第十章甾體激素類藥物分析

1、第十章 甾體激素類藥物分析藥物分析多媒體第一節(jié)第一節(jié) 基本結(jié)構(gòu)與分類基本結(jié)構(gòu)與分類甾體激素?zé)o論是天然產(chǎn)物還是人工合成品它們在結(jié)構(gòu)上均具有一個共同的基本母核環(huán)戊烷駢多氫菲。 結(jié)構(gòu)特點結(jié)構(gòu)特點 取代基取代基: : 對于大多數(shù)的甾體激素在10、13和17位上出現(xiàn)取代基。具有如下的碳骨架： 結(jié)構(gòu)特點(續(xù)) 注意：注意：大多數(shù)的甾體激素并不是均在10，13和17位上出現(xiàn)取代基，對于不同類型的激素，有些出現(xiàn)一個、兩個或三個取代基。 分分 類類 孕激素雌激素素雄性激素及蛋白同化激性激素皮質(zhì)激素腎上腺皮質(zhì)激素甾體激素)(在結(jié)構(gòu)上，各種腎上腺皮質(zhì)激素均可以認為是皮質(zhì)酮的衍生物。 一、腎上腺皮質(zhì)激素一、腎上腺皮質(zhì)

2、激素 例如，醋酸可的松、地塞米松、潑尼松（強的松）、醋酸去氧皮質(zhì)酮等等。腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)）腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)） 皮質(zhì)酮 醋酸可的松（Cortisone Acetate）腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)）腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)） 皮質(zhì)酮 地塞米松（Dexamethasone） 腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)）腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)） 皮質(zhì)酮 潑尼松（強的松）（Prednisone） 腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)）腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)） 皮質(zhì)酮 醋酸去氧皮質(zhì)酮 腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)）腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)） v 本類藥物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)特點可表現(xiàn)為： 1.基本母核的碳骨架具有21個碳原子。 2.A環(huán)有，不飽和酮，即4-3-酮基。 3.C17位具有醇酮

3、基，通常將其酯化以延長肌注作用時間。 4.為了增加藥物的水溶性，通常將其制成鈉鹽。 5.分析檢測主要基于4-3-酮基和C17位的-醇酮基，而C11位的羥基或被氧化后的酮基，由于空間位阻較大，通常難以發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)）腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)） 醋酸可的松 強的松甾體激素腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)）腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)） 氫化可的松磷酸鈉 倍他米松磷酸鈉 腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)）腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)） 在臨床上常用的雄性激素為睪丸素（或稱為睪酮、睪丸酮）的衍生物。例如，甲睪酮（甲基睪丸素）、氟羥甲睪酮等。 二、雄性激素及蛋白同化激素二、雄性激素及蛋白同化激素 睪丸素甲睪酮 丙酸睪酮將睪丸素進行結(jié)構(gòu)改

4、造，使其雄性激素活性大大減弱而蛋白質(zhì)同化作用保留或增強，這類甾體激素藥物即為同化激素。因此，同化激素也具有雄性激素的功能，在結(jié)構(gòu)上具有相似性，往往歸于同一類。 雄性激素及蛋白同化激素(續(xù)) 睪丸素苯丙酸諾龍 q本類藥物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)特點 雄性激素及蛋白同化激素(續(xù)) 1.基本母核碳骨架：雄性激素19個碳，蛋白同化激素18個碳。 2.多數(shù)A環(huán)有4-3-酮基，C17位無側(cè)鏈，多數(shù)是一個羥基。3.大多數(shù)易溶于油而不溶于水。一般將C17位上的羥基酯化，可延長藥物作用時間。 4.對于該類藥物分析最有意義的基團為A環(huán)上的4-3-酮基、C17-羥基及其酯基。 雄性激素及蛋白同化激素(續(xù))環(huán)戊丙酸睪丸素 癸酸諾

5、龍 孕激素也稱為黃體激素或孕酮，其典型藥物為黃體酮。臨床上重要的藥物有黃體酮、醋酸甲羥孕酮（安宮黃體酮）、已酸羥孕酮（已酸孕酮）、醋酸甲地孕酮等。三、孕激素三、孕激素 p本類藥物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)本類藥物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)特點特點： 1、基本母核結(jié)構(gòu):黃體酮21個碳原子的碳骨架。 2、大多數(shù)A環(huán)具有4-3-酮基，C17位具有甲酮基，且有些具有-羥基及其酯。 3、該類藥物分析主要依賴的活性基因為4-3-酮基和C17位的甲酮基。 孕激素孕激素( (續(xù)續(xù)) ) 黃體酮 安宮黃體酮 已酸孕酮 醋酸甲地孕酮 雌激素又稱為卵泡激素。臨床上廣泛應(yīng)用的是雌二醇及其各種酯和炔雌醇及其衍生物。 四、雌激素四、雌激素 p本類藥

6、物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)本類藥物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)特點特點： 1、基本母核的碳骨架具有18個碳原子 。 2、A環(huán)為芳香苯環(huán)，C3位上有酚羥基，具有酸性，而有些藥物在此鍵形成酯或醚。 C10位上無角甲基，C17有羥基或酮基， 有些還有乙炔基。 3、本類藥物分析的主要活性部位為酚羥基和C17位的羥基和它們的酯鍵、或酮基。 雌激素雌激素(續(xù)) 雌二醇 炔雌醇 基本母核雌激素雌激素(續(xù))苯甲酸雌二醇 炔雌醚 雌激素雌激素(續(xù))雌酮 馬烯雌酮 v甾體激素可供分析鑒定使用的主要基團可歸納為四類： 1、在A環(huán)上的4-3-酮基。 2、C17位上的-醇酮基、羥基、乙炔基、甲酮基以及17、21二羥20酮基。 3、A環(huán)上的酚羥基。

7、 4、酯基及鹵素。 v甾體激素鑒別的甾體激素鑒別的常用方法常用方法可歸納為可歸納為： 呈色反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、制備衍生物測溶點、利用水解產(chǎn)物的特定反應(yīng)、薄層色譜、紫外光譜、紅外光譜和高效液相色譜（HPLC）等方法。 （一）與強酸的呈色反應(yīng)（一）與強酸的呈色反應(yīng) 一、化學(xué)鑒別法一、化學(xué)鑒別法 1、常用的酸：硫酸、高氯酸、磷酸、鹽酸。其中以硫酸的應(yīng)用最廣。 2、溶劑：硫酸的呈色反應(yīng)中應(yīng)用最廣的試劑為甲醇和乙醇，而稀釋反應(yīng)體系的試劑常為稀硫酸或水。 3、Kober反應(yīng)是最為著名的、反應(yīng)最廣的對于雌性激素的呈色反應(yīng)。 與強酸的呈色反應(yīng)( (續(xù)續(xù)) ) 與強酸的呈色反應(yīng)( (續(xù)續(xù)) ) 將雌性激素與硫酸乙醇

8、共熱產(chǎn)生黃色，加水或稀硫酸稀釋后再加熱呈紅色，稱為Kober反應(yīng)。例如，雌二醇的Kober反應(yīng)為兩步反應(yīng): 第一步：雌二醇在6080%硫酸中加熱。 第二步：冷卻后加水，再加熱。 v反應(yīng)體系的紫外可見吸收光譜明顯地發(fā)生了向長波方向移動（紅移），說明光譜吸收能級差變小，共軛體系形成或加強。 與強酸的呈色反應(yīng)( (續(xù)續(xù)) )1、C17位醇酮基的呈色反應(yīng) （二）官能團的反應(yīng)（二）官能團的反應(yīng) 堿性酒石酸酮試液(裴林試劑)、氨制硝酸銀試液（多倫試液）、四氮唑鹽試液。 p試劑(氧化劑) 皮質(zhì)激素類藥物C1 7位上具有-醇酮基（-CO-CH2OH），表現(xiàn)出還原性，-醇羥基可以被氧化為醛、或醇酮基發(fā)生斷裂。p

9、基本原理v四氮唑鹽試液被還原而發(fā)生呈色反應(yīng)，產(chǎn)物的顏色隨所用試劑條件不同而定，多為紅色或藍色。 2、酮基的呈色反應(yīng) 官能團的呈色反應(yīng)(續(xù)) 甾體激素分子中，大多在C3和C20位上含有酮基，能與羰基試劑肼發(fā)生呈色反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)腙。 CO+H2NNHCNNH 肼 腙 v常用的試劑：2,4二硝基苯肼、異煙肼、硫酸苯肼。 H2NNHNO2NO2 H2NNHCON 2,4二硝基苯肼 異煙肼 v反應(yīng)條件：常為酸性催化條件下發(fā)生反應(yīng)，并且常在非水溶劑中進行。 3、甲酮基的呈色反應(yīng) 官能團的呈色反應(yīng)(續(xù)) 在甾體激素分子中含有的甲酮基COCH3或活潑的亞甲基能與亞硝基鐵氰化鈉、間二硝基酚、芳香醛反應(yīng)呈色。

10、 與亞硝基鐵氰化鈉的反應(yīng)認為是黃體酮的靈敏、專屬的鑒別方法，在一定條件下，黃體酮顯藍紫色，其中常用甾體激素均顯淡橙色或不顯色。 4、酚羥基的呈色反應(yīng) 官能團的呈色反應(yīng)(續(xù)) 在多數(shù)的雌激素中，C3位上存在酚羥基，能與重氮苯磺酸發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，生成紅色偶氮染料?？捎糜趲Х恿u基的雌激素藥物的鑒別。 H O + -O3SN+N -O3SN NH Ov在弱堿性條件下，重氮鹽與酚偶聯(lián)，重氮基直接攻擊酚羥基的對位，發(fā)生碳偶聯(lián)。對位有取代基時，則偶聯(lián)發(fā)生在鄰位。 5、炔基的沉淀反應(yīng)官能團的呈色反應(yīng)(續(xù)) 含炔基的甾體激素與硝酸銀試液作用，產(chǎn)生白色的炔化銀沉淀。 例如：雌激素：炔雌醇、炔雌醚、美雌醇。 孕激素：

11、炔諾酮、異炔諾酮、甲炔諾酮。 RCCH + Ag+RCC-Ag+ H+6 6、鹵素的反應(yīng)、鹵素的反應(yīng) 官能團的呈色反應(yīng)(續(xù)) 在甾體激素分子中有時出現(xiàn)氟或氯取代的藥物,其鹵素鑒別首先需經(jīng)氧瓶燃燒或回流水解將其轉(zhuǎn)化為無機鹵化物，再按無機鹵化物進行鑒別。 p基本原理p方 法1、含氟藥物：按中國藥典“有機氟化物”項的方法進行鑒 別。（參見本書P16） 2、含氯藥物：當(dāng)氯與側(cè)鏈烴相連時，用回流水解法將氯轉(zhuǎn)化為無機物；而氯與母核環(huán)結(jié)合時，則使用氧瓶燃燒法。再按無機氯化物進行鑒別。（參見本書P18）7、酯的反應(yīng) 官能團的呈色反應(yīng)(續(xù)) 藥物中酯結(jié)構(gòu)的鑒別，一般先水解產(chǎn)生羧酸，再根據(jù)羧酸的性質(zhì)進行鑒別。 p

12、基本原理p羧酸鑒別方法1、利用低級脂肪酸乙酯的香氣鑒別相應(yīng)的藥物 )()()(:42芳香味醋酸乙酯酯化乙醇溶液酯水解乙醇溶液醋酸可的松例SOHKOH2、利用低級脂肪酸的特定氣味進行鑒別 )特有的臭味(戊酸酸化)加熱(H酯水解OH戊酸雌二醇:例二、二、制備衍生物測定熔點制備衍生物測定熔點 （一）測定衍生物縮氨基脲的熔點（一）測定衍生物縮氨基脲的熔點 含有酮基的甾體激素與氨基脲發(fā)生縮合反應(yīng)，生成具有一定熔點的縮氨脲?；谌埸c測定，可以鑒別相應(yīng)的藥物。 苯丙酸諾龍與鹽酸氨基脲縮合生成縮氨脲，其衍生物熔點約為182C，且熔融分解。 p基本原理p示例：苯丙酸諾龍的鑒別測定衍生物縮氨基脲的熔點(續(xù)) OO

13、COCH2CH2+ NH2CONHNH2.HClNOCOCH2CH2H2NOCHN+ H2O + HCl（二）（二）酯的水解酯的水解 具有酯鍵結(jié)構(gòu)的藥物，可采用酯水解方法制備相應(yīng)的甾體激素母核化合物，基于該化合物所具有的敏銳熔點，鑒別相應(yīng)的含有酯鍵結(jié)構(gòu)的藥物。 p基本原理p示例：丙酸睪酮（丙酸睪丸素）的鑒別 丙酸睪酮用醇制氫氧化鉀水解，產(chǎn)生具有敏銳熔點的睪丸素（m.p.150156C，多數(shù)情況下為152156C）。 酯的水解酯的水解(續(xù)) O+ H2OO+ CH3CH2COOHOCOCH2CH3OH三、三、紫外分光光度法紫外分光光度法 甾體激素重要的紫外發(fā)色團有兩類：4-3-酮基和芳環(huán)。它們在

14、紫外光區(qū)均有特征吸收，其最大吸收峰前者約為240nm，后者隨芳環(huán)取代基不同而發(fā)生較大變化?；谔卣魑砧b別相應(yīng)的甾體激素。p基本原理p鑒別方法：常采用的方法有以下三種：1、比較最大吸收波長max及吸收系數(shù)max或Amax的一致性。 2、比較某兩個波長（通常為在出現(xiàn)多個吸收峰處的波長） 處吸收度比值的一致性 。紫外分光光度法（續(xù)）紫外分光光度法（續(xù)） 3、與標準品或標準譜圖 庫的譜圖比較其光譜 圖的一致性。 例：丙酸倍氯米松乙醇溶液（20g/ml）的紫外光譜參數(shù)為，max =239nm，A239nm =0.570.60(吸收度) A(239nm)/ A(263nm) = 2.252.45 四、四

15、、紅外分光光度法紅外分光光度法 在甾體激素的鑒別方法中，紅外光譜由于其強烈的特別性，它已成為了各國藥典普遍采用的、有效而可靠的一咎手段。p鑒別方法：常采用的方法有以下兩種：1、標準品對照法：符合于各國的藥品標準要求，但檢定 費用增加。 2、標準圖譜對照法：檢定費用較低，但有時由于標準品 要求的差異使標準圖譜有所差異，導(dǎo) 致各圖的參照標準不同。 紅外分光光度法（續(xù)）紅外分光光度法（續(xù)） p主要振動特征峰為：（1）、苯環(huán)1615，1590，1505cm-1。（2）、炔基3300cm-1。（3）、游離酚羥基3610cm-1。（4）、C17羥基3505cm-1。 紅外分光光度法（續(xù)）紅外分光光度法（續(xù)

16、） 五、五、薄層色譜（薄層色譜（TLCTLC）法）法 p鑒別方法1、樣品制備：供試品經(jīng)預(yù)處理，消除注射液、片劑和膏劑等輔料的干擾。將預(yù)處理的供試品和對照品分別用規(guī)定的溶劑配制成一定濃度的溶液備用。 2、展開與檢出：在同一塊薄層板上，用供試品和對照品的儲備液分別點樣，按規(guī)定的相同條件（薄層板、展開劑、點樣量、展開時間、晾干條件、顯色劑以及檢出方法等）展開和檢出。對于相同的藥品，要求所顯斑點的Rf值應(yīng)相同。 薄層色譜法（續(xù)）薄層色譜法（續(xù)） p部分甾體激素TLC的鑒別條件 六、六、高效液相色譜（高效液相色譜（HPLCHPLC）法）法p鑒別方法 在相同的色譜條件下，比較甾體激素樣品與其對照品峰的保留

17、時間進行鑒別。在藥典中，一般都規(guī)定在含量測定項下的HPLC圖中，供試品與對照品的保留時間一致。 v甾體激素藥物的特殊雜質(zhì)主要是生產(chǎn)和貯存過程中引入,主要包括以下幾個部分: 1、其它甾體化合物：原料和生產(chǎn)中的中間體、異構(gòu)體以 及降解產(chǎn)物等方式收入。2、硒、有機溶劑、游離磷酸鹽。一、一、其他甾體的檢查其他甾體的檢查p檢查方法 中國藥典中多數(shù)甾體激素原料藥需作“其他甾體”檢查。由于其他甾體與藥物結(jié)構(gòu)類似，通常采用色譜法進行檢查。 （一）薄層色譜法 p基本方法 各國藥典多采用高低濃度對比法進行檢查，即用供試品溶液的稀釋液作為對照進行檢查。其他甾體的檢查（續(xù)）其他甾體的檢查（續(xù)）p示例：氫化可的松中其他

18、甾體的檢查1、供試品：含本品3.0mg/ml的氯仿-甲醇(9:1)溶液.2、對照品: 用氯仿-甲醇(9:1)稀釋供試品為60g/ml.3、檢 視: 供試品溶液的雜質(zhì)斑點不得超過3個,且其顏色 不得深于對照品溶液的主斑點.（二）高效液相色譜法 p基本方法 多采用與含量測定相同條件下的其他甾體檢查，且多為主成分自身對照法，即采用供試品溶液的稀釋液作為對照，以其主峰作為參比。其他甾體的檢查（續(xù)）其他甾體的檢查（續(xù)）p示例：黃體酮中其他甾體的檢查1、供試品：含本品1.0mg/ml的甲醇溶液.2、對照品: 含本品0.02mg/ml的甲醇溶液.3、比較標準: 供試品溶液的雜質(zhì)峰不得超過1個,且其面 積不得

19、大于對照品溶液主峰的3/4.二、二、硒的檢查硒的檢查p檢查方法 “雜質(zhì)硒”主要來源于有些生產(chǎn)的后工序中使用二氧化硒脫氫而引入藥物中。按中國藥典中 “硒檢查”法進行檢查。（參見P62）p基本方法 中國藥典采用氣相色譜法檢查殘留有機溶劑，其測定方法有溶液直接進樣法和頂空進樣法兩種。（參見P48）三、三、有機溶劑殘留量的檢查有機溶劑殘留量的檢查四、四、游離磷酸鹽的檢查游離磷酸鹽的檢查p基本原理 使用標準品比較法，其標準品為磷酸二氫鉀溶液.在740nm處供試品的吸光度不得大于對照品.)740(421為可見最大吸收磷鉬酸藍還原磺酸萘酚氨基磷鉬酸銨鉬酸銨磷酸鹽nmHp測定方法v甾體激素藥物測定的方法很多，

20、藥典中常用的方法有比色法、紫外分光光度法和高效液相色譜法。 p色譜條件 在甾體激素的定量分析中，常用的HPLC方法有兩種，即正相硅膠吸附色譜法和反相硅膠化學(xué)鍵合相分配色譜法。后者應(yīng)用最為廣泛，其色譜條件如下： 一、一、高效液相色譜法高效液相色譜法 高效液相色譜法（續(xù)）高效液相色譜法（續(xù)）1、固定相：常為十八烷基硅烷鍵合硅膠（ODS，C18）。 2、流動相：多數(shù)為甲醇水二元混合溶劑。個別藥物 為了提高選擇性，采用三元混合溶劑，如、甲 醇水乙腈，甲醇水乙醚等。p測定方法： 多數(shù)采用內(nèi)標法測定。常用240nm或280nm左右的紫外檢測。高效液相色譜法（續(xù)）高效液相色譜法（續(xù)）高效液相色譜法（續(xù)）高效

21、液相色譜法（續(xù)）p示例：黃體酮的含量測定1、內(nèi)標物：已烯雌酚.2、測定方法: 反相HPLC，含量按內(nèi)標峰以峰面積計算.p甾體激素分子中紫外光譜的發(fā)色團1、 4-3-酮基： 它是甾體激素中最常見的發(fā)色團，max 約為240nm。2、芳香苯環(huán)： A環(huán)為苯環(huán)的雌性激素在280nm附近有一 個中等強度的吸收帶。p方法的特點 1、準確、簡便，廣泛用于甾體激素原料藥的測定。2、選擇性和專屬性較差：原料和注射劑可以對其溶液直接測定，片劑采用“先分離，后測定”的原則。 p在甾體激素藥物的比色法中，常用四氮唑、異煙肼和Kober反應(yīng)等三種方法。 (一) 異煙肼比色法異煙肼比色法1、原 理 甾體激素C3酮基及某些

22、其他位置上的酮基都能在酸性條件下與羰基試劑異煙肼縮合形成黃色異煙腙，在一定波長下具有最大吸收。某些具有兩個酮基的甾體激素可形成雙腙。 2、測定方法 本法主要用于甾體激素制劑的測定，其基本步驟為：（1）、配制對照品溶液（2）、制備供試品溶液（3）、呈色反應(yīng)（4）、測定與比色O+NCONHNH2NCOHNN+ H2O3、討論(1)、溶劑的選擇：只有用無水乙醇和無水甲醇才能得到滿意的結(jié)果，一般多選用乙醇。 其它溶劑因受到異煙肼鹽酸鹽在其中溶解度的限制不能采用。試劑在無水甲醇中的穩(wěn)定性較好，呈色強度也較在乙醇中為高，但由于它對植物油的溶解度較乙醇小，故一般多選用乙醇。 (2)、酸的種類和濃度以及異煙肼

23、的濃度：當(dāng)酸與異煙肼試劑的摩爾比為2：1時，可獲得最大吸收度。而不同的酸所需要的濃度是不一樣的。(3)、水分、溫度、光線和氧的影響： 當(dāng)溶劑中含水量增高時，吸收度隨之降低。因為甾體激素與異煙肼的縮合為可逆反應(yīng)，水分可促使反應(yīng)逆轉(zhuǎn)而水解。溫度升高，反應(yīng)加速。當(dāng)在具塞玻管中不致使溶劑揮發(fā)及吸收水分的情況下，光與氧不影響反應(yīng)。 (4)、反應(yīng)的專屬性 ：本法對43酮甾體具有一定的專屬性。 具有43酮基的甾體激素，在室溫不到lh即可定量地與酸性異煙肼反應(yīng)；其他甾酮化合物需在長時間放置或加熱后方可反應(yīng)完全，例如C20酮化合物(黃體酮，可的松等)反應(yīng)就很慢。C17酮化合物也可發(fā)生反應(yīng)并形成腙，Cll酮在上述

24、條件下不發(fā)生反應(yīng)。具有共扼雙鍵的另一些甾酮化合物，如57酮醋酸膽甾醇，在相當(dāng)長的時間內(nèi)反應(yīng)仍不能完全。因此，在上述反應(yīng)條件下，本法對43酮甾體具有一定的專屬性。 (1)、氯化三苯四氮唑 （TTC） 氯化三苯四氮唑即為2,3,5三苯基氯化四氮唑（2,3,5triphenyltetrazolium chloride, i.e. TTC），為無色試劑，其結(jié)構(gòu)為： (二)四氮唑比色法四氮唑比色法 1、四氮唑鹽的種類 (2)、藍四氮唑（Blue tetrazoline, i.e. BT） BT的化學(xué)名為3,3二甲氧苯基雙4,4（3,5二苯基）氯化四氮唑。該試劑為無色,其結(jié)構(gòu)為： 四氮唑比色法是測量皮質(zhì)激素的重要方法?；贑17-醇酮基（-CO-CH2OH）的還原性，在強堿性溶液中被TTC或BT氧化，而TTC或BT被還原為有色的甲（formazan）衍生物，其顏色隨條件不同而產(chǎn)生差異，多為紅色或藍色。 2、反應(yīng)原理 USP（23）采用藍四氮唑，BP（1993）采用氯化三苯四氮唑，中國藥典（2000）采用氯化三苯四氮唑。 氯化三苯四氮唑的還原產(chǎn)物為深紅色的三苯甲，故稱為紅四氮唑（red tetrazoline，即RT），其max為480490nm，多數(shù)為485nm。藍四氮唑的還原產(chǎn)物為暗藍色的雙甲，max約為525nm。但是，按照美國藥典規(guī)定的實驗條件，幾乎是定量形成BT單甲（紅