酸溶蛋白和粗蛋白測定

1、.油脂的檢驗與分析粗蛋白質(zhì)的測定（凱氏半微量定氮法）1 / 4.測定原理凱氏法的基本原理是將含有蛋白質(zhì)的樣品與濃硫酸共熱使其分解，其中氮元素變成銨鹽。 再經(jīng)濃堿液作用， 放出的氨氣經(jīng)硼酸吸收后用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定硼酸溶液所吸收的氨。計算出試樣含氮量，乘以相關(guān)的蛋白質(zhì)換算系數(shù)，即得打蛋白質(zhì)的含量。消化：蛋白質(zhì)與濃硫酸混合加熱，蛋白質(zhì)被炭化分解，其中碳被氧化成二氧化碳，所含的氮則轉(zhuǎn)變成硫酸銨殘留于消化液中。有機物（含 N 、C、H 、O、 P、 S 等元素） +H2SO4CO2 (NH 4)2SO4H3PO4SO2 SO 3由于上述反應(yīng)進行的很慢， 消化需要很長時間， 加入催化劑可加速反應(yīng)。 硫酸銅

2、是備用的催化劑，硫酸鉀能提高硫酸的沸點， 常將它們混合使用， 起加速氧化、 促進有機物分解的作用。蒸餾：消化所得的硫酸銨加堿蒸餾，氨就被釋放出來。(NH 4)2SO4 2NaOH 2 NH 3· H2 O Na2SO4NH 3·H2O NH 3 H 2O生成的氨用硼酸溶液吸收。硼酸吸收氨后，指示劑顏色變化，再用鹽酸滴定，直至恢復(fù)到原來的氫離子濃度為止，鹽酸與樣品中氨是等摩爾反應(yīng)。2NH 4HBO(NH 4 )2 B 4O7 5H2 O333(NH 4)2 B 4O72 HCl 5 H2O 2NH 4Cl 4H 3 BO 3由于各種蛋白質(zhì)的含氮量通常為16左右，將含氮量乘以蛋

3、白質(zhì)系數(shù)，即為粗蛋白質(zhì)含量。試劑 濃硫酸過氧化氫水混合液 （ 23 1）。在 100mL 水中緩慢加入濃硫酸200mL ，1冷卻后加入30過氧化氫 300mL ，混勻備用，此液存放陰涼處可保存一個月。2混合催化劑。10g 硫酸銅（ Cu SO4·5H2O）、100g 硫酸鉀、 0.2g 硒粉，在研缽中研細， 通過孔徑0.45mm篩，混勻后備用。340g/100mL 氫氧化鈉溶液、 2硼酸溶液、 0.01mol/L鹽酸溶液。 甲基4紅乙醇溶液： 稱取 0.1g 甲基紅置于研缽中，加入少許95乙醇， 研磨溶解后加入75mL95乙醇。5 次甲基藍乙醇溶液：0.1g 次甲基藍溶于80mL95

4、乙醇中，臨用時將以上兩液按2：1 比例混合即成。在酸域呈紫紅色，PH5.5 時無色，在堿域呈綠色。儀器 50mL 凱氏燒瓶、 1000mL 圓底燒瓶、 100mL 錐形瓶、 5mL( 刻度 0.01mL) 微量滴定管、 50mL 容量瓶、 5mL 移液管、凱氏蒸餾裝置。2 / 4.操作方法1消化。用長條光滑紙稱取試樣0.2 0.3g，精確到0.0001g（約含粗蛋白質(zhì) 10 30mg）直接送入凱氏燒瓶底部，加混合催化劑 1g，同時加入硫酸過氧化值水混合液 3 5mL ，稍加振搖，斜置于電爐上。在通風(fēng)櫥內(nèi)加熱進行消化。開始時用低溫加熱，切勿使瓶中泡沫超過瓶肚的2/3，待泡沫減少和煙霧變白后再增加

5、溫度保持微沸。直至消化液呈淺藍綠色的透明狀時再繼續(xù)加熱沸騰10min ，取出，待消化液冷卻至室溫后，加水至10 20mL。溶液溫度降到室溫后，將消化液移入50mL 容量瓶中，并用少量水將凱氏燒瓶沖洗 3 4 次，洗滌液一并移入容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻備用。8 蒸餾。凱氏微量蒸餾裝置它是由蒸汽發(fā)生器、反應(yīng)瓶、及冷凝管等組成，在大燒瓶2（容量 1000 mL）中加入蒸餾水400mL 和少量碎玻璃片，加 5 滴混合指示劑，加幾滴酸液，使水呈紫紅色，蓋緊瓶塞，連接4、 1、 2 并檢查有無漏氣。量取30mL 2硼酸溶液，注入（100mL ）三角瓶 3 內(nèi)，作為承接器，加混合指示劑1 2 滴（溶液

6、呈紫紅色） ，置于冷凝管2 下面，使管尖端插入硼酸溶液1cm深處。用 5mL移液管吸取 5mL（ V）試樣稀釋液，由漏斗5 注入蒸餾瓶 1 內(nèi)，再倒入蒸餾水10mL沖洗漏斗5。接著量取 40g/100mL 氫氧化鈉溶液10mL，由漏斗 5 注入蒸餾瓶1 內(nèi)，再用2 5mL水沖洗漏斗 5，旋緊活塞，此時蒸餾瓶1 內(nèi)溶液總體積應(yīng)不超過容積的一半。打開電爐加熱燒瓶8，打開簧夾7，關(guān)閉活塞6，使蒸汽通過回流管 4 進入蒸餾瓶1 再由蒸餾瓶 1 經(jīng)冷凝管 2 而流入三角瓶3，待三角瓶3 內(nèi)的溶液呈綠色時， 開始記錄時間， 經(jīng) 23min 后, 將三角瓶 3放低，使冷凝管2 下端離開液面，繼續(xù)蒸餾1min

7、，然后用少量無CO2蒸餾水沖洗冷凝管 2 下端，蒸餾即告結(jié)束。蒸餾結(jié)束后，旋緊簧夾7 斷絕蒸汽。這時由于回流管4 內(nèi)蒸汽壓立即降低，所以蒸餾瓶1 內(nèi)的液體則全部吸入回流管4 內(nèi)。然后打開漏斗5 下的簧夾，注入蒸餾水40 50mL 于蒸餾瓶 1 內(nèi)，關(guān)閉漏斗5 下的簧夾，打開簧夾 7，通入蒸汽加熱洗滌蒸餾瓶1，再斷絕蒸汽，使洗滌回流至回流管4 中，打開活塞 6，將回流管4 中廢液棄去，關(guān)閉活塞6，為下次蒸汽做好準(zhǔn)備。 滴定。用 0.01mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定三角瓶3 中的吸收液至出現(xiàn)淡紫色為止。記錄3所消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（V 1）?？瞻自囼灣患釉嚇油?，消化、蒸餾、滴定操作與樣品相同。3 / 4.結(jié)果計算粗蛋白質(zhì)的干基含量按下式計算：（ V 2V 1）· c× 0.0140 × 6.25W（）× 100V m×V式中 V 2-滴定試樣時所需標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液的體積，mL ；V 1-滴定空白時所需標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液的體積，mL ；c-鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L ；m- 試樣的質(zhì)量，g；V- 試樣分解液總體積，mL ；V - 試樣分解液蒸餾用體積，mL ；0.0140-與 1.00mL 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 c（HCl） 1.000