siRNA的制備

1、sirna的制備 到目前為止，較為常用的辦法有通過(guò)化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄、長(zhǎng)片段dsrnas經(jīng)rnase iii類(lèi)降解等體外制備sirna，以及通過(guò)sirna表達(dá)載體或者病毒載體，pcr制備的sirna表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生sirna。 (1) 化學(xué)合成許多國(guó)外公司都可以按照用戶(hù)要求，提供高質(zhì)量的化學(xué)合成sirna。但價(jià)格高、定制周期長(zhǎng)，特殊是有特別需求的，很難得到愜意的合成。因?yàn)閮r(jià)格比其他辦法高，為一個(gè)基因合成3-4對(duì)sirnas的成本就更高了，比較頻繁的做法是用其他辦法篩選出最有效的序列，再舉行化學(xué)合成。此辦法適用于已經(jīng)找到最有效的sirna的狀況下，需要大量sirna舉行討論，但不太適用于篩

2、選sirna的討論。 (2）體外轉(zhuǎn)錄以dna oligo為模板，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成sirnas,成本相對(duì)化學(xué)合成法比較低，而且能夠比化學(xué)合成法更快地得到sirnas。不足之處是試驗(yàn)的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的sirnas，但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。體外轉(zhuǎn)錄得到的sirnas毒性小，穩(wěn)定性好，效率高，只需要化學(xué)合成的sirna量的1/10，就可以達(dá)到化學(xué)合成sirna所能達(dá)到的效果，從而使轉(zhuǎn)染效率更高。此辦法最適用于篩選sirnas，特殊適用于需要制備多種sirnas的試驗(yàn)。當(dāng)試驗(yàn)大量需要一個(gè)特定的sirna時(shí)，該辦法就不太適用了。 (3）用rnase ii

3、i消化長(zhǎng)片段雙鏈rna制備sirna以上制備sirna辦法的缺陷是需要設(shè)計(jì)和檢驗(yàn)多個(gè)sirna序列，以便找到一個(gè)有效的sirna。而制備一份含有各種sirnas的混合物，就可以避開(kāi)這個(gè)缺陷。通常挑選是200-1000bp靶mrna模板，用體外轉(zhuǎn)錄的辦法，制備長(zhǎng)片段雙鏈rna，然后用rnase ir (or dicer）在體外消化，得到一種sirnas混合物。在除掉沒(méi)有被消化的dsrna后，這個(gè) sirna混合物就可以挺直轉(zhuǎn)染細(xì)胞，辦法和單一的sirna轉(zhuǎn)染一樣。因?yàn)閟irna混合物中，有許多不同的sirnas，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。該辦法主要優(yōu)點(diǎn)在于可以跳過(guò)檢測(cè)和篩選有效slrna

4、序列的步驟，不過(guò)這種辦法的缺點(diǎn)也很顯然，就是有可能引發(fā)非特異的基因緘默，特殊是同源或者是疏遠(yuǎn)相關(guān)的基因。因此，該辦法最適用于迅速而經(jīng)濟(jì)地討論某個(gè)基因功能缺失的表型，不適用于長(zhǎng)時(shí)光的討論項(xiàng)目，或者是需要一個(gè)特定的sirna舉行討論的狀況。 前面的3種辦法主要都是體外制備sirnas，并且需要特地的rna轉(zhuǎn)染試劑將sirnas轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)。而sirna表達(dá)載體和基于pcr的表達(dá)框架這兩種辦法，其原理是使轉(zhuǎn)染到細(xì)胞的dna模板在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到sirnas。這兩種辦法的優(yōu)點(diǎn)在于不需要挺直操作rna。 (4) slrna表達(dá)載體 多數(shù)的sirna表達(dá)載體依靠3種rna聚合酶啟動(dòng)子中的一種，操縱一段小的發(fā)夾r

5、na (short hairpin rna,shrna）在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。這3類(lèi)啟動(dòng)子包括人源和鼠源的u6啟動(dòng)子和人hl啟動(dòng)子。rna pol iii啟動(dòng)子可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子rna，而且它是通過(guò)添加一串（3到6個(gè)）u來(lái)終止轉(zhuǎn)錄的。要用法這類(lèi)載體，需要訂購(gòu)2段編碼短發(fā)夾rna序列的dna單鏈，克隆到相應(yīng)載體的pol iii啟動(dòng)子下游。該辦法得到的重組體需要經(jīng)過(guò)測(cè)序以保證克隆的序列是正確的。sirna表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)在于可以舉行較長(zhǎng)久討論。 病毒載體也可用于sirna表達(dá)，其優(yōu)勢(shì)在于可以挺直高效率感染細(xì)胞舉行基因緘默的討論，避開(kāi)因?yàn)橘|(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來(lái)的種種不便，而且轉(zhuǎn)染效果

6、越發(fā)穩(wěn)定。該辦法最適用于已知一個(gè)有效的sirna序列，需要維持較長(zhǎng)時(shí)光的基因緘默。因?yàn)榭寺『蜏y(cè)序等步驟較為費(fèi)時(shí)，所以該辦法不適用于篩選sirna序列。 (5 ) sirna表達(dá)框架 sirna表達(dá)框架（sirna expression cassettes, secs）是一種由pcr得到的sirna表達(dá)模板，包括一個(gè)rnapol iii啟動(dòng)子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)sirna，一個(gè)rna pol 終止位點(diǎn)，能夠挺直導(dǎo)入細(xì)胞舉行表達(dá)而無(wú)需事前克隆到載體中。與sirna表達(dá)載體不同的是，secs不需要載體克隆、測(cè)序等頗為費(fèi)時(shí)的步驟，可以挺直由pcr得到。因此，secs成為篩選sirna的最有效工具，甚至可以用來(lái)篩選在特定的討論體系中啟動(dòng)子和，irna的最適搭配。假如在pcr兩端添加酶切位點(diǎn)，那么通過(guò)secs篩選出最有效的sirna后，可以挺直克隆到載體中構(gòu)建sirna表達(dá)載體。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達(dá)sirna和長(zhǎng)效抑制的討論。但這個(gè)辦法的主要缺點(diǎn)是p