葉綠體DNA的提取

1、葉 綠 體 DNA 的 提 取 -微藻精品文檔葉綠體DNA勺提?。▍⒖级攀消}藻）1、材料：扁藻2、培養(yǎng)基配方：3、儀器：超速離心機(jī) 細(xì)胞破碎儀4、用于細(xì)胞破碎和葉綠體分離的緩沖液：溶液 1: 0.33 mol/L 山梨糖醇 Sorbitol ，50m mol/L Hepes, 2m mol/LEDTA, 1m mol/L MnCI 2, 2m mol/L DTT,體積分?jǐn)?shù) 0.5%BSA Leupeptin 1mg/L溶液 2（ 45%糖加離心緩沖液）：45g/L 蔗糖，0.33mol/L Sorbitol ，50m mol/L Hepes溶液 3（ 60%糖加離心緩沖液）：60g/L 蔗糖，

2、0.33mol/L Sorbitol ，50m mol/L Hepes溶液 4 （葉綠體洗滌緩沖液）：0.33mol/L Sorbitol ，25m mol/L Hepes以上緩沖液均用KOH調(diào)pH至7.5溶液5：50m mol/L Tris-HCl ，100 m mol/L EDTA，pH8.05、完整葉綠體的分離（所有操作均在 4 °C進(jìn)行）1）將培養(yǎng)10d左右達(dá)對(duì)數(shù)生長后期的250ml藻液，離心收集藻體，液氮充分研 磨后，將上述藻體細(xì)胞用20ml冰預(yù)冷的溶液1充分緩慢的懸浮于50ml離心 管，制成（粗體液）。3）將粗體液于1000g離心30s，棄上清。4）再次用10ml冰預(yù)冷的

3、溶液1充分緩慢懸浮，懸浮液平均鋪滿于 6個(gè)10 mLHITACHI CPIO0專用離心管上層，每個(gè)離心管最下層鋪有冰預(yù)冷的3 mL溶液3,其上鋪有冰預(yù)冷的3 mL溶液2形成梯度。5） 4C,40 000 g離心3h,完整的葉綠體集中在梯度之間，將此層小心吸至10mL離心管（約2 mL）6）加入4倍體積的冰預(yù)冷的溶液4, 3 000 g離心5min以除去多余的蔗糖，重 復(fù)此步驟1次。7）將沉淀懸浮于3 mL溶液4作為完整葉綠體制品，置于4 C備用。& cpDNA勺提取及鑒定l ）在得到的新鮮完整葉綠體制品中，加入終濃度分別為150卩g/l和13mmol/l的DNase I和MgCI2,并

4、于冰上靜置2h以去除來自核DNA勺潛在污染2）4C,1 000 g離心1 min，收集葉綠體沉淀3） 將葉綠體沉淀懸浮于500卩l(xiāng)溶液5,加入終濃度為2%勺SDS （初始濃度為20%勺SDS加55卩1）和終濃度為100卩g/ml的蛋白酶K （初始濃度為20mg/ml，加 2.7 卩1），55C水浴 3h;4）、加入等體積的飽和酚（pH8.0），輕輕混合均勻，于4C, 12000rpm離心10-15mi n5）小心移取上清于新的滅菌 EP管，后加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25:24: 1）,混勻，于 4C, 12000rpm 離心 10-15min ;6） 小心移取上清于另一離心管，加入等體積氯仿：異戊醇（24: 1）,上下顛 倒混合均勻，于4C, 12000rpm離心10-15min ;7）移取上清，加1/10體積的3M NaACffi二倍體積預(yù)冷的無水乙醇（-20 C）, 于-20 C冰箱中沉淀過夜或-80 C沉淀1h;8）4C, 10000rpm離心 15min,棄上清；9）加入70%酉精，10000rpm離心10分鐘，洗滌沉淀