實(shí)驗(yàn)35過(guò)氧化氫酶的活性測(cè)定

1、植物在逆境下或衰老時(shí)，由于體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng)而使H2O2發(fā)生累積。H2O2可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)核酸，蛋白質(zhì)等生物大分子，并使細(xì)胞膜遭受損害，從而加速細(xì)胞的衰老和解體。過(guò)氧化氫酶可以清除H2O2，是植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)之一。因此，植物組織中H2O2含量和過(guò)氧化氫酶活性與植物的抗逆性密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)用分光光度法測(cè)定過(guò)氧化氫含量，利用高錳酸鉀滴定法和紫外吸收法測(cè)定過(guò)氧化氫酶活性。一、過(guò)氧化氫含量的測(cè)定【原理】H2O2與硫酸鈦（或氯化鈦）生成過(guò)氧化物鈦復(fù)合物黃色沉淀，可被HSO4溶解后，在415nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定。在一定范圍內(nèi)，其顏色深淺與H2O2濃度呈線性關(guān)系?！緝x器和用具】研缽；移液管

2、0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×7個(gè)，離心管5ml×8支；離心機(jī)；分光光度計(jì)?！驹噭?00mol/L H2O2丙酮試劑：取30%分析純H2O2 57l，溶于100ml，再稀釋100倍；2mol/L硫酸；5%（W/V）硫酸鈦；丙酮；濃氨水。 【方法】 1.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：取10ml離心管7支，順序編號(hào)，并按表40-1加入試劑。表40-1 測(cè)定H2O2濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線配置表試劑（ml）離 心 管 號(hào)1234567100mol/L H2O200.10.20.40.60.81.04下預(yù)冷丙酮1.00.90.80.60.40.205%硫酸鈦0.10.1

3、0.10.10.10.10.1濃氨水0.20.20.20.20.20.20.2 3000r/min 離心10min，棄去上清夜，留沉淀2mol 硫酸5.05.05.05.05.05.05.0 待沉淀完全溶解后，將其小心轉(zhuǎn)入10ml容量瓶中，并用蒸餾水少量多次沖洗離心管，將洗滌液合并后定容至10ml刻度，415nm波長(zhǎng)下比色。 2.樣品提取和測(cè)定：(1)稱取新鮮植物組織25g（視H2O2含量多少而定），按材料與提取劑11的比例加入4下預(yù)冷的丙酮和少許石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入離心管3000 r/min下離心10min，棄去殘?jiān)?，上清液即為樣品提取液?2)用移液管吸取樣品提取液1ml，按表35-1

4、加入5%硫酸鈦和濃氨水，待沉淀形成后3000rpm/min離心10min，棄去上清液。沉淀用丙酮反復(fù)洗滌35次，直到去除植物色素。(3)向洗滌后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，與標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣的方法定容并比色。 3.結(jié)果計(jì)算： 植物組織中H2O2含量(mol/g Fw)=式中 C標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品中H2O2濃度（mol）； Vt樣品提取液總體積（ml）； V1測(cè)定時(shí)用樣品提取液體積（ml）； FW植物組織鮮重（g）。二、過(guò)氧化氫酶的活性測(cè)定高錳酸鉀滴定法 【原理】過(guò)氧化氫酶（CAT）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過(guò)氧化氫分解為水和分子氧，在此過(guò)程中起傳遞電子的作用，過(guò)氧化氫則既是

5、氧化劑又是還原劑。 2e R(Fe+2)+H2O2=R(Fe+3+OH)2e R(Fe+3OH)2+H2O2=R(Fe+2)2+2H2O+O2 據(jù)此，可根據(jù)H2O2的消耗量或O2的生成量測(cè)定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量（反應(yīng)過(guò)量）的H2O2溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的H2O2 5H2O2+2KMnO4+4H2SO4 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4 即可求出消耗的H2O2的量。 【儀器和用具】研缽；三角瓶50ml×4；酸式滴定管（10ml）；恒溫水浴；容量瓶25ml×1。 【試劑】10% H2SO4；0.2mol/L磷

6、酸緩沖液pH7.8；0.1mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液：稱取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液標(biāo)定；0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大約等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀釋至1000ml，用標(biāo)準(zhǔn)0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性條件下）進(jìn)行標(biāo)定；0.1mol/L草酸：稱取優(yōu)級(jí)純H2C2O4·2H2O 12.607g，用蒸餾水溶解后，定容至1L。 【方法】 1.酶液提取 取小麥葉片2.5g加入pH7.8的磷酸緩沖溶液少量，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，用該緩沖液沖洗研缽，并

7、將沖洗液轉(zhuǎn)入容量瓶中，用同一緩沖液定容，4000rpm離心15min，上清液即為過(guò)氧化氫酶的粗提液。 2.取50ml三角瓶4個(gè)（兩個(gè)測(cè)定兩個(gè)對(duì)照），測(cè)定瓶中加入酶液2.5ml，對(duì)照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同時(shí)計(jì)時(shí)，于30恒溫水浴中保溫10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。3.用0.1mol/L KMn4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定H2O2，至出現(xiàn)粉紅色（在30min內(nèi)不消失）為終點(diǎn)。 4.結(jié)果計(jì)算： 酶活性用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示： 酶活(mgH2O2/gFW·min)=式中 A對(duì)照KMnO4滴定毫升數(shù)； B酶反

8、應(yīng)后KMnO4滴定毫升數(shù)； VT酶液總量（ml）； V1反應(yīng)所用酶液量（ml）; W樣品鮮重（g）； 1.71ml 0.1mol/L的KMnO4相當(dāng)于1.7mg H2O2。 【注意】 所用KMnO4溶液及H2O2溶液臨用前要經(jīng)過(guò)重新標(biāo)定。三、過(guò)氧化氫酶的活性測(cè)定紫外吸收法【原理】H2O2在240nm波長(zhǎng)下有強(qiáng)烈吸收，過(guò)氧化氫酶能分解過(guò)氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度(A240)隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測(cè)量吸光率的變化速度即可測(cè)出過(guò)氧化氫酶的活性?！緝x器與用具】 紫外分光光度計(jì)；離心機(jī)；研缽；250ml容量瓶1個(gè)；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml試管3支；恒溫水浴；【試劑】0.2mol

9、/L pH7.8磷酸緩沖液（內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高錳酸鉀標(biāo)定）。 【方法】 1.酶液提?。悍Q取新鮮小麥葉片或其它植物組織0.5g置研缽中，加入23ml 4下預(yù)冷的pH7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，并用緩沖液沖洗研缽數(shù)次，合并沖洗液，并定容到刻度?；旌暇鶆?qū)⒘科恐?冰箱中靜置10min，取上部澄清液在4000rpm下離心15min，上清液即為過(guò)氧化氫酶粗提液。5下保存?zhèn)溆谩?.測(cè)定：取10ml試管3支，其中2支為樣品測(cè)定管，1支為空白管，按表40-2順序加入試劑。表40-2 紫外吸收法測(cè)定H2O2樣品液配置表管 號(hào)S1S2S3粗酶液(ml)0.20.20.2pH7.8磷酸(ml)1.51.51.5蒸餾水(ml)1.01.01.0 25預(yù)熱后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即記時(shí)，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下測(cè)定吸光度，每隔1min讀數(shù)1次，共測(cè)4min，待3支管全部測(cè)定完后，按下式計(jì)算酶活性。 3.結(jié)果計(jì)算： 以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個(gè)酶活單位（u）。 過(guò)氧化氫酶活性(u/gFW/min)=式中 A240= AS0 AS0加入煮死酶液的對(duì)照管吸光值； AS1, AS2樣品管吸光值； Vt粗酶提取液