北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部攻讀碩-博士學(xué)位研究生課題研究計(jì)劃書

1、北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部攻讀士學(xué)位研究生課題研究方案書研究生 李玉霞學(xué)號(hào)1411210743年 級(jí) 2021級(jí)院部北京大學(xué)/香港科技大學(xué)醫(yī)學(xué)中央專業(yè)醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)導(dǎo)師方征宇課題研究開(kāi)始日期：2021年03月 09日北京大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)局部院培養(yǎng)辦公室制表本方案書由研究生本人在本學(xué)科內(nèi)作過(guò)開(kāi)題報(bào)告后填 寫,一式三份；經(jīng)院部主管部門批準(zhǔn)后一份留教研室, 一份留院部主管部門,一份送研究生院醫(yī)學(xué)局部院 培養(yǎng)辦公室備案.方案批準(zhǔn)后不得隨意更改.如有特殊情況確需變更者, 需填寫變更報(bào)告,逐級(jí)審批.研究課題名稱黑色素瘤順鉗獲得性耐藥相關(guān)microRNA篩選及其功能的研究研究課題的目的、理論與實(shí)際意義、國(guó)內(nèi)外

2、研究情況簡(jiǎn)介課題的目的：1、構(gòu)建黑色素瘤順鉗獲得性耐藥細(xì)胞株,與其原始株進(jìn)行microRNA的高通量篩選比擬,找到耐藥相關(guān)的microRNA,作為潛在的治療靶點(diǎn).2、分析耐藥相關(guān)microRNA通過(guò)調(diào)控哪些基因的表達(dá)來(lái)影響黑色素瘤細(xì)胞的耐藥性,說(shuō)明其分子機(jī)制.理論與實(shí)際意義：近幾十年來(lái),惡性黑色素瘤在全球的發(fā)病率迅猛升高,成為所有惡性腫瘤中發(fā)病率增長(zhǎng)最快的腫瘤,年增長(zhǎng)率幾乎到達(dá) 3-5%.其中白色人種發(fā)病率明顯高于其他人種,我國(guó)和日本等亞洲國(guó)家的黑色素瘤發(fā)病率與歐美國(guó)家相比相對(duì)較低,但近年來(lái)其發(fā)病率呈迅猛上升趨勢(shì).惡性黑色素瘤治療方法主要有手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)藥物治療及生物免疫治療等.化療

3、在惡性黑色素瘤治療中仍占有重要地位.目前化療藥物主要有順鉗、長(zhǎng)春新堿和組蛋 白去乙酰化酶抑制劑等.順鉗是現(xiàn)在臨床上多種化療方案中的主要藥物之一,通過(guò)與癌細(xì)胞的脫氧核糖核酸發(fā)生交叉聯(lián)結(jié),誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡而起抗癌作用屬細(xì)胞增殖周期非特異性藥物,但是多種惡性黑色素瘤常會(huì)對(duì)順鉗產(chǎn)生天然或獲得性耐藥,因而提升順鉗的抗腫瘤作用,解決順鉗耐藥在惡性黑色素瘤的化療中有著重要的實(shí)際意義.順鉗耐藥機(jī)制,主要包括細(xì)胞內(nèi)藥物積累的減少,DNA損傷修復(fù)作用增強(qiáng),凋亡通路的變化以及一些microRNA的異常表達(dá).由于microRNA的表達(dá)易于調(diào)控,如果能找到黑色素瘤中與耐藥相關(guān)的microRNA,可建立以此為靶點(diǎn)的干預(yù)

4、手段.國(guó)內(nèi)外研究情況簡(jiǎn)介：在其他腫瘤細(xì)胞中,已經(jīng)有人驗(yàn)證出一些microRNA的變化會(huì)影響腫瘤對(duì)順鉗的敏感性,而目前關(guān)于 microRNA在黑色素瘤順鉗獲得性耐藥機(jī)制中的作用研究較少.主要研究?jī)?nèi)容研究?jī)?nèi)容1:構(gòu)建黑色素瘤順鉗耐藥株選取了七種黑色素瘤細(xì)胞系 M7、M21、SK-MEL-103 M29、A375、M8、SK-MEL-19依 次檢測(cè)對(duì)順鉗的敏感性,在對(duì)順鉗比擬耐受的細(xì)胞株中選取了 A375、M8、SK-MEL-19構(gòu)建了順 鉗耐藥株并將 A375、M8做了 microRNA的表達(dá)譜芯片.研究?jī)?nèi)容2：黑色素瘤順鉗耐藥株與原始株microRNA芯片分析及驗(yàn)證通過(guò)分析 microRNA表達(dá)

5、譜芯片,對(duì)黑色素瘤順鉗耐藥株中異常表達(dá)的microRNA用熒光定量PCR®行驗(yàn)證,確定要研究的microRNA.研究?jī)?nèi)容3:順鉗耐藥相關(guān)基因反向篩選預(yù)測(cè)microRNA查閱文獻(xiàn),匯總順鉗耐藥相關(guān)基因,在黑色素瘤順鉗耐藥株與原始株中用熒光定量PCR驗(yàn)證,根據(jù)耐藥基因的變化反向預(yù)測(cè)microRNA.研究?jī)?nèi)容4： microRNA對(duì)黑色素瘤順鉗耐藥的影響及其分子機(jī)制根據(jù)microRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)找到靶基因,進(jìn)一步研究microRNA對(duì)順鉗黑色素瘤耐藥的影響及其分子機(jī)制.主要研究方法1、構(gòu)建黑色素瘤順鉗耐藥株MTS法檢測(cè)藥物敏感性以及順鉗耐藥株的耐藥指數(shù).2、黑色素瘤順鉗耐藥株與原始株

6、microRNA芯片分析及驗(yàn)證Real-time PCR驗(yàn)證 microRNA 芯片結(jié)果.3、順鉗耐藥相關(guān)基因反向篩選預(yù)測(cè)microRNAReal-time PCR驗(yàn)證順鉗耐藥相關(guān)基因,microRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果.4、microRNA對(duì)黑色素瘤順鉗耐藥的影響及其分子機(jī)制Dual-Luciferase Reporter驗(yàn)證microRNA與靶基因的關(guān)系,慢病毒構(gòu)建靶基因相關(guān)穩(wěn)轉(zhuǎn)株, Western Blotting驗(yàn)證靶基因相關(guān)蛋白的變化.研究進(jìn)度及具體安排2021年3月-2021年8月進(jìn)度：黑色素瘤順鉗耐藥株構(gòu)建2021年9月-2021年12月進(jìn)度：microRNA芯片分析及驗(yàn)證

7、,順鉗耐藥相關(guān)基因的篩選2021年1月-2021年10月安排：microRNA對(duì)黑色素瘤順鉗耐藥的影響及其分子機(jī)制的研究預(yù)期結(jié)果1、通過(guò)microRNA芯片找到與黑色素瘤順鉗耐藥相關(guān)的microRNA2、通過(guò)microRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)找到microRNA的靶基因3、microRNA的靶基因通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)蛋白對(duì)順鉗耐藥有作用,通過(guò)敲除或者過(guò)表達(dá)該基因可以逆轉(zhuǎn)黑色素瘤順箱獲得性耐藥.協(xié)助導(dǎo)師具體指導(dǎo)的人員配備周游博士后、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)員黎滿慧、試劑采購(gòu)技術(shù)員董小林完 成 課 題 的 條 件主要儀器設(shè)備情況Bio-Rad PCR儀、Bio-Rad Rael-time PCR儀、Bio-Rad 酶標(biāo)儀、Bio-Rad 蛋白電泳儀、 Eppendorf離心機(jī)、Stuart渦旋振蕩器、Wise Therm干浴鍋、超凈臺(tái)、顯微鏡、-20C 冰箱等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物情況沒(méi)有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)藥物試劑等來(lái)源情況DMEM(GIBCO)、 PBS(Invitrogen) 、 Tyrisin(GIBCO)、 MTS(Promega)、 Lipofection2000(Promega) 、 RT kit(Promega)、 Real-time supe