植物細(xì)胞程序性死亡(PCD)的誘導(dǎo)、形態(tài)觀察

1、首都師范大學(xué)生物實驗報告科目：細(xì)胞生物學(xué) 班級：師范班 姓名：王望學(xué)號：1110800065實驗名稱：植物細(xì)胞程序性死亡(PCD的誘導(dǎo)、形態(tài)觀察 日期：10.30一、 實驗?zāi)康模?、了解植物細(xì)胞PCD的概念2、掌握植物細(xì)胞 PCD的誘導(dǎo)方法、和統(tǒng)計方法3、了解動物細(xì)胞凋亡過程的方法二、實驗原理：1、細(xì)胞死亡：細(xì)胞死亡作為生物體的一種常見現(xiàn)象，在動物細(xì)胞中有三種方式：凋亡 (apoptosis),自噬(autophagy)和壞死(necrosis)。前兩種類型屬于細(xì)胞程序性死亡 (programmed cell death , PCD)。細(xì)胞壞死是細(xì)胞在遭受極度刺激時引起的細(xì)胞死亡，以細(xì)胞質(zhì)膜的

2、破裂為特征，造成內(nèi)含物的炎性泄露，是一種非正常死亡。細(xì)胞的PCD是細(xì)胞的一種 主動性”死亡行為，從形態(tài)上和功能上都與細(xì)胞壞死有很大的不同。2、植物中細(xì)胞程序性死亡(PCD：目前可依據(jù)液泡膜破裂后，是否在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生快速降 解將PCD分為兩個大類。第一類為自溶性(autolytic ) PCD,與液泡中的水解酶的釋放有關(guān)，在液泡破裂后，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)的快速清除。第二種為非自溶 PCD, (non-autolytic ),即液泡膜破裂但是沒有出現(xiàn)快速的細(xì)胞質(zhì)的清除。目前鑒定細(xì)胞的PCD類型，還是以細(xì)胞形態(tài)學(xué)為主。3、動植物細(xì)胞凋亡標(biāo)準(zhǔn)：動物：凋亡：凋亡小體，或者在細(xì)胞表面的水泡，感染病原體 后在其他細(xì)

3、胞中的降解。自噬：自噬小體，自溶酶體，和小的促進(jìn)細(xì)胞溶解的液泡數(shù)目的增加 壞死：沒有上面的定義的標(biāo)準(zhǔn)。植物：自溶：植物膜破裂之后對細(xì)胞質(zhì)的快速清理。非自溶：沒有對細(xì)胞質(zhì)的快速清理。其他：染色質(zhì)濃縮細(xì)胞核破裂 自我標(biāo)記信號自食信號 細(xì)胞膨脹，細(xì)胞器膨脹，質(zhì)膜破裂染色質(zhì)濃縮。液泡體積增加(細(xì)胞質(zhì)體積減小)需要Ca2+的內(nèi)流，細(xì)胞質(zhì)皺縮，細(xì)胞器膨脹，小泡增多但體積不增加。三、實驗步驟1、植物細(xì)胞凋亡：加入較高濃度的 CaCL2誘導(dǎo)，觀察和統(tǒng)af誘發(fā)產(chǎn)生的PCD細(xì)胞。用改良苯酚品紅染色觀察 PCD細(xì)胞核發(fā)生染色質(zhì)凝集 (condensation )、趨邊化(margination)、產(chǎn) 生PCD小泡等

4、形態(tài)學(xué)上的變化。(1) 形態(tài)觀察： 洋蔥內(nèi)表皮，100mmol/LCaCl2 500mmol/LCaCl2 (注意都用 PBS (6.5)配置)處理兩小時，用于形態(tài)觀察和凋亡統(tǒng)計。(2) PCD計數(shù)2、動物細(xì)胞凋亡觀察：觀看錄像。四、實驗材料改良苯酚品紅洋蔥鱗莖內(nèi)表皮、細(xì)胞 PCD誘導(dǎo)劑一一Ca2+、形態(tài)學(xué)觀察染色液五、實驗結(jié)果1、 植物細(xì)胞凋亡觀察:(1)觀察數(shù)據(jù):處理計數(shù)PCD率(平均)數(shù) 據(jù)0.1MCaCl2（2 hr）47/116（如圖A）46/115（如圖B）108/26（如圖C）30/120（如圖D）23/93（如圖E）31%PCD率41%40%24%25%25%0.5MCaCl2

5、（2 hr）23/63（如圖F）39/86（如圖G）30/73（如圖H）23/67（如圖I）37/89（如圖J）39.6%PCD率36%45%41%34%42%Ck20/97（如圖 K）20.6%(2)觀察圖片:A: 0.1M CaCl2 誘導(dǎo) 2h 的 PCD觀察（10*40）B: 0.1M CaCl2 誘導(dǎo) 2h 的 PCD觀察（10*40）C: 0.1M CaCl2 誘導(dǎo) 2h 的 PCD觀察（10*40 ） D: 0.1M CaCl2 誘導(dǎo) 2h 的 PCD觀察（10*40 ）E: 0.1M CaCl2 誘導(dǎo) 2h 的 PCD觀察(10*40)OF: 0.5M CaCl2 誘導(dǎo) 20-

6、30min 的 PCD 觀察 (10*40 )HH： 0.5M CaCl2 誘導(dǎo) 20-30min 的 PCD觀察 (10*40 )G: 0.5M CaCl2 誘導(dǎo) 20-30min 的 PCD 觀察 (10*40 )I: 0.5M CaCl2 誘導(dǎo) 20-30min 的 PCD 觀察 (10*40 )J: 0.5M CaCl2 誘導(dǎo) 20-30min 的 PCD 觀察 (10*40 )K:對照組，光鏡 10X40(3)觀察總結(jié)：<1>經(jīng)過觀察，洋蔥內(nèi)皮細(xì)胞都有一定數(shù)量的凋亡。 沒有經(jīng)過氯化鈣的細(xì)胞 PCD率最低， 其次為低濃度氯化鈣處理后的洋蔥細(xì)胞，PCD率最高的為是經(jīng)過高濃度氯

7、化鈣處理后的洋蔥細(xì)胞?？梢娀瘜W(xué)脅迫因子氯化鈣的濃度越高，對細(xì)胞凋亡影響越大。<2>凋亡的細(xì)胞形態(tài)也各有不同，有的為細(xì)胞核變形，有的為質(zhì)壁分離現(xiàn)象明顯，有的 為細(xì)胞膜皺縮，細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞核呈新月形，有的為染色質(zhì)濃縮聚集，凝聚的染 色質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)成分包裹在一起，形成較多的近球狀凋亡小體。2、 動物細(xì)胞凋亡觀察：(看錄像)(1)細(xì)胞色素c作為一種信號物質(zhì)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細(xì)胞液，線粒體里的細(xì)胞色素c通過熒光標(biāo)記，被染成黃綠色。(2)磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)， 但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中，紅顏色出現(xiàn)，為eat me信號。(3)帶有紅色信號的 DNA被切斷，膜把細(xì)胞質(zhì)和被切斷的dna包成小體，紅的包著著藍(lán)的為凋亡小體。被吞噬細(xì)胞吞噬掉。六 改進(jìn)與建議1 植物細(xì)胞的凋亡主觀臆斷比較嚴(yán)重，不能肯定或確定它是否凋亡。在給細(xì)胞計數(shù)的時候，雖然可以照下來再計數(shù)，但是還是有一定困難，希望下一回可 以用計數(shù)器。2 植物細(xì)胞在高濃氯化鈣浸泡下，很多細(xì)胞都出現(xiàn)了質(zhì)壁分離現(xiàn)象，