南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞工程期末重點總結(jié)

1、南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞工程期末重點一.名詞解釋發(fā)育阻滯：體外受精的早期胚胎在體外發(fā)育過程中,往往會停滯在某一階段不再發(fā)育,此現(xiàn)象稱為發(fā)育阻滯.胚胎移植：也稱受精卵移植、借腹懷胎,是指將良種母畜配種后,從其生殖道內(nèi)取出受精卵后早期 胚胎,移植到同種的、生理狀態(tài)相同的母畜體內(nèi),使之繼續(xù)發(fā)育稱為新個體的技術(shù).組織工程：指應(yīng)用工程學(xué)和生命科學(xué)的原理和方法來研究開發(fā)用于修復(fù)或改善人體病損組織或器官的結(jié)構(gòu)、功能的生物活性替代物的一門科學(xué).人一鼠嵌合抗體：就是用人源性抗體的一局部代替鼠源性抗體的一局部,使之保存對抗原的特異性, 又具備與補(bǔ)體和細(xì)胞結(jié)合的功能,并減少異源性蛋白的抗原性.細(xì)胞融合：在離體條

2、件下,用人工方法將不同基因型的單細(xì)胞通過無性方式融合成一個雜合細(xì)胞的 過程.ES細(xì)胞：即胚胎干細(xì)胞,將細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞別離出來進(jìn)行培養(yǎng),在一定條件下這些細(xì)胞可在體外 “無限期地增值傳代,同時還保存其全能性的細(xì)胞.乳腺生物反響器：利用哺乳動物乳腺特異性表達(dá)的啟動子元件構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物,指導(dǎo)外源基因在乳腺中表達(dá),并從轉(zhuǎn)基因動物的乳液中獲得重組蛋白.細(xì)胞全能性：指細(xì)胞分裂分化后,仍具有形成完整有機(jī)體的潛能或特性.Ips 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞：利用病毒載體將四個轉(zhuǎn)錄因子Oct4,Sox2, Klf4,c-Myc 的組合轉(zhuǎn)入分化的體細(xì)胞中,使其重編程而得到的類似胚胎干細(xì)胞的一種細(xì)胞類型.胚胎分割：將一枚胚胎用顯微

3、手術(shù)的方法分割為二分、四分甚至八分胚,經(jīng)體內(nèi)或體外培養(yǎng),然后移植入受體中,以得到同卵雙生或同卵多生后代的技術(shù)核移植：利用顯微操作技術(shù),將某一特定細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移和嵌入另一細(xì)胞中的過程細(xì)胞系、細(xì)胞株：細(xì)胞系是由原代培養(yǎng)經(jīng)初步純化.獲得的以一種細(xì)胞為主的、能在體外長期生存的不均一的細(xì)胞群體.細(xì)胞系經(jīng)過進(jìn)一步的克隆化,便得到由單一細(xì)胞組成的細(xì)胞株.二、問做題1 .如何鑒定轉(zhuǎn)基因動物 1 .分子雜交Southern印跡雜交技術(shù)是通過探針和已結(jié)合于硝酸纖維素膜或尼龍膜上的經(jīng)酶切、電泳別離的變性 DNA鏈雜交,檢測樣品中是否存在目的DNA序列的方法.該法不僅靈敏而且準(zhǔn)確,因而廣泛用于轉(zhuǎn)基因陽性鼠的篩選和鑒定.

4、當(dāng)轉(zhuǎn)入基因與內(nèi)源基因組DNAT較高同源性時,仍可用此法 .,此法對樣品的質(zhì)量和純度要求較高,操作煩瑣 ,費用也較高.2 .斑點雜交通過直接將變性的待測 DNA樣品點在尼龍膜(或硝酸纖維素膜)等固體支持物上,然后 和探針雜交,從而檢測樣品中是否存在目的DNA序列.根據(jù)點樣方式一和樣品點的形狀不同可分為斑點雜交、狹縫雜交( slot blot hybridization) 、打點雜交(spot blot hybridization ).當(dāng)目的基因與內(nèi)源基因組 DNA無同源性時可用它,為防止假陰性 , 可 同時用質(zhì)粒DNA (110Pg ) 作陽性對照.該方法在分析基因組DNA時,對樣品純度要求 低

5、、快速、簡便、經(jīng)濟(jì)、靈敏度高(能從2ag5 ag的基因組DNA中檢出單拷貝基因),尤其對大批子代動物的粗篩頗具優(yōu)越性,應(yīng)作為首選方法.但該方法易出現(xiàn)假陽性.3 .PCRPCR技術(shù)是DNA體外擴(kuò)增技術(shù),根本原理同體內(nèi)DNA的復(fù)制一樣,均需經(jīng)過 DNA模板 解鏈、引物、結(jié)合及模板指導(dǎo)下的鏈延伸三個過程,在PCR反響中是靠溫度的調(diào)整和聚合酶的共同作用完成的.假設(shè)PCR體系中有一對方向相對的引物,通過反復(fù)重復(fù)變性、復(fù)性、延伸過程,那么在短時內(nèi)可將兩引物間模板擴(kuò)增至百萬倍.由于PCR所需樣品少,靈敏度高而且操作簡便因而逐漸用于轉(zhuǎn)基因動物外源基因整合、表達(dá)的檢測.可極大提 高轉(zhuǎn)基因效率,減少人力物力的浪費

6、.但該尤其在大型轉(zhuǎn)基因動物研究中,用PCR先對著床前的月5胎篩選,再將已證實攜帶外源基因的胚胎植入母體,方法要求待分析的基因組DNA樣品應(yīng)盡可能純化,否那么會干擾本反響,降低檢測的靈敏度和重復(fù)性 ；此外用 于大批量檢測時,費用較昂貴.4 .原位雜交染色體原位雜交是確定轉(zhuǎn)基因在染色體上確切位置的重要手段,其原理是利用堿基互 補(bǔ)的原那么,以放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記的DNA片段作探針,與染色體標(biāo)本上的基因組DNA在 原位"進(jìn)行雜交,經(jīng)放射自顯影或非放射性檢測體系在顯微鏡下直接 觀察出目的DNA片段在染色體上的位置.最早同位素標(biāo)記多采用放射性較低的3H、35S、及125I ,它們具有

7、定位精確的優(yōu)點 ,但放射自顯影時間長而且操作較麻煩,隨著熒光顯微鏡技術(shù)的開展,尤其是計算機(jī)圖像處理系統(tǒng)的應(yīng)用,增強(qiáng)了對熒光信號的分辨率,促進(jìn)了非同位素在染色體原位雜交中的應(yīng)用.2 .細(xì)胞同步化培養(yǎng)有哪些方法根本作用原理分別是什么1 .選擇細(xì)胞同步化1) M期細(xì)胞震碎搖落法 處在有絲分裂期的細(xì)胞形狀變圓,單層貼壁生長的細(xì)胞的附著性降低,搖動或拍打 培養(yǎng)瓶很容易使這些細(xì)胞脫落.2)離心洗脫法 細(xì)胞在進(jìn)行分裂時,細(xì)胞體積呈線性增加,利用洗脫離心機(jī)可以將體積大小不同的處于不同時期的別離開來.3)梯度沉降法 利用含血清或蔗糖的梯度溶液可以將體積不同、處于不同分裂時期的細(xì)胞別離開來2 .誘導(dǎo)細(xì)胞同步化1)

8、血清饑餓法 將血清濃度降到一定限度,使細(xì)胞僅能存活而不能分裂,可以獲得大量處于G1期的細(xì)胞.2)異亮氨酸營養(yǎng)缺乏法 培養(yǎng)基中缺乏異亮氨酸,細(xì)胞將被阻止到G1期3) DNA合成抑制阻斷法DNA合成抑制劑均能將細(xì)胞阻止在S期4秋水仙素阻斷法利用秋水仙素抑制紡錘絲的形成,可以使細(xì)胞分裂停止在有絲分裂中期3 .簡述ES細(xì)胞建系的主要操作步驟1 .ES細(xì)胞的別離從著床前孕35天的胚泡中別離內(nèi)細(xì)胞群ICM 細(xì)胞.別離方法主要有：1免疫學(xué)方法2免疫外科學(xué)方法3組織培養(yǎng)法4顯微外科學(xué)方法2.ES細(xì)胞的別離培養(yǎng)a.飼養(yǎng)層的制備及分化抑制物的選擇小鼠成纖維細(xì)胞無限系STO小鼠原始胚胎成纖維細(xì)胞PMEF常用的飼養(yǎng)層

9、是由小鼠成纖維細(xì)胞無限系STO或小鼠原始胚胎成纖維細(xì)胞 PMEF制備而成.STO和PMEF細(xì)胞可以分泌成纖維細(xì)胞生長因子FGF、分化抑制因子 LIF ,這些因子有助于 ES細(xì)胞增殖,而且能抑制細(xì)胞的凋亡和分化.也可用綿羊、山羊的輸卵管 或子宮上皮、牛的顆粒細(xì)胞、子宮成纖維細(xì)胞等作為分化抑制培養(yǎng)基bo.早期胚胎及PGC的培養(yǎng)和ES細(xì)胞的別離傳代將別離得到的早期胚胎或 PGC置于飼養(yǎng)層或條件培養(yǎng)基上,在 5%CO2、3739° C條件 下進(jìn)行培養(yǎng).傳代時一般用胰酶 EDTA消化,用吸管將其寸T散成單個細(xì)胞,然后移入新的飼養(yǎng)層上,培養(yǎng)幾天后可出現(xiàn)新的克隆點,在其分化之前可再進(jìn)行傳代.4 .

10、單克隆抗體和多克隆抗體的區(qū)別是什么應(yīng)用上有何不同區(qū)別：單克隆抗體是由一個抗原決定簇刺激機(jī)體,由一個B淋巴細(xì)胞接受該抗原所產(chǎn)生的抗體.多克隆抗體是由多種抗原決定簇刺激機(jī)體,相應(yīng)地就產(chǎn)生各種各樣 的單克隆抗體,這些單克隆抗體混雜在一起就是多克隆抗體.應(yīng)用：單抗特異性高,而且一旦制備成功就可以永續(xù)生產(chǎn)完全一致的抗體,能廣泛那地用于多種應(yīng)用比方用作診斷試劑、純化抗,腫瘤的治療等,并且完全保證抗原的一致性.多抗在特異性上無法與單抗相比較.但多抗的靈敏度比較高.5 .細(xì)胞培養(yǎng)過程中,支原體污染的危害及鑒定危害：支原體污染細(xì)胞后,能抑制細(xì)胞代謝和生長, 改變核酸合成,影響細(xì)胞的抗原性, 引起細(xì)胞染色體改變,

11、具有類病毒作用.在細(xì)胞培養(yǎng)初期,由于支原體對細(xì)胞的繁殖影響較小而往往被忽略.鑒定：1熒光技術(shù)檢測支原體含有DNA,能與一種熒光染料 Hoechest 33258特異性結(jié)合,可根據(jù) 細(xì)胞外表的熒光,來顯示細(xì)胞是否被支原體污染.2支原體培養(yǎng)法3 DNA分子雜交危害：支原體污染后,因它們往往無致死細(xì)胞病毒而可與細(xì)胞長期共存,培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁,細(xì)胞無明顯變化,外觀上往往給人以“正常的感覺,實那么細(xì)胞能受到多方面的潛在影響, 如引起細(xì)胞變形、影響 DNA合成、抑制細(xì)胞生長等.鑒定：相差顯微鏡檢測法、 DNA熒光處理法、電鏡檢測法、低張?zhí)幚淼匾录t染色觀察、免疫學(xué)方法、3H一胸腺嗑咤摻入、支原體培養(yǎng)法及

12、 PCR法等.6 .克隆羊“多利成功的意義1 .證實一個已經(jīng)完全分化的動物體細(xì)胞仍然保持著胚胎細(xì)胞的全部遺傳信息2 .可以根據(jù)人的意志趣改造、生產(chǎn)物種3 .利用克隆技術(shù)復(fù)制哺乳動物的技術(shù)障礙已經(jīng)被突破,在理論上已經(jīng)成為可能解決了使核供體細(xì)胞與核受體細(xì)胞同步的方法 ,解決了用體細(xì)胞做核供體與轉(zhuǎn)基因的問題7 .簡述Cre2/loxP系統(tǒng)作用原理及應(yīng)用原理:Cre重組酶能識別34bp的特異序列l(wèi)oxP ,介導(dǎo)兩個loxP之間的序列發(fā)生重組, 從而將兩個loxP位點之間的序列刪除.此過程不需要任何其他輔助因子的幫助 .loxP 的位置和方向不同,Cre重組酶介導(dǎo)重組形成的產(chǎn)物亦不同 ,可以導(dǎo)致染色體的

13、倒位、刪除和 易位,實現(xiàn)染色體的定點操作,克服了用放射線誘導(dǎo)產(chǎn)生的突變不能定位的缺點應(yīng)用：建立疾病動物模型來模擬人類的某些疾病,可以用來研究腫瘤抑制基因的識別和疾病的治療診斷8 .HAT選擇原理正常及普通癌細(xì)胞不但具有利用培養(yǎng)液中的谷氨酰胺和尿核甘單磷酸合成DNA的能力,而且當(dāng)這條主要途徑被氨基喋吟 A阻斷時,還具有利用培養(yǎng)液中現(xiàn)成的次黃喋 吟H和胸腺喀咤脫氧核甘T在次黃喋吟鳥喋吟磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶HGPRT的作用下,借此應(yīng)急通路來合成DNA的水平.9 .簡述臍帶血移植的優(yōu)缺點 優(yōu)點：1 .純潔：較少受到放射線、病毒、藥物污染2 .再生力強(qiáng)：干細(xì)胞生命力、分化水平強(qiáng)3 .及時性：許多疾病治療時效相

14、當(dāng)重要,解凍馬上可用4 .來源容易：臍帶血容易取得,不傷嬰兒及母體5 .低排斥性：移植物抗宿主疾病程度較輕6 .組織相容性大：HLA相容之要求比骨髓、外周血干細(xì)胞低 缺點：1 .一單位臍血所含的干細(xì)胞數(shù)目缺乏,對一位成人體重而言,有些人是不夠用的2 .植入后恢復(fù)時間長,感染風(fēng)險高,隔離住院期間長3 .HLA相容性要求雖不高,但慢性移植物抗宿主疾病仍會發(fā)生.雖急性病減少很多,但是免疫耐受性仍要克服.4 .一般移植以非親屬間的移植為主流,然而受限于臍帶血庫的成立相當(dāng)昂貴,HLA相容性也要求到 DNA水平.手足間的移植靠機(jī)運,而自體移植的幾率更小,目 前世界上尚無足夠的臍帶血自體移植之資料或經(jīng)驗可供

15、參考.10.細(xì)胞培養(yǎng)過程中,常用的消化液有哪些培養(yǎng)所需的動物血清作用是什么 細(xì)胞消化液：1胰蛋白酶溶液2） EDTA-Na 溶液3膠原酶溶液4其他：鏈霉蛋白酶,骨膠原酶,透明質(zhì)酸酶動物血清作用：1提供根本營養(yǎng)物質(zhì)2提供貼壁和擴(kuò)展因子3提供激素和各種生長因子4提供結(jié)合蛋白5對培養(yǎng)基中的細(xì)胞提供某些保護(hù)作用11 .簡述單克隆抗體的制備過程及其主要原理 制備過程：1 .致敏淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備2 .骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備3 .飼養(yǎng)層細(xì)胞的準(zhǔn)備4 .細(xì)胞融合5 .選擇性培養(yǎng)6 .特異性抗體的檢測7 .雜交瘤細(xì)胞的克隆化8 .雜交瘤細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇9 .單克隆抗體的大量制備10 .單克隆抗體的純化主要原理：要制備單

16、克隆抗體需先獲得能合成專一性抗體的單克隆B淋巴細(xì)胞,但這種 B淋巴細(xì)胞不能在體外生長.而實驗發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞可在體外生長繁殖,應(yīng)用細(xì)胞雜交技術(shù)使 骨髓瘤細(xì)胞與免疫的淋巴細(xì)胞二者合二為一,得到雜種的骨髓瘤細(xì)胞.這種雜種細(xì)胞繼承兩種親代細(xì)胞的特性,它既具有B淋巴細(xì)胞合成專一抗體的特性,也有骨髓瘤細(xì)胞能在體外培養(yǎng)增殖永存的特性,用這種來源于單個融合細(xì)胞培養(yǎng)增殖的細(xì)胞群,可制備抗一種抗原決定簇的特異單克隆抗體12 .為何要對鼠源性抗體進(jìn)行改造使之人源化鼠源性單克隆抗體的局限性：1 .應(yīng)用后很快就會被消除出人的循環(huán)系統(tǒng)2 .鼠源性抗體一般無法有效地激發(fā)宿主的免疫防衛(wèi)系統(tǒng)3 .大多數(shù)情況下,還會引發(fā)人對于鼠

17、源性抗體本身的免疫反響,即人的抗鼠反響 人源化后,使人的抗鼠反響大大降低,更好地運用到疾病的治療13 .簡述X、Y精子的常用別離方法及其原理1沉降法X、Y精子在體積和質(zhì)量上相差很大2離心沉降法X精子的DNA含量高于Y精子,導(dǎo)致X精子的密度及重量大于 Y精子,在離心時X精子的沉降速度快于 Y精子3電泳法依據(jù)X、Y精子外表膜電荷的不同,通過電泳時X、Y精子在電場中向不同電極移動而到達(dá)別離的目的4免疫學(xué)別離法利用H-Y抗體檢測精子質(zhì)膜上存在的 H-Y抗原,以此來別離 X精子,Y精 子5流式細(xì)胞別離法根據(jù)X、Y精子上DNA含量的微小差異,通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行別離.6化學(xué)藥品處理法根據(jù)X、Y精子嗜酸堿性不同,通過使用化學(xué)試劑預(yù)先處理陰道,改變生殖道的pH,從而到達(dá)選擇性利用精子限制動物性別