單倍體細(xì)胞培養(yǎng)

1、 牛牛文庫(kù)文檔分享 一、引言四、單倍體植物的用途（育種） 牛牛文庫(kù)文檔分享 單倍體（單倍體（Haploid）：）：指具有配子體（gametophyte）染色體數(shù)的孢子體(植物個(gè)體)(sporophyte)。 一、引言 牛牛文庫(kù)文檔分享 根據(jù)物種倍性不同，單倍體可以分為兩大類(lèi)：一類(lèi)是一倍單倍體,即二倍體物種產(chǎn)生的單倍體；另一類(lèi)是多倍單倍體,即起源于多倍體物種（如4x、6x）。二倍體(diploid )植物其單倍體（haploid）即一倍體（monoploid ） 如， 玉米 2n = 2x = 20 n= x = 10； 水稻 2n = 2x = 24 n= x = 12四倍體(tetraplo

2、id)植物其haploid為dihaploid 如，馬鈴薯 2n = 4x = 48， n = 2x = 24六倍體(hexaploid)植物其haploid為triploid 如，普通小麥2n = 6x = 42， n = 3x = 21八倍體(octoploid)植物其haploid為tetraploid 如，草莓 2n = 8x = 56 ，n = 4x = 28 牛牛文庫(kù)文檔分享單倍體植株特點(diǎn)：?jiǎn)伪扼w植株特點(diǎn)：?jiǎn)伪扼w含有本物種配子染色體數(shù)及其全套染色體組，也就是有生活必需的全套基因，因此在適宜條件下，能正常生長(zhǎng)。但因?yàn)樗旧w僅是正常體細(xì)胞的一半，一般表現(xiàn)為：一般比較矮小纖弱，各器官

3、明顯減小；雌雄配子嚴(yán)重?cái)∮械纳踔敛荒苓M(jìn)入有性世代； 染色體一經(jīng)加倍，即得到純合的正常植物體。 牛牛文庫(kù)文檔分享體內(nèi)發(fā)生體內(nèi)發(fā)生離體誘導(dǎo)離體誘導(dǎo)二、單倍體植株如何產(chǎn)生二、單倍體植株如何產(chǎn)生 牛牛文庫(kù)文檔分享 體內(nèi)發(fā)生：體內(nèi)發(fā)生：體內(nèi)發(fā)生 即從胚囊內(nèi)產(chǎn)生單倍體。這包括：雌核發(fā)育：雌核發(fā)育：精子雖然正常地鉆入和激活卵子，但精子的細(xì)胞核精子雖然正常地鉆入和激活卵子，但精子的細(xì)胞核并未參與卵球的發(fā)育，精子的染色體很快消失，胚胎的發(fā)育僅并未參與卵球的發(fā)育，精子的染色體很快消失，胚胎的發(fā)育僅在母體遺傳控制下進(jìn)行在母體遺傳控制下進(jìn)行雄核發(fā)育：雄核發(fā)育：卵子與正常的精子受精，進(jìn)入卵子內(nèi)的精子染色體卵子與正常

4、的精子受精，進(jìn)入卵子內(nèi)的精子染色體加倍，發(fā)育為完全為父本性狀的二倍體加倍，發(fā)育為完全為父本性狀的二倍體 牛牛文庫(kù)文檔分享（1 1）人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法）人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法精子遺傳物質(zhì)的失活（假受精）精子遺傳物質(zhì)的失活（假受精）輻射處理：輻射處理：射線（通常用射線（通常用60Co60Co或或173Cs)173Cs)，X X射線射線和紫外線和紫外線化學(xué)處理：化學(xué)處理：甲苯胺藍(lán)、乙烯尿素和二甲基硫酸等甲苯胺藍(lán)、乙烯尿素和二甲基硫酸等顯微手術(shù)法：顯微手術(shù)法：直接除去受精卵中的雄原核。直接除去受精卵中的雄原核。細(xì)胞分裂的阻止（抑制第二極體排出，發(fā)育成細(xì)胞分裂的阻止（抑制第二極體排出，發(fā)育成二倍體）

5、二倍體）溫度休克法：溫度休克法：冷休克、熱休克冷休克、熱休克流體靜水壓作用：流體靜水壓作用：化學(xué)制劑處理化學(xué)制劑處理：細(xì)胞松馳素細(xì)胞松馳素B B、聚乙二醇、聚乙二醇 牛牛文庫(kù)文檔分享（2 2）人工誘導(dǎo)雄核發(fā)育的方法）人工誘導(dǎo)雄核發(fā)育的方法輻射處理：輻射處理：射線（通常用射線（通常用60Co60Co或或173Cs)173Cs)，X X射線射線和紫外線和紫外線 用紫外線、用紫外線、X X射線或射線或射線處理卵子，使射線處理卵子，使其遺傳物質(zhì)失活，與正常精子受精，再在適其遺傳物質(zhì)失活，與正常精子受精，再在適當(dāng)時(shí)間以冷、熱或高壓等處理。當(dāng)時(shí)間以冷、熱或高壓等處理。 牛牛文庫(kù)文檔分享 離體誘導(dǎo)：離體誘導(dǎo)

6、： 植物細(xì)胞具有潛在的再生性和全能性,能發(fā)育為完整植株，故應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)特定組織進(jìn)行離體培養(yǎng)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體。方法如下： A、花藥和花粉培養(yǎng) B、未受精子房及卵細(xì)胞培養(yǎng) 牛牛文庫(kù)文檔分享1 1、概述、概述概念 花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng): 把發(fā)育到一定階段的花藥接種在人工培養(yǎng)基上,使其發(fā)育和分化成為植株的過(guò)程. 花粉培養(yǎng)花粉培養(yǎng)( (小孢子培養(yǎng)小孢子培養(yǎng)) ): 從花藥中分離出花粉粒,使之成為分散的或游離狀態(tài),通過(guò)培養(yǎng)使花粉粒脫分化,進(jìn)而發(fā)育成完整植株的過(guò)程.A：花藥和花粉培養(yǎng)花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)是獲花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)是獲是植物單倍體的有效方法之一是植物單倍體的有效方法之一 牛牛文庫(kù)文檔分享2、花藥

7、或花粉培養(yǎng)在作物育種中的作用：供體植株小孢子（N）花粉培養(yǎng)花粉植株（N）雄核發(fā)育自然加倍人工加倍純合植株（2N）（1 1）縮短育種年限：常規(guī)育種需）縮短育種年限：常規(guī)育種需4-64-6年獲得純年獲得純系，而小孢子培養(yǎng)僅需系，而小孢子培養(yǎng)僅需1-21-2年。年。一年內(nèi)獲得純系花藥和花粉培養(yǎng) 牛牛文庫(kù)文檔分享二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因?yàn)锳Abb的純合單株常規(guī)方法： AAbb出現(xiàn)的概率為1/16，并且不能將AAbb與Aabb、aAbb區(qū)分開(kāi)。（2）提高了目標(biāo)基因型的選擇效率）提高了目標(biāo)基因型的選擇效率ABaBAbabABAABBAaBBAABbAaBbaBaABBaaBBa

8、ABbaaBbAbAabBAabBAAbbAabbabaAbBaabBaAbbaabb花藥和花粉培養(yǎng) 牛牛文庫(kù)文檔分享二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因?yàn)锳Abb的純合單株單倍體方法： AAbb出現(xiàn)的概率為1/4。 單倍體單倍體 二倍體二倍體AB AABBaB aaBBAb AAbbab aabb供體親本供體親本AaBb花粉花粉培養(yǎng)培養(yǎng)花藥和花粉培養(yǎng) 牛牛文庫(kù)文檔分享 植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能在植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能在當(dāng)代及時(shí)獲得突變個(gè)體，加倍后成為穩(wěn)定的純當(dāng)代及時(shí)獲得突變個(gè)體，加倍后成為穩(wěn)定的純系。利于篩選隱性突變體系。利于篩選隱性突變體 提高誘變

9、效率。提高誘變效率。（3 3）誘變育種中的作用）誘變育種中的作用（4 4）利于獲得優(yōu)良植株）利于獲得優(yōu)良植株 如：蘆筍全雄系的培育如：蘆筍全雄系的培育（5 5）用作基礎(chǔ)研究的各個(gè)領(lǐng)域）用作基礎(chǔ)研究的各個(gè)領(lǐng)域花藥和花粉培養(yǎng) 牛牛文庫(kù)文檔分享花花藥藥的的結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)及及花花粉粉管管的的形形成成花藥的結(jié)構(gòu)及花粉粒的發(fā)育2NN減數(shù)分裂花藥和花粉培養(yǎng) 牛牛文庫(kù)文檔分享3、花藥和花粉培養(yǎng)中雄核發(fā)育的途徑A途徑 小孢子第一次有絲分裂為不均等分裂，形成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞 （1）A-V途徑 由營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體 （2）A-G途徑 由生殖細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體 （3）A-VG途徑（E途徑） 由營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)

10、胞各自獨(dú)立分裂，共同形成單倍體 （4）C途徑 營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞通過(guò)核融合，形成多倍體植株花藥和花粉培養(yǎng) 牛牛文庫(kù)文檔分享 B途徑 小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成大小相近的兩個(gè)細(xì)胞。然后由這兩細(xì)胞連續(xù)分裂形成單倍體植株，或者核融合形成多倍體植株?；ㄋ幒突ǚ叟囵B(yǎng) 牛牛文庫(kù)文檔分享4、花藥培養(yǎng)與花粉培養(yǎng)的異同點(diǎn) 培養(yǎng)目的相同，均獲得小孢子植株。 花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)；而花粉培養(yǎng)屬于細(xì)胞培養(yǎng)。 花粉培養(yǎng)沒(méi)有藥壁組織干擾，單倍體產(chǎn)量高?；ㄋ幒突ǚ叟囵B(yǎng) 牛牛文庫(kù)文檔分享花藥和花粉培養(yǎng) 牛牛文庫(kù)文檔分享花藥培養(yǎng) 被子植物的花藥中，被子植物的花藥中，細(xì)胞按染色體的倍性細(xì)胞按染色體的倍性可分為兩類(lèi)：一類(lèi)

11、為可分為兩類(lèi)：一類(lèi)為單倍體細(xì)胞，即由花單倍體細(xì)胞，即由花粉中的花粉母細(xì)胞減粉中的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂后形成的小孢數(shù)分裂后形成的小孢子；另一類(lèi)為二倍體子；另一類(lèi)為二倍體細(xì)胞，如藥隔、藥壁細(xì)胞，如藥隔、藥壁及花絲等組織。及花絲等組織。 牛牛文庫(kù)文檔分享1、研究歷史：首先報(bào)道通過(guò)花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株成功的是印度學(xué)者Guha和Maheshwari (1964, 1966)。 花藥培養(yǎng)獲得單倍體的技術(shù)途徑已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育種中廣泛應(yīng)用。 我國(guó)花藥培養(yǎng)工作雖然開(kāi)始較晚，但在短短的時(shí)間內(nèi)取得了可喜的進(jìn)展，1974年中國(guó)農(nóng)科院植物研究所和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，僅僅用了三年的時(shí)間，就

12、培養(yǎng)出世界上第一個(gè)作物新品種-單育1號(hào)煙草品種?；ㄋ幣囵B(yǎng) 牛牛文庫(kù)文檔分享2 2、花藥培養(yǎng)的基本程序、花藥培養(yǎng)的基本程序：花藥培養(yǎng) 挑選適宜的基因型作材料； 確定花粉發(fā)育時(shí)期；材料的預(yù)處理；誘導(dǎo)培養(yǎng)；分化培養(yǎng)； 染色體數(shù)觀察和染色體數(shù)加倍；花粉植株當(dāng)代及后代觀察鑒定。 影響花藥培養(yǎng)的因素很多，如材料生理狀況和基因型、接種時(shí)期、接種方式(如直插、或平放)、培養(yǎng)方式(固體、漂浮、液體淺層連續(xù)培養(yǎng)、條件培養(yǎng)等)、基本培養(yǎng)基種類(lèi)、激素、密度效應(yīng)與條件培養(yǎng)等。 牛牛文庫(kù)文檔分享 選擇花藥時(shí)，一般通過(guò)鏡檢來(lái)確定其中的花粉是否處于適宜的發(fā)育期。 最常用的方法有醋酸洋紅法。但是，某些植物的花粉細(xì)胞核不易著色，

13、需采用焙花青-鉻礬法，這種方法能將花粉細(xì)胞核染成藍(lán)黑色?；ㄋ幣囵B(yǎng) 牛牛文庫(kù)文檔分享p花藥預(yù)處理花藥預(yù)處理 大量試驗(yàn)結(jié)果表明，花藥培養(yǎng)前給予一定的低溫處理是十分必要的?；ㄋ幣囵B(yǎng) 牛牛文庫(kù)文檔分享q 花藥培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基：花藥培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基： N6：高硝態(tài)氮，低銨態(tài)氮，廣泛用于禾本科植物的花藥培養(yǎng)：高硝態(tài)氮，低銨態(tài)氮，廣泛用于禾本科植物的花藥培養(yǎng) B5、MS、White、Nitch 等。等。 C17（王培等，（王培等，1986）：適于小麥花藥培養(yǎng)，提高）：適于小麥花藥培養(yǎng)，提高 出愈率。出愈率。激素激素：相對(duì)較低的激素水平：相對(duì)較低的激素水平蔗糖蔗糖：一般：一般2-3%，高濃度對(duì)禾谷類(lèi)較

14、有利，高濃度對(duì)禾谷類(lèi)較有利 番茄花藥培養(yǎng)對(duì)蔗糖濃度的誘導(dǎo)反應(yīng)蔗糖濃度 2 3 4 6 10 13 17誘導(dǎo)頻率 5 10 12 18 25 45 8q培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件溫度和光照：溫度和光照： 牛牛文庫(kù)文檔分享 花藥培養(yǎng)的意義花藥培養(yǎng)的意義1.同常規(guī)的育種方法相比，利用花藥培養(yǎng)可以大大縮短育種年限。2.利用花藥培養(yǎng)的單倍體育種較常規(guī)育種便于根據(jù)表現(xiàn)型進(jìn)行選擇。3. 單倍體加倍的純度，較常規(guī)的自交選育出來(lái)的自交系純度要高的多。 4.對(duì)于自交不親和的物種可以獲得雜交種子。5.在遠(yuǎn)源雜交方面具有較大的利用價(jià)值?；ㄋ幣囵B(yǎng) 牛牛文庫(kù)文檔分享花粉培養(yǎng) 花粉培養(yǎng)：花粉培養(yǎng)：把花粉從花藥中分離出來(lái)，以單個(gè)花粉粒

15、作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù) 由于花粉已是單倍體細(xì)胞，誘發(fā)它經(jīng)愈傷組織或胚狀體發(fā)育成的植株都是單倍體植株。且不受花藥的藥隔，藥壁、花絲等體細(xì)胞的干擾。但缺點(diǎn)是比花粉培養(yǎng)難度大。 牛牛文庫(kù)文檔分享 1、取材時(shí)期：四分體時(shí)期到單核早期。 2、花粉的分離： 3、小孢子純化： 對(duì)獲得的小孢子混合物進(jìn)行分級(jí)過(guò)篩、梯度離心處理純化小孢子 4、花粉的培養(yǎng)花粉培養(yǎng)花粉培養(yǎng)技術(shù)花粉培養(yǎng)技術(shù) 牛牛文庫(kù)文檔分享材料的準(zhǔn)備：材料的準(zhǔn)備：1）自然散落法(漂浮培養(yǎng)自然釋放法) ： 將花藥接種在預(yù)處理液或液體培養(yǎng)基上，待花粉自動(dòng)散落后，收集培養(yǎng)。2）機(jī)械游離法 a.磁攪拌法：用磁力攪拌器低速攪拌培養(yǎng)液中的花藥，使花粉游離出

16、來(lái)； b.擠壓法：在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養(yǎng)?；ǚ叟囵B(yǎng) 牛牛文庫(kù)文檔分享花粉培養(yǎng)方法花粉培養(yǎng)方法 1、平板培養(yǎng)：花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。 2、液體培養(yǎng)： 花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣。 3、雙層培養(yǎng)：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基（加入失活花藥的浸提液），凝固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。 4、看護(hù)培養(yǎng)：利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質(zhì)促進(jìn)花粉小孢子發(fā)育。 5、微室培養(yǎng)：利用小的蓋玻片和凹穴載玻片形成微室進(jìn)行花粉培養(yǎng)。 牛牛文庫(kù)文檔分享看護(hù)培養(yǎng)圖解 牛牛文庫(kù)文檔分享1、胚狀體發(fā)育途徑：小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生的各個(gè)階段，最后子葉展開(kāi)，形成花粉植株?；ǚ壑仓甑男螒B(tài)

17、發(fā)生方式煙草花藥培養(yǎng)煙草花藥培養(yǎng)通過(guò)胚狀體途徑再生形成小植株通過(guò)胚狀體途徑再生形成小植株花粉培養(yǎng) 牛牛文庫(kù)文檔分享1、胚狀體發(fā)育途徑：小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生的各個(gè)階段，最后子葉展開(kāi)，形成花粉植株。2、愈傷組織發(fā)育途徑：小孢子分裂數(shù)次形成愈傷，再分化形成花粉植株。此途徑產(chǎn)生的植株會(huì)出現(xiàn)變異且倍性復(fù)雜。四、花粉植株的形態(tài)發(fā)生方式花粉培養(yǎng) 牛牛文庫(kù)文檔分享 牛牛文庫(kù)文檔分享愈傷組織轉(zhuǎn)接種到再生培養(yǎng)基愈傷組織分化形成再生植株部分花藥產(chǎn)生愈傷組織接種在平板上的水稻花藥水稻花藥培養(yǎng)的愈傷化發(fā)生途徑 牛牛文庫(kù)文檔分享花粉單倍體植物的培養(yǎng)程序及其技術(shù)關(guān)鍵 牛牛文庫(kù)文檔分享 牛牛文庫(kù)文檔分享 牛牛文庫(kù)文檔分享花藥和花

18、粉培養(yǎng)中的白化苗花藥和花粉培養(yǎng)中的白化苗 牛牛文庫(kù)文檔分享影響白化苗形成的因素影響白化苗形成的因素 花粉發(fā)育時(shí)期：花藥培養(yǎng)中，白花苗的比例隨接種時(shí)花粉發(fā)育時(shí)期的延遲而提高。培養(yǎng)基成分：高濃度的2,4-D會(huì)使花粉愈傷組織分化出更多的白化苗培養(yǎng)溫度：當(dāng)培養(yǎng)溫度提高時(shí)，白花苗的數(shù)目也隨之增加?；ㄋ幒突ǚ叟囵B(yǎng) 牛牛文庫(kù)文檔分享1 1、花粉單倍體植株鑒定的理由、花粉單倍體植株鑒定的理由 1) 1) 體細(xì)胞干擾體細(xì)胞干擾 2) 2) 生殖細(xì)胞的自發(fā)加倍生殖細(xì)胞的自發(fā)加倍三、單倍體植株的鑒定和二倍化方法三、單倍體植株的鑒定和二倍化方法 牛牛文庫(kù)文檔分享2、花粉植株的鑒定方法、花粉植株的鑒定方法 1)形態(tài)鑒定

19、形態(tài)鑒定 2)細(xì)胞學(xué)鑒定細(xì)胞學(xué)鑒定 3)雜交法鑒定雜交法鑒定 4)分子標(biāo)記鑒定分子標(biāo)記鑒定 牛牛文庫(kù)文檔分享 花粉粒著色鑒定原理花粉粒著色鑒定原理：凡有活力的種胚在呼吸作用過(guò)程中都有氧化還原反應(yīng) , 而無(wú)活力的種胚則無(wú)此反應(yīng)。當(dāng) TTC (2，3，5-氯化或溴化三苯基四氮唑簡(jiǎn)稱四唑)溶液滲入種胚的活細(xì)胞內(nèi) , 并作為氫受體被脫氫輔酶上的氫還原時(shí) , 便由無(wú)色的 TTC 變?yōu)榧t色的三苯基甲 (TTF) ，從而使種胚著色。當(dāng)種胚生活力下降時(shí) , 呼吸作用明顯減弱 , 脫氫酶的活性亦大大下降 , 胚的顏色變化不明顯 , 故可由染色的程度推知種子生活力強(qiáng)弱。 牛牛文庫(kù)文檔分享單倍體植株如何加倍單倍體植

20、株如何加倍 自然加倍（花粉植株并不象預(yù)期都是單倍體） 人工誘導(dǎo)加倍（如：秋水仙素處理） 從愈傷組織再生二倍體植株 （單倍體植株再組培，誘導(dǎo)形成愈傷組織，經(jīng)繼代培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)化到分化培養(yǎng)基上，由此獲得的再生植株，將會(huì)有染色體加倍的植株） 牛牛文庫(kù)文檔分享草莓花藥愈傷組織草莓花藥再生植株草莓花藥植株（染色體加倍） 牛牛文庫(kù)文檔分享 胚 胚乳 胚珠 子房B、未受精的子房和卵細(xì)胞培養(yǎng) 牛牛文庫(kù)文檔分享 由未授粉子房培養(yǎng)產(chǎn)生的單倍體植株來(lái)源和發(fā)育途徑多種多樣B、未受精的子房和卵細(xì)胞培養(yǎng) 有助細(xì)胞或胚囊的無(wú)配子生殖產(chǎn)生單倍體 卵細(xì)胞、助細(xì)胞、反助細(xì)胞均可發(fā)育產(chǎn)生單倍體 非正常發(fā)育的大孢子四分體產(chǎn)生單倍體 牛牛

21、文庫(kù)文檔分享四、單倍體植物的用途（育種） 大大縮短育種周期 有利于遠(yuǎn)緣雜交新類(lèi)型的培育和穩(wěn)定 與誘變育種相結(jié)合可加速育種進(jìn)程 可作為外源基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng) 牛牛文庫(kù)文檔分享大大縮短育種周期 牛牛文庫(kù)文檔分享常規(guī)雜交育種法和單倍體育種法遺傳模式圖 牛牛文庫(kù)文檔分享46年如花粉培養(yǎng)僅需12年 牛牛文庫(kù)文檔分享前言前言 使用單細(xì)胞系統(tǒng)比使用完整的器官或植株有更大的優(yōu)越性。使用游離細(xì)胞系統(tǒng)時(shí)，可以讓各種化學(xué)藥品和放射性物質(zhì)很快作用于細(xì)胞，又能很快停止作用。通過(guò)單細(xì)胞克隆，可以將微生物的遺傳學(xué)技術(shù)應(yīng)用于高等植物的作物改良。五、單細(xì)胞培養(yǎng) 牛牛文庫(kù)文檔分享1、單細(xì)胞的分離單細(xì)胞的分離由完整的植物器官分離單

22、細(xì)胞由完整的植物器官分離單細(xì)胞a.機(jī)械法機(jī)械法 將植物葉片放入研缽中 加入研磨介質(zhì)輕輕研磨 勻漿用紗布過(guò)濾 在研磨介質(zhì)中低速離心 分離出具光合活性和呼吸活性的葉肉細(xì)胞。 牛牛文庫(kù)文檔分享b b、酶解法、酶解法 優(yōu)點(diǎn)：有可能得到海綿薄壁細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：有可能得到海綿薄壁細(xì)胞或柵欄薄壁細(xì)胞的純材料?；驏艡诒”诩?xì)胞的純材料。 牛牛文庫(kù)文檔分享 和酶解法相比，機(jī)械法具有的和酶解法相比，機(jī)械法具有的優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 細(xì)胞不會(huì)受到酶的傷害細(xì)胞不會(huì)受到酶的傷害 無(wú)須質(zhì)壁分離無(wú)須質(zhì)壁分離 牛牛文庫(kù)文檔分享2 2、由愈傷組織中分離單細(xì)胞、由愈傷組織中分離單細(xì)胞 方法：方法： 將易散碎未分化的愈傷組織轉(zhuǎn)入液將易散碎未分化的

23、愈傷組織轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中體培養(yǎng)基中 常溫、弱光（或黑暗常溫、弱光（或黑暗）下震蕩培養(yǎng)）下震蕩培養(yǎng) 繼代、淘汰細(xì)胞碎繼代、淘汰細(xì)胞碎片片 得到單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)。得到單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)。 牛牛文庫(kù)文檔分享震蕩培養(yǎng)中震蕩的作用震蕩培養(yǎng)中震蕩的作用: 對(duì)細(xì)胞團(tuán)施加緩和壓力對(duì)細(xì)胞團(tuán)施加緩和壓力, ,使其破碎成小細(xì)使其破碎成小細(xì)胞團(tuán)和單細(xì)胞胞團(tuán)和單細(xì)胞 使細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)在培養(yǎng)基中保持均勻分使細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)在培養(yǎng)基中保持均勻分布布 促進(jìn)培養(yǎng)基和容器內(nèi)空氣之間的氣體交換促進(jìn)培養(yǎng)基和容器內(nèi)空氣之間的氣體交換 牛牛文庫(kù)文檔分享 為了獲得充分分散的細(xì)為了獲得充分分散的細(xì)胞懸浮液，應(yīng)盡可能使胞懸浮液，應(yīng)盡可能使用易散碎的愈傷組織，用易散碎的愈傷組織，將愈傷組織在半固體培將愈傷組織在半固體培養(yǎng)基上保存養(yǎng)基上保存2 23 3個(gè)繼代個(gè)繼代周期，增加其松散性。周期，增加其松散性。 在分批培養(yǎng)中，細(xì)胞數(shù)目在分批培養(yǎng)中，細(xì)胞數(shù)目增長(zhǎng)的變化情況表現(xiàn)為一增長(zhǎng)的變化情況表現(xiàn)為一條條S S形曲線（如右圖）：形曲線（如右圖）： 牛牛文庫(kù)文檔分享 對(duì)于單細(xì)胞、低密度懸浮細(xì)胞、對(duì)于單細(xì)