PCR檢測(cè)技術(shù)（二）

1、pcr檢測(cè)技術(shù)（二） (三)pcr反應(yīng)參數(shù) 在pcr反應(yīng)中每輪循環(huán)的各步反應(yīng)時(shí)光不應(yīng)過(guò)長(zhǎng)，以免降低tagdna聚合酶的活力。下面介紹pcr反應(yīng)中的一些詳細(xì)參數(shù)。 1.變性 在第一輪擴(kuò)增前使dna徹低變性非常重要，因此普通反應(yīng)中都先在94變性5 min，然后再加入tagdna聚合酶舉行擴(kuò)增。變性不徹低往往使pcr反應(yīng)失敗，由于未徹低變性的dna會(huì)很快復(fù)性，削減dna的產(chǎn)量。dna變性普通僅需要幾秒鐘即可完成，反應(yīng)中變性所需的時(shí)光主要是為使囫圇反應(yīng)體系達(dá)到合適的變性溫度。變性時(shí)溫度過(guò)高或時(shí)光過(guò)長(zhǎng)，都會(huì)導(dǎo)致酶活力的降低。tagdna聚合酶活力的半衰期為：92.5,130min; 95, 40min;

2、97，5min。典型的變性溫度和時(shí)光為94，1 min或97，15s。 2退火 引物退火溫度和所需時(shí)光長(zhǎng)短取決于引物的堿基組成、引物的長(zhǎng)度、引物與模板的匹配程度以及引物的濃度。實(shí)際用法的退火溫度比擴(kuò)增引物的tm值約低5。普通當(dāng)引物中g(shù)c含量較高，長(zhǎng)度較長(zhǎng)并且與模板徹低匹配，則應(yīng)提高退火溫度。退火溫度越高，所得產(chǎn)物的特異性也越高。有些反應(yīng)甚至將退火和延長(zhǎng)反應(yīng)合并，只用兩種溫度完成囫圇擴(kuò)增循環(huán)(例如用60和94)，這既節(jié)約了時(shí)光，又提高了特異性。 在典型的引物濃度(0.2mol/l)下，因?yàn)橐镞^(guò)量，退火僅需數(shù)秒鐘即可完成。反應(yīng)中所需的退火時(shí)光主要是為了使囫圇反應(yīng)體系達(dá)到合適的溫度。典型的退火溫度

3、和時(shí)光為50和2min。 3延長(zhǎng) 延長(zhǎng)反應(yīng)通常在72下舉行，臨近tagdna聚合酶的最適反應(yīng)溫度75，事實(shí)上引物延長(zhǎng)在退火時(shí)已經(jīng)開(kāi)頭，由于tagdna聚合酶的作用溫度范圍為2085，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)光的長(zhǎng)短取決于目的序列的濃度和長(zhǎng)度。在普通反應(yīng)體系中tagdna聚合酶每分鐘可合成1kb長(zhǎng)的dna。對(duì)于極長(zhǎng)的片段延長(zhǎng)時(shí)光可達(dá)15min，但用法更長(zhǎng)的時(shí)光則對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物已沒(méi)有影響。在能完成dna合成的前提下應(yīng)盡量縮短延長(zhǎng)反應(yīng)的時(shí)光以削減tagdna聚合酶活力的降低。典型延長(zhǎng)反應(yīng)的溫度和時(shí)光為72和13 min。普通在擴(kuò)增反應(yīng)完成后都需要有一步長(zhǎng)時(shí)光(通常為1030min)的延長(zhǎng)反應(yīng)，以獲得盡可能完整的擴(kuò)增產(chǎn)

4、物，這對(duì)以后舉行克隆和擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序極為重要。 4循環(huán)次數(shù) 當(dāng)其他參數(shù)確定之后循環(huán)次數(shù)主要取決于模板dna的濃度，普通而言2530輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過(guò)多，會(huì)使pcr產(chǎn)物嚴(yán)峻出錯(cuò)，非特異性產(chǎn)物大量增強(qiáng)。普通經(jīng)2530輪循環(huán)后，dna聚合酶已經(jīng)嚴(yán)峻不足，不能舉行擴(kuò)增，假如此時(shí)產(chǎn)物產(chǎn)量還不夠，需要進(jìn)一步擴(kuò)增，則可將擴(kuò)增的dna樣品稀釋103105，倍作為模板，重新加人各種反應(yīng)底物舉行擴(kuò)增反應(yīng)。這樣經(jīng)60輪循環(huán)，擴(kuò)增水平可達(dá)1091010，但要注重此時(shí)非特異性產(chǎn)物的量也會(huì)大量增強(qiáng)。不同起始目的dna分子數(shù)與所用的pcr循環(huán)次數(shù)的關(guān)系如表5-7所示。 表5-7 起始目的dna分子數(shù)與所用的pcr循環(huán)

5、次數(shù)的關(guān)系 在擴(kuò)增反應(yīng)后期合成產(chǎn)物的量達(dá)0.31 pmol時(shí)，因?yàn)楫a(chǎn)物堆積使本來(lái)以指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線，產(chǎn)物不再隨循環(huán)次數(shù)而顯然升高，這稱(chēng)為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)效應(yīng)取決于下列因素：尚可利用的底物濃度(dntp或引物濃度)；反應(yīng)中存在的酶活力；終于產(chǎn)物的反饋抑制(焦磷酸或雙鏈dna) ;非特異性產(chǎn)物或引物二聚體與反應(yīng)模板的競(jìng)爭(zhēng)；在高濃度產(chǎn)物下產(chǎn)物的變性和鏈分別不能徹低，或者大量特異性產(chǎn)物重新退火(從而降低有效的模板數(shù)或者使延長(zhǎng)反應(yīng)出錯(cuò))；另外平臺(tái)期會(huì)浮現(xiàn)原先因?yàn)殄e(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增達(dá)到較高水平。因此適當(dāng)調(diào)整循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)，削減非特異性產(chǎn)物浮現(xiàn)。現(xiàn)在有一種pc

6、r只需10多分鐘即可完成20輪循環(huán)，它利用熱傳遞很快的毛細(xì)管，削減了反應(yīng)中為使囫圇反應(yīng)體系達(dá)到合適溫度所需要的時(shí)光，從而提高反應(yīng)效率。 (四)常見(jiàn)pcr種類(lèi) 1熱啟動(dòng)pcr 原理和特點(diǎn)：在傳統(tǒng)pcr反應(yīng)中除一種主要反應(yīng)試劑(dntp或tagdna聚合酶或引物外)，其他反應(yīng)成分一次性加入，當(dāng)程序性升溫達(dá)到70以上時(shí)再將反應(yīng)管放在pcr擴(kuò)增儀上舉行擴(kuò)增，這樣既可以削減非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的浮現(xiàn)，又可以削減引物二聚體的形成。 2一步單管pcr 該辦法主要用于rna病毒等的檢測(cè)，一種辦法是首先用化學(xué)辦法提取核酸，接下來(lái)將cdna及pcr反應(yīng)放在一個(gè)反應(yīng)管中，在pcr擴(kuò)增儀上一步舉行。近年來(lái)又有入將熱裂說(shuō)明

7、放核酸辦法用于提取病毒rna提取，使rna的提取、反轉(zhuǎn)錄和pcr在一個(gè)反應(yīng)管中一步舉行，這樣既削減了操作步驟，又最大限度地削減了環(huán)境核酸和核酸酶造成的污染，使特異性及敏感性都有所增強(qiáng)。 3多重pcr 多重pcr原理與常規(guī)pcr相同，只是在反應(yīng)體系中加入一對(duì)以上的特異性引物，假如存在與特異性引物對(duì)互補(bǔ)的模板，則可同時(shí)在同一個(gè)反應(yīng)管中擴(kuò)增出一條以上的dna片段，這種辦法既保留了常規(guī)pcr的特異性、敏感性，又削減了操作步驟及試劑，實(shí)現(xiàn)了一次擴(kuò)增就能同時(shí)檢測(cè)多種微生物的目的。 4依靠pcr的dna指紋圖譜技術(shù) 通過(guò)各種改進(jìn)的pcr技術(shù)使目標(biāo)微生物的核酸經(jīng)擴(kuò)增后產(chǎn)生多條dna擴(kuò)增片段(包括特異性的和非特

8、異性的)，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析找出某種微生物的特有條帶舉行區(qū)分鑒定。其特點(diǎn)是即使在事先不知道目的微生物核酸序列的前提下，也可以對(duì)其舉行檢測(cè)和鑒定。 5.pcr-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析 1989年才真正建立起pcr-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析技術(shù)，普通用于基因突變的檢測(cè)，主要用于癌基因或抗癌基因的檢測(cè)分析。在微生物檢測(cè)方面惟獨(dú)wdjoioatmodj。等1994年將其用于細(xì)菌的迅速鑒定，他們采納兩對(duì)保守引物分離用于16srrna基因兩側(cè)，產(chǎn)物為216bp和255bp的基因片段，擴(kuò)增檢測(cè)了15個(gè)屬40個(gè)種的100多個(gè)代表菌株，能較好地將這些菌分別開(kāi)來(lái)，產(chǎn)物檢測(cè)時(shí)需要注重電泳溫度和電泳緩沖液離子強(qiáng)度的變幻：該辦法敏捷度

9、更高，可檢測(cè)到惟獨(dú)一個(gè)堿基的突變和差異；不需要酶切，挺直對(duì)產(chǎn)物舉行隨機(jī)多態(tài)性分析，操作簡(jiǎn)便，無(wú)需特地儀器。 6.mrna差異顯示技術(shù) mrna差異顯示技術(shù)主要用于真核細(xì)胞mrna差異的表達(dá)，為尋覓未知基因提供了新途徑，但將其應(yīng)用于未知微生物的檢測(cè)和鑒定目前尚未報(bào)道。 7隨機(jī)引物擴(kuò)增dna多態(tài)性(rapd) 這種技術(shù)主要用于在不考慮微生物核酸精確序列的前提下比較微生物間的dna指紋圖譜差異，具有種特異性和同種不同株間的特異性，且重復(fù)性較好。rapd技術(shù)近年來(lái)已被廣泛用于細(xì)菌種間的鑒定；此外該技術(shù)也被用于真菌和酵母等的檢測(cè)與鑒定，rapd技術(shù)的關(guān)鍵是引物的篩選和試驗(yàn)條件的優(yōu)化。 8.以微衛(wèi)星dna

10、介導(dǎo)的pcr技術(shù) 微衛(wèi)星dna又稱(chēng)容易重復(fù)序列，它廣泛存在于原核和真核生物基因組中，其中最頻繁的是雙核苷酸重復(fù)，即(ac)n和(tg)n，該技術(shù)可作為rapd技術(shù)的一個(gè)特例，區(qū)分在于其引物不是徹低隨機(jī)的，因此擴(kuò)增引物的條帶組成比rapd的要穩(wěn)定。目前這一技術(shù)已被用于真菌等的檢測(cè)，但用于其他微生物的分型和檢測(cè)尚未見(jiàn)報(bào)道。 9基因間重復(fù)性回文片段(rep)和基因內(nèi)重復(fù)性全都序列(eric)的擴(kuò)增 versalovic以與rep和eric重復(fù)序列配對(duì)互補(bǔ)的寡核苷酸片段作為pcr擴(kuò)增的引物及斑點(diǎn)雜交的探針來(lái)檢測(cè)真細(xì)菌屬中的不同菌，包括大腸桿菌、布魯桿菌和假單孢菌等，擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上形成清楚的dn

11、a條帶，而且在不同的真細(xì)菌屬、種之間都存在特異的dna指紋圖譜。除引物序列固定外，其他與rapd全都，且結(jié)果的重復(fù)性更好。 10擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(aflp) 1995年vos等建立了這一技術(shù)并將其用于dna、植物病毒dna、細(xì)菌dna及植物dna等的檢測(cè)，結(jié)果較好。要想得到有價(jià)值的圖譜，挑選合適的核酸內(nèi)切酶是關(guān)鍵。該法與rapd等技術(shù)相比，具有穩(wěn)定性高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。目前尚未見(jiàn)進(jìn)一步報(bào)道。 11限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析(rflp) 此辦法基于在pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的片段內(nèi)含有限制性酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后在電泳凝膠上可分出特定的條帶。若酶切位點(diǎn)發(fā)生變異，則不能被酶切，電泳圖譜將發(fā)生轉(zhuǎn)變，以此可對(duì)微生物舉行檢測(cè)和分型。只要待擴(kuò)增片段挑選得當(dāng)，則擴(kuò)增產(chǎn)物圖譜重復(fù)性較好，否則若變異點(diǎn)不在酶切位點(diǎn)，其區(qū)別能力就受到限制或徹低喪失。selenska-pobell等對(duì)relp技術(shù)、rapd技術(shù)及腸道細(xì)菌重復(fù)性回文片段擴(kuò)增技術(shù)舉行了比較。在檢測(cè)根瘤菌方面，后兩種技術(shù)具有較顯然的優(yōu)勢(shì)：容易、迅速且辨別率較高。 12用于rna病毒檢測(cè)的核酸擴(kuò)增技術(shù) tthdna聚合酶介導(dǎo)的核酸擴(kuò)增技術(shù)：tthdna聚合酶來(lái)源于嗜熱真菌，為一耐熱的dna聚合酶，此酶為一高度加工的5'3'聚合酶，不僅有