樣量?jī)H50 L，各含硒化合物加標(biāo)回收率在93%-117%。本方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，適合于各種生物樣品中含硒小分子的形態(tài)分析。也有研究者采用反相離子對(duì)緩沖鹽3個(gè)色譜系統(tǒng)的高效液相色譜與電感耦合等離子質(zhì)譜聯(lián)用( RP - HPLC - ICP - MS)法，研究了海帶對(duì)硒的富集總量及硒化學(xué)形態(tài)轉(zhuǎn)變，測(cè)定了亞硒酸鈉、硒甲基半胱氨酸(MeSeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)三種硒形態(tài)。2.2.2液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法(LC - MS MS) 以反相C18色譜柱為分離柱，甲醇+0.1%七氟丁酸水溶液(35 +65)流動(dòng)相，流速為500L/min；以氮?dú)鉃榕鲎?/p>

13、氣，利用多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)方式測(cè)定SeMet (MRM m/z 198.1 181.0，198.1152.0)和SeCys (MRM m/z 337.0 248.0,337.088.2)信號(hào)。SeCys和SeMet檢出限分別為每毫升2.0 ng和0.5 ng，該方法能夠使2種含硒化合物在一次進(jìn)樣中實(shí)現(xiàn)完全分離和在線(xiàn)測(cè)定，能夠滿(mǎn)足快速準(zhǔn)確檢測(cè)SeCys和SeMet含量要求。2.3液相色譜一雙通道原子熒光聯(lián)用法以10 mmolL-1 NH4H2P04溶液（pH 5.6，添加2.5%的甲醇）為流動(dòng)相，以高效液相色譜對(duì)樣品中的硒代胱氨酸(SeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)和四價(jià)硒Se()分離后，用雙通

14、道原子熒光進(jìn)行檢測(cè)，檢出限分別為4、18和3g.L-1，可用于尿樣及藥品中硒形態(tài)的日常分析。2.4氣相色譜(GC)法將硒半胱氨酸(SeCysH)甲基化，硒胱氨酸(Se- Cys)還原后再甲基化。它們生成的甲基硒半胱氨酸( CH3 SeCysH)能與溴化氰(CNBr)發(fā)生專(zhuān)一性反應(yīng)，定量生成的硒氰酸甲酯( CH3 SeCN)可用氣相色譜法(GC)測(cè)定。此法簡(jiǎn)稱(chēng)CNBr - GC法，檢測(cè)限410-8g SeCys，準(zhǔn)確度89.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差2.1%，非含硒氨基酸不干擾。此法適于樣品中微量硒氨基酸（SeMet，SeCysH和seCys）的測(cè)定。2.5氣一質(zhì)聯(lián)用(GC - MS)法將提取的蛋白樣品在

15、6 molL-1HC1溶液中，超聲處理20 min，離心分離后，以丁醇及三氟乙酸酐為衍生化試劑對(duì)硒蛋氨酸進(jìn)行衍生化，采用選擇離子監(jiān)測(cè)模式對(duì)衍生物進(jìn)行GC - MS測(cè)定，硒蛋氨酸的回收率為97.6% - 105.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7% -3.6%，檢出限為0.3 mg- L-1，該法樣品前處理簡(jiǎn)單，測(cè)定快速，結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，可用于植物樣品中硒蛋氨酸含量的測(cè)定。另有研究者以氯甲酸乙酯作衍生化試劑，利用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在多離子監(jiān)測(cè)模式下對(duì)硒甲基硒半胱氨酸和硒蛋氨酸衍生物進(jìn)行GC - MS/MS測(cè)定，方法的線(xiàn)性范圍為0.01 -25 mgL-1，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)rO. 998 8；方法檢出限分別為硒

16、甲基硒半胱氨酸(Met-Se-cys)4g.L-1、硒蛋氨酸(Se-Met)2g.L-1; Met-Se- Cys的方法回收率為82% -97%，RSD小于6.3%，Se - met的方法回收率為100% - 109%，RSD小于7.5%。該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，并能有效排除基質(zhì)的干擾，適合于食品中硒甲基硒半胱氨酸和硒蛋氨酸的定性定量分析。3結(jié)語(yǔ)有機(jī)硒的分析近來(lái)得到了很大的發(fā)展，但均以總硒和硒代氨基酸的檢測(cè)方法為主，有機(jī)硒主要以硒蛋白、硒氨基酸的形式存在外，還以硒多糖、硒甲醚等其它形式存在，難以分離提取或完全提取，單獨(dú)檢測(cè)其中的某一種或幾種成分，不能代表有機(jī)硒的含量。因此，現(xiàn)仍以采用總硒減去無(wú)

17、機(jī)硒的方法得到有機(jī)硒的含量較為合理，但采用該法不能檢測(cè)有機(jī)硒的形態(tài)。各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自己研究和企業(yè)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的需要，選擇適合的檢測(cè)方法。氨基酸和生物資源2010.2食用茵病毒脫毒方法的比較張朝輝，劉映淼，戚元成，高玉千，申進(jìn)文，邱立友(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州450002)摘要：應(yīng)用dsRNA技術(shù)從平菇天達(dá)300（Pleurotus ostreatus TD300）菌絲中提取到4條dsRNA條帶，大小分別是8.2、2.5、2.1和1.lkb。采用菌絲尖端脫毒法、原生質(zhì)體再生法、冷凍真空干燥法和單孢雜交法進(jìn)行脫毒，各得到一株脫毒菌株，分別是HTC8、PR15、FL01和SSHll。脫毒菌株HT

18、C8僅殘留有低含量的8.2kb dsRNA，PR15和SSH11完全脫去dsRNA，而FL01仍殘留有低濃度的8.2kb和2.5 kb dsRNA。該4株脫毒菌株的菌絲生長(zhǎng)速度和漆酶活力均比出發(fā)菌種有不同程度的提高，尤其是HTC8和PR15，菌絲生長(zhǎng)速度比出發(fā)菌種分別提高22.73%和18.18%，漆酶活力比出發(fā)菌種分別提高145.83%和134.38%o。綜合比較此4種脫毒方法，菌絲尖端脫毒法和原生質(zhì)體再生脫毒法比冷凍真空干燥法和單孢雜交法脫毒效果好，制備脫毒菌株用時(shí)短、效率高。關(guān)鍵詞：平菇；脫毒；菌絲生長(zhǎng)速度；漆酶1948年，美國(guó)賓夕法尼亞州La Franch兄弟，在雙孢蘑菇（Agaric

19、us bisporus）菇床上發(fā)現(xiàn)了一種菌柄有黑色斑點(diǎn)和水漬狀的蘑菇病害，這就是著名的法蘭西蘑菇病。1960年Holling第一次從病蘑菇的子實(shí)體中分離出并在電鏡下發(fā)現(xiàn)了3種類(lèi)型的病毒顆粒。此后，在香菇（Lentinus edodes）、平菇（Pleurotus ostreatus）、金針菇（Flammulina velutipes）等多種食用菌中發(fā)現(xiàn)病毒。食用菌感染病毒嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和質(zhì)量。雙孢蘑菇罹患法蘭西病導(dǎo)致菌絲退化、生長(zhǎng)緩慢，菌絲體褐色，子實(shí)體畸形、質(zhì)地改變、腐爛，孢子變小、萌發(fā)快等。罹患蘑菇病毒X (MVX)病導(dǎo)致床層中出現(xiàn)一些區(qū)域沒(méi)有子實(shí)體形成，或子實(shí)體畸形、呈褐色等。平菇感染病

20、毒同樣導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)緩慢，出菇延遲，子實(shí)體畸形，嚴(yán)重減產(chǎn)。防治食用菌病毒病的最有效的方法是預(yù)防，在生產(chǎn)的全過(guò)程做好清潔衛(wèi)生工作，制備和應(yīng)用脫毒菌種也是防治食用菌病毒病的有效措施。制備脫毒菌種的方法已報(bào)道的有菌絲尖端脫毒法和原基組織脫毒法。菌絲尖端脫毒法是切取尖端菌絲進(jìn)行繼代培養(yǎng)，如此反復(fù)45次進(jìn)行脫毒，電鏡觀察沒(méi)有發(fā)現(xiàn)菌絲中含有病毒粒子。原基組織脫毒法是取原基組織進(jìn)行分離培養(yǎng)得到脫毒菌種，但脫毒效果沒(méi)有檢測(cè)。周素靜應(yīng)用該方法制備平菇新931和豫6脫毒菌種，用dsRNA技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)只能脫去部分dsRNA條帶。Mdrquez等采用冷凍真空干燥法可完全脫去植物共生菌管突彎孢（Curvulzzria p

21、rotuberate）所含的dsRNA，方法是將菌絲先經(jīng)-80冷凍30 min，然后真空干燥過(guò)夜，得到的菌絲片段液體培養(yǎng)后進(jìn)行平板分離，對(duì)單菌落進(jìn)行dsRNA檢測(cè)，從中選擇不含dsRNA的菌株。該方法是否適用于食用菌菌種的脫毒尚未見(jiàn)報(bào)道。van der Lende等報(bào)道在制備的平菇原生質(zhì)體再生菌株中有少數(shù)菌株不含有dsRNA，且生長(zhǎng)速度顯著高于出發(fā)菌種和含有dsRNA的菌株。因此，從原生質(zhì)體再生菌株中也可以得到脫毒菌株進(jìn)行菌種脫毒。一般認(rèn)為食用菌的孢子帶有病毒，是病毒的主要傳播者，但平菇Shin-Nong菌株的擔(dān)孢子萌發(fā)形成的單核菌絲經(jīng)檢測(cè)僅26%含有病毒。所以，利用不帶病毒的擔(dān)孢子形成的單核

22、菌絲經(jīng)單孢雜交亦可能制備脫毒菌種。本文分別應(yīng)用菌絲尖端脫毒法、原生質(zhì)體再生法、冷凍真空干燥法和單孢雜交法制備了平菇天達(dá)300的脫毒菌種，并對(duì)脫毒菌種的生物學(xué)特性進(jìn)行了比較。材料與方法1菌株平菇天達(dá)300（Pleurotus ostreatus TD300），河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存。2培養(yǎng)基PDA加富培養(yǎng)基：馬鈴薯2009（馬鈴薯加水煮沸0.5h，雙層紗布過(guò)濾，取汁），蛋白胨19，葡萄糖209，酵母膏19，硫酸鎂29，磷酸二氫鉀29，瓊脂209，補(bǔ)加蒸餾水至1 000ml。馬鈴薯液體培養(yǎng)基：馬鈴薯2009（馬鈴薯加水煮沸0.5h，雙層紗布過(guò)濾，取汁），葡萄糖209，補(bǔ)加蒸餾水至

23、1000ml。RCM再生培養(yǎng)基：蛋白胨29，酵母膏2.0g，硫酸鎂0. 5g，磷酸二氫鉀0.46g，磷酸氫二鉀19，葡萄糖209，瓊脂209，甘露醇109.3g，蒸餾水1 000ml。試管固體培養(yǎng)基：棉籽殼909，麩皮109，水110ml，pH6.5。3脫毒菌種的制備3.1菌絲尖端脫毒平菇天達(dá)300斜面菌種接種在PDA加富培養(yǎng)基平板中，25培養(yǎng)5d，切取菌落最邊緣的尖端2 mm幼嫩菌絲，接種在相同培養(yǎng)基的乎板中，25培養(yǎng)5d后再切取尖端菌絲進(jìn)行繼代培養(yǎng)，如此連續(xù)8次，移接PDA斜面培養(yǎng)、4保存，檢測(cè)是否含有病毒dsRNA。3.2原生質(zhì)體再生脫毒采用李成等的方法制備平菇天達(dá)300的原生質(zhì)體，將原

24、生質(zhì)體涂布在RCM再生培養(yǎng)基平板中，25培養(yǎng)7d，挑取再生菌落接種于PDA平板中，25培養(yǎng)5d，選擇生長(zhǎng)快、鏡檢菌絲具鎖狀聯(lián)合的菌落移接PDA斜面培養(yǎng)、保存，檢測(cè)是否含有病毒dsRNA。3.3單孢雜交法按趙柏葉等的方法采集平菇天達(dá)300擔(dān)孢子，用無(wú)菌水洗滌收集器，得到的孢子懸液進(jìn)行梯度稀釋后涂PDA平板，25培養(yǎng)7d，挑取單菌落移接至PDA試管，25培養(yǎng)，鏡檢無(wú)鎖狀聯(lián)合者即為單核菌株。將檢測(cè)不含病毒dsRNA的單核菌株兩兩對(duì)峙接種在PDA平板中，取交接的菌絲鏡檢，移接存在鎖狀聯(lián)合者至PDA斜面中培養(yǎng)、4保存，檢測(cè)是否含有病毒dsRNA。3.4冷凍真空干燥法參考Mdrquez等的方法。將平菇天達(dá)

25、300菌絲接種到馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，25靜置培養(yǎng)57d，用無(wú)菌鑷子取少量表層邊緣的菌絲，轉(zhuǎn)移到一只無(wú)菌的50ml三角瓶中，加入500ul10%脫脂牛奶，80冷凍30min，然后放人冷凍真空干燥器中干燥，至水分基本抽干，一般46h。將干燥的菌絲稍打碎，先接種馬鈴薯液體培基進(jìn)行培養(yǎng)，在觀察到菌絲開(kāi)始生長(zhǎng)時(shí)即轉(zhuǎn)移到PDA平板上，25培養(yǎng)35d，隨后轉(zhuǎn)移至PDA斜面試管上培養(yǎng)、4保存，并檢測(cè)所得的菌株是否含有病毒dsRNA。4dsRNA技術(shù)檢測(cè)菌絲體中的dsRNA按Morris和Dodds21和邱立友等方法。取3.0g平菇天達(dá)300菌絲，加入3ml提取緩沖液(0.2 mol/L甘氨酸，0.lmol/L

26、 Na2 P04，0.6mol/L NaC1，pH 9.5)，在研缽中充分研磨后，加入3ml飽和酚、1.5ml氯仿異五醇(25：1)、0.03rnl 10%的SDS和0.03ml B一巰基乙醇，研磨成勻漿，在冰上放30min，偶爾輕輕搖動(dòng)以形成乳濁液。研磨的混合物在8 000 g/min(4)，離心20min，保留淡黃色的上層水相，加入無(wú)水乙醇至終濃度為15%(v/v)。稱(chēng)取1.5gCF-11纖維素粉末(Sigma)，添加至上述混和物中，混勻后倒入10 ml注射器內(nèi)（注射器乳頭頂部墊有玻璃纖維）；用150ml含15%乙醇的1STE緩沖液(0.2 mol/LNaC1、0.1 mol/L Tris

27、、0.002 mol/L EDTA，pH 7.0)進(jìn)行洗脫（直到260 nm吸光值為零），棄去洗脫液，再用10ml 1STE緩沖液洗脫，收集洗脫液，加入2倍體積無(wú)水乙醇和1/10體積的2 mol/L乙酸鈉(pH6.0)溶液，20過(guò)夜析出dsRNA。12 000 r/min，4，離心20 min，收集核酸沉淀，室溫下干燥，然后重懸于100ul雙蒸水中。用1%瓊脂糖凝膠電泳(恒壓60V)，至溴酚藍(lán)前沿接近膠板下邊緣為止。然后用0.5g/ml溴化乙錠溶液染色1030min，觀察dsRNA帶型。DNA分子量標(biāo)記是 Hind III digest DNA Marker(TaKaRa).5菌絲生長(zhǎng)速度的測(cè)

28、定分別取源自不同脫毒菌株的直徑lcm的菌塊接入PDA加富平板中心，25培養(yǎng)，從第3d起通過(guò)每天劃線(xiàn)測(cè)定平板中菌絲生長(zhǎng)速度，設(shè)置未脫毒的出發(fā)菌種作為對(duì)照。各菌株重復(fù)3板。6脫毒菌株漆酶活力的比較分別取取源自不同脫毒菌株的直徑1 cm的菌塊接入含有100 ml馬鈴薯液體培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，25以200 r/min振蕩培養(yǎng)9d，取培養(yǎng)液上清，按胡平平等的方法測(cè)定漆酶活力。各菌株重復(fù)3瓶。7統(tǒng)計(jì)分析脫毒菌株及其出發(fā)菌株的菌絲生長(zhǎng)速度和漆酶活力值均為三次重復(fù)的平均值，差異顯著性分析采用t測(cè)驗(yàn)。結(jié)果1四種脫毒方法得到的脫毒菌種中dsRNA檢測(cè)結(jié)果食用菌和真菌病毒絕大多數(shù)屬于dsRNA病毒。正常真菌

29、細(xì)胞中并不含有大分子dsRNA，如檢測(cè)出含有dsRNA就表明受到了病毒感染。應(yīng)用dsRNA技術(shù)檢測(cè)，并經(jīng)DNase和RNase A酶切驗(yàn)證，平菇天達(dá)300出發(fā)菌種含有4個(gè)dsRNA條帶，根據(jù)BioCaptMW軟件計(jì)算，其大小分別是8.2kb、2.5kb、2，lkb和1.lkb。其中1.lkb條帶的量很少，是否出現(xiàn)有較大的偶然性。8.2kh條帶為雙線(xiàn)(doublet)，也就是有兩個(gè)大小非常相近的片段，在瓊脂糖凝膠電泳中不易分開(kāi)（圖1）。應(yīng)用菌絲尖端脫毒經(jīng)過(guò)58代，菌絲中dsR- NA的含量明顯減少，尤其是8.2kb條帶，但并不能完全脫去（圖2）。通過(guò)原生質(zhì)體再生法得到多個(gè)再生菌株，有的菌株完全脫

30、去8.2kb條帶（如PR09），有的菌株完全脫去8. 2kb條帶和2.lkb條帶(如PR22)，有的菌株則完全脫去8.2kb、2.5kb和2. lkb三條帶（如PR15）（圖3）。所以，該方法為我們進(jìn)一步研究不同dsRNA條帶對(duì)菌株的影響創(chuàng)造了條件，從中可能尋找出導(dǎo)致病毒病暴發(fā)的關(guān)鍵dsRNA條帶。用dsRNA技術(shù)檢測(cè)了平菇天達(dá)300的23株擔(dān)孢子萌發(fā)形成的單核菌絲，發(fā)現(xiàn)僅有2株帶有dsRNA條帶。將不含dsRNA的單核菌絲兩兩配對(duì)，得到2株雙核菌株SSH06和SSH11，經(jīng)檢測(cè)該2菌株不含任何dsRNA條帶（圖4），但這種方法制備的脫毒菌株要進(jìn)一步進(jìn)行出菇實(shí)驗(yàn)才能得到可以用于生產(chǎn)的菌株。采用

31、冷凍真空干燥法得到4株脫毒菌株，菌株FL04含有3條dsRNA條帶，F(xiàn)L01、2脫毒菌種菌絲生長(zhǎng)速度的比較在PDA加富平板中培養(yǎng)采用不同脫毒方法制備的脫毒菌種，其生長(zhǎng)速度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6。從圖6可以看出，菌絲尖端脫毒菌株HTC8、原生質(zhì)體再生脫毒菌株P(guān)R15和單孢雜交脫毒菌株SSH11生長(zhǎng)速度顯著高于出發(fā)菌種(P0.01)，分別比出發(fā)菌種提高22.73%、18.18%和17.27%，而冷凍真空干燥脫毒菌株FL01生長(zhǎng)速度與出發(fā)菌種沒(méi)有差異。另外，脫毒菌株HTC8生長(zhǎng)速度顯著高于PR15和SSHll(P0.01)，后二者之間則沒(méi)有差異。3脫毒菌種漆酶活力的比較漆酶是食用菌主要的胞外蛋白，與菌絲生物

32、量和子實(shí)體產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)。4株脫毒菌株的漆酶活力均顯著高于出發(fā)菌種(P0.01或P0.05)，比出發(fā)菌種分別提高145.83%、134.38%、32.64%和17.71%。4株脫毒菌株之間漆酶活力相比較，尖端脫毒菌株HTC8最高，顯著高于另3株脫毒菌株(P0.01)，其次是原生質(zhì)體再生脫毒菌株P(guān)R15，酶活力顯著高于單孢雜交脫毒菌株SSHI1和冷凍真空干燥脫毒菌株FL01 (P%0.01)（圖7）。討論平菇病毒病和平菇病毒主要存在于中國(guó)和韓國(guó)。周素靜在平菇豫6和新831中均發(fā)現(xiàn)含有8.2kb、2.5kb和1.lkb的3個(gè)dsRNA條帶，比我們從平菇天達(dá)300中提取的dsRNA條帶僅少l條。從

33、韓國(guó)平菇佛羅里達(dá)菌株(Postreatusvar. florida)中提取得到5個(gè)dsRNA條帶，大小分別是8 kb、2.4 kb、2.1 kb、1.9 kb和1.7kb。從另一來(lái)自韓國(guó)的平菇菌株ASI2596中分離得到2個(gè)dsRNA條帶，大小分別是2.3kb和2.2kb。另一韓國(guó)的平菇菌株ASI 2504中含有3個(gè)dsRNA條帶，大小分別是2.0 kb、1.84 kb和1.82 kb。對(duì)平菇天達(dá)300所含3個(gè)dsRNA條帶8.2kb、2.5kb和2.lkb的堿基序列分析表明，已測(cè)定的8.2kb條帶的部分序列與平菇球狀ssRNA病毒(OMSV)的核酸同源性最高，達(dá)95%;已測(cè)定的2.5kb和2.lkb條帶的部分序列分別與平菇dsR- NA病毒PoVI的RNA1和CP蛋白基因序列的核酸同源性最高，分別是83%和73%。由于真菌病毒主要是通