使用imagepro-plus測(cè)量熒光強(qiáng)度

1、使用imagepro-plus測(cè)量熒光強(qiáng)度如今，使用熒光染料進(jìn)行免疫組化染色的實(shí)驗(yàn)非常普遍，熒光染料染色細(xì)胞的熒光強(qiáng)度也能反映細(xì)胞 中相關(guān)蛋白的表達(dá)強(qiáng)度，自然而然的，大家會(huì)想到是否可以通過(guò)ipp分析細(xì)胞或組織切片的熒光照片 來(lái)分析其熒光強(qiáng)度，并以此來(lái)表示相應(yīng)蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。非常令人沮喪的是，這個(gè)想法是很難實(shí)現(xiàn)的。這個(gè)網(wǎng)頁(yè)詳細(xì)說(shuō)明了理由。http:/support.mediacy.eom/a nswers/showquestio n.asp?faq=36&fldAuto=325里面的結(jié)論是：You DONT! Image Pro Plus can provide Intensity or Den

2、sity measurements for any image. However, uni ess the image acquisiti ons system is properly calibrated, those numbers may not have any useful relationship with the real world.IPP的分析結(jié)果與實(shí)際情況是有很大誤差的，這個(gè)誤差不是IPP的錯(cuò)，而是在制作樣品及拍攝照片的過(guò)程中引入的。所以在介紹使用IPP分析熒光照片的方法之前，首先得說(shuō)說(shuō)如何拍攝熒光顯微鏡照片。這可能比IPP的操作還要重要。熒光顯微鏡拍攝的樣品，是使用熒光染

3、料染色的，使用熒光顯微鏡時(shí)最重要的，是選擇合適的激發(fā)光 濾光片與熒光濾光片。正確選用濾光片能得到足夠強(qiáng)的熒光， 但一般情況下，顯微鏡不可能配齊所有 的濾光片，更何況現(xiàn)在的顯微鏡濾光片價(jià)格都很貴，只能求其次，使用波段相近的濾光片，熒光強(qiáng)度 稍低一些。粗略的選擇是： 紅色熒光染料，使用紅色截止濾光片與綠色激發(fā)濾光片 綠色熒光染料，使用綠色截止濾光片與藍(lán)色激發(fā)濾光片 藍(lán)色熒光染料，使用藍(lán)色截止濾光片與紫激發(fā)濾光片。更精細(xì)的濾光片選擇，可以參照下表：.c n/jcyxy/zxlab/docume nt/FluoDATA.xls在拍攝熒光照片時(shí)，如果要分析熒光強(qiáng)

4、度，與免疫組化照片一樣，要確保每張照片的拍攝條件完全一 致。先拿一張熒光最強(qiáng)的樣品觀察調(diào)整顯微鏡。 確定相機(jī)拍攝的曝光時(shí)間。熒光照片的曝光要注意的 事項(xiàng)有：1. 使熒光最強(qiáng)的部位不能曝光過(guò)度。判斷標(biāo)準(zhǔn)是照出的照片在最亮處不能變色。比如綠色熒光照片， 當(dāng)曝光過(guò)度時(shí)，亮處會(huì)變成黃色甚至白色，這就是曝光過(guò)度了。過(guò)度的曝光會(huì)導(dǎo)致測(cè)量數(shù)值變低。當(dāng) 確定了一個(gè)曝光時(shí)間后，就必須以這個(gè)曝光時(shí)間拍攝所有的樣品，絕不能使用自動(dòng)曝光。2. 沒(méi)有樣品的空白部位應(yīng)是純黑色。這一點(diǎn)不一定能作到。特別是組織切片，由于樣品的散射作用, 沒(méi)有熒光的部位也會(huì)顯示出一點(diǎn)熒光的顏色的。3. 熒光樣品是有熒光淬滅效應(yīng)的，當(dāng)把樣品放到

5、載物臺(tái)上后，要以最快的速度選擇視野立即拍照。 時(shí) 間越長(zhǎng)熒光越弱，其衰減速度與時(shí)間的指數(shù)相關(guān)。這就是導(dǎo)致熒光強(qiáng)度分析誤差巨大的最主要原因。4. 使用激光共聚焦顯微鏡拍攝熒光照片比普通熒光顯微鏡效果更好，能夠更有效地控制所有照片的拍攝條件保持一致。在條件可能時(shí)，盡量使用激光共聚焦顯微鏡來(lái)拍攝。5. 在拍攝細(xì)胞爬片上的細(xì)胞時(shí)，將爬片的細(xì)胞層向上，放置在載玻片上，然后再蓋上一片干凈的蓋玻 片。很多人喜歡把爬片翻過(guò)來(lái)放在載玻片上，直接在鏡下觀察，這樣并不好。爬片背面沾的培養(yǎng)液不 易擦凈，導(dǎo)致圖象不清晰。6. 許多情況下，在拍攝一張熒光照片后，還需在同一視野下拍攝一張細(xì)胞輪廓的普通光照片。 由于沒(méi) 有進(jìn)

6、行正常染色，這不容易照清楚。有個(gè)絕招管用：將顯微鏡的普通光聚光鏡往下降得很低，就能照 出較清晰的細(xì)胞輪廓照片。7. 由于熒光實(shí)際上就是單色光，所以最好使用單色冷CCD乍為拍攝相機(jī)拍攝12位或16位的灰度圖片。不過(guò)一般的顯微鏡現(xiàn)在基本都是使用彩色CCD勺。在設(shè)備可能的條件下，要拍攝12位或16位的圖像。比如Olympus的DP70相機(jī)就可以拍攝這樣的圖片，圖片文件會(huì)大一點(diǎn)，但對(duì)熒光照片的分析 是大有好處的。拍攝完圖片之后，在分析之前，還需對(duì)圖片進(jìn)行一下轉(zhuǎn)換處理 熒光圖片上，表達(dá)最強(qiáng)所對(duì)應(yīng)的是圖片上的亮處，背景則是黑色的。這與免疫組化圖片正好相反。所 以要先把熒光圖片作一個(gè)黑白反相處理。IPP 當(dāng)

7、然是可以作這件事的。其他的圖象軟件也都能作。如 果使用 IPP 來(lái) Invert contrast ，一定要記得 Invert 之后還要 apply contrast 一下，否則圖片實(shí)際 上是并沒(méi)有改變的，它只是顯示成了反相。反相后的照片另存到另一個(gè)子目錄中用于測(cè)量， 原始照片 是必須保留的。這個(gè)反相的照片可以是彩色的，也可以是黑白的。最好轉(zhuǎn)換成黑白的 下面就可以測(cè)量熒光強(qiáng)度了。甚至方法還簡(jiǎn)單一些：在選色時(shí)，只需調(diào)整背景強(qiáng)度就行了。先測(cè)量一下沒(méi)有熒光部分的灰度，比如測(cè)得背景值是 240,那就在光密度校正中選擇240作為背景，在HSI選 色中只需考慮強(qiáng)度而不必考慮色彩，選擇H：0-255、S：0

8、-255、I：0-240。如果陰性樣品的熒光非常弱，常常會(huì)導(dǎo)致測(cè)量錯(cuò)誤：圖片上大量沒(méi)有熒光的樣品區(qū)域未被計(jì)入area之中，導(dǎo)致陰性樣品的測(cè)量值偏高。此時(shí)需手動(dòng)選擇樣品區(qū)域，然后測(cè)量這個(gè)區(qū)域的IOD 與 area，這樣最后計(jì)算出來(lái)的 mean density 將是一個(gè)很小的數(shù)。面作個(gè)實(shí)例： 這三張照片，左邊一張背景偏綠，中間一張曝光適當(dāng)，右邊一張則是曝光過(guò)度了訓(xùn)be謝韁越繹二i曲開(kāi)昂血il必HB灑駁囚熒光照片上經(jīng)常會(huì)有一些明亮的雜點(diǎn)，這對(duì)于熒光強(qiáng)度的測(cè)量具有極大的干擾，它們必須被除掉。 除去它們的方法很多?？梢宰约合朕k法。這里使用選色的辦法。 在選色窗口里要使用 black on tran sp

9、are nt顯示方法，選擇上那些亮斑點(diǎn)后就自然給填上黑色了，然后點(diǎn) create preview image 按紐把圖片照下來(lái)。Elmagc_Pro Plus - unt i tlodC3b (i/1)Eflh mr r rnai?S5i rijn-r蛍 ndE (jIp00 81酉匸翳口0色倉(cāng)Q若Q園槎就戲LL旳0 S芒廠(chǎng)1 占匸中M tr rqi jrnce Util朮出污63牒靜衣隔 unt11led0351/D ILSegiiui iiMfri Btid ；C1m Clib* R*乂4 |三1祜i楨 EJiiij阿mPt卄n-CWr話(huà) t CluiI tlijek jij Itti“a

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11、ure lairo iSirxiw Hrlp4djTsy jAle 11 :t 3丫 Sc i-r : E Plaarln PbLhiEaictTs.-.KCE鄭還要作個(gè)黑白反相In vert con trast 。反相后一定要再點(diǎn)一下 apply con trast 。 補(bǔ)充：其實(shí)那個(gè)菜單最下面的invert image 就是直接反相圖片的。點(diǎn)那個(gè)就行了。先作光密度較正，如果熒光照片的背景純黑，0-255 就行。然后選擇count/size 的測(cè)量參數(shù)：測(cè)量IOD與area 這張照片的細(xì)胞照得挺大，可以把 area的過(guò)濾值選大一點(diǎn)filter start 為500,這樣就有效排除 掉了哪些小

12、的雜質(zhì)點(diǎn)。另外，還要在count/size 的option中把fill holes 選擇給勾上。fii;xi Q也 a S? o G 角Q卅lx卅* 織芽e丕型陽(yáng)4 a IL同駅觀3山唏 t H*JjuthLJ l；T Lib* L.3 1.1 ft lAri：* 廠(chǎng)tgibr燈簡(jiǎn)IV Qi Sritm ITillu* Kmltv血d.料F*r*t iur.lF u tl Cm&) ;Fw*l !)Pr 3 larift 屜i tr4(u ty 狗 TtIM,”1DIlitxr= f lbji-c- lw ht iwclqUt Lulai.* U-h-h. d 7ill khi*irp k 1

13、 o丘 !* k u EiK-fHIT5UfL AllSlaEL H3Its st ltM：x. IE1M，s|*iur MID0COWffipllwrV(dtt K&f*Dyfr：jJl對(duì)于灰度圖片，選色窗口里只有強(qiáng)度一項(xiàng)選擇，0-250就行了。當(dāng)然，這個(gè)值要根據(jù)自己照片的情況來(lái)定，原則應(yīng)是選擇上所有的細(xì)胞。M H ；H :翻口 O衛(wèi)魚(yú)蘭匕蘭Q1H IX出* 燦邛c雖心陽(yáng)功關(guān)i IL瞪事&Scgnentatioi unt i t Lcd040 (1/1)Cl 3 CJt 1ft.百 MH 11 lE-lrtkkuf-elL自25阪耳F S審 ffi 圍Frwii*r|til 1.khxai；*Cr tst* Fule