增強(qiáng)免疫力功能評(píng)價(jià)方法及修訂說明

1、附件1:增強(qiáng)免疫力功能評(píng)價(jià)方法征求意見稿保健食品評(píng)價(jià)試驗(yàn)工程、試驗(yàn)原那么及結(jié)果判定Items, Principles and Result Assessment1試驗(yàn)工程動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.1.1 體重1.1.2 臟器/體重比值測(cè)定：胸腺/體重比值,脾臟/體重比值1.1.3 細(xì)胞免疫功能測(cè)定：小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),遲發(fā)型變態(tài)反響實(shí)驗(yàn)1.1.4 體液免疫功能測(cè)定：抗體生成細(xì)胞檢測(cè),血清溶血素測(cè)定1.1.5 單核一巨噬細(xì)胞功能測(cè)定：小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn),小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球?qū)嶒?yàn)1.1.6 NK細(xì)胞活性測(cè)定2試驗(yàn)原那么所列的指標(biāo)均為必做工程分為正常動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案和免疫功能低下模型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)兩種方案,可任選其

2、一進(jìn)行實(shí)驗(yàn).采用免疫功能低下動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)方案時(shí)需做外周血白細(xì)胞總數(shù)測(cè)定3結(jié)果判定采用正常動(dòng)物實(shí)驗(yàn),受試樣品具有增強(qiáng)免疫力作用.在細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能及NK細(xì)胞活性四個(gè)方面測(cè)定中,任兩個(gè)方面試驗(yàn)結(jié)果為陽性,可以判定該受試樣品具有增強(qiáng)免疫力 作用.其中細(xì)胞免疫功能測(cè)定工程中兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陽性, 判定細(xì)胞免疫功能 試驗(yàn)結(jié)果陽性.體液免疫功能測(cè)定工程中兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陽性, 判定體液免 疫功能試驗(yàn)結(jié)果陽性.單核一巨噬細(xì)胞功能測(cè)定工程中兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陽性,判定單核一巨噬細(xì)胞功能試驗(yàn)結(jié)果陽性.NK細(xì)胞活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)的一個(gè)以上劑量結(jié)果陽性,判定NK細(xì)胞活性結(jié)果陽性.正常動(dòng)物

3、實(shí)驗(yàn)需進(jìn)行四個(gè)方面的測(cè)定.采用免疫功能低下動(dòng)物實(shí)驗(yàn),受試樣品對(duì)免疫功能低下者具有增強(qiáng)免疫力作用.在免疫功能低下模型成立條件下,血液白細(xì)胞總數(shù)、細(xì)胞免疫功能、體液免 疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能及 NK細(xì)胞活性五個(gè)方面測(cè)定中,任兩個(gè)方面試驗(yàn) 結(jié)果為陽性,判定該受試樣品對(duì)免疫功能低下者具有增強(qiáng)免疫力作用.其中細(xì)胞免疫功能測(cè)定工程中兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陽性,或任一個(gè)實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)劑量組結(jié)果陽性,可判定細(xì)胞免疫功能試驗(yàn)結(jié)果陽性. 體液免疫功能測(cè)定工程 中兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陽性,或任一個(gè)實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)劑量組結(jié)果陽性,可判定體液 免疫功能試驗(yàn)結(jié)果陽性.單核一巨噬細(xì)胞功能測(cè)定工程中兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陽 性,或任一個(gè)實(shí)驗(yàn)

4、的兩個(gè)劑量組結(jié)果陽性,可判定單核一巨噬細(xì)胞功能試驗(yàn)結(jié)果 陽性.NK細(xì)胞活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)的一個(gè)以上劑量結(jié)果陽性,可以判定 NK細(xì)胞活性結(jié) 果陽性.血液白細(xì)胞總數(shù)測(cè)定的二個(gè)以上劑量結(jié)果陽性, 可以判定血液白細(xì)胞總 數(shù)結(jié)果陽性.免疫功能低下模型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)至少需進(jìn)行三個(gè)方面的測(cè)定.同時(shí)在各項(xiàng)實(shí)驗(yàn) 中,任何一項(xiàng)測(cè)試都不出現(xiàn)加重免疫抑制劑作用的結(jié)果.增強(qiáng)免疫力功能檢驗(yàn)方法Method for the Assessment of Enhancing Immune Function1 .原理：免疫系統(tǒng)主要包括中央和外周淋巴器官、淋巴組織和全身各處的淋巴細(xì) 胞、抗原呈遞細(xì)胞等,還包括血液中的白細(xì)胞.淋巴細(xì)胞經(jīng)血液和淋

5、巴使各 處的淋巴器官和淋巴組織連成一個(gè)功能整體.胸腺屬中央淋巴器官,主要功能 是保證T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生和成熟.外周淋巴器官包括血液、淋巴管和免疫活性細(xì) 胞；脾臟對(duì)抗原發(fā)生免疫應(yīng)答作用,脾竇的巨噬細(xì)胞具有去除功能,脾白髓含有 記憶B細(xì)胞,產(chǎn)生對(duì)T依賴抗原的體液免疫應(yīng)答.淋巴細(xì)胞是特異性免疫應(yīng)答的 主要細(xì)胞群,按其外表標(biāo)志物,分為 T細(xì)胞、B細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞NK三大 類,T細(xì)胞又分為CD4 Th細(xì)胞和CD8T淋巴細(xì)胞.B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞后 能合成和釋放抗原特異抗體,所有抗體都是免疫球蛋白,但并非所有的免疫球蛋 白分子都具有抗體功能.免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生特異性免疫和非特異性免疫功能,檢測(cè) 上述免疫系統(tǒng)

6、的各種代表性指標(biāo)的改變可對(duì)增強(qiáng)免疫力作用的功能做出相應(yīng)判 定.2 .實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇推薦用近交系小鼠,如 C57BL/6J、BALB/C等,68周齡,1822g BALB/C 種可16-18g,單一性別,雌雄均可,每組 1015只.3 .劑量分組及受試樣品給予時(shí)間實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和1個(gè)陰性對(duì)照組.以人體推薦量的10倍為其中一個(gè)劑 量,另設(shè)二個(gè)劑量組.必要時(shí)設(shè)陽性對(duì)照組.選做免疫低下模型法時(shí),應(yīng)設(shè)模型 對(duì)照組.受試樣品給予時(shí)間四周或 30天.4 .免疫功能低下動(dòng)物模型可選用環(huán)磷酰胺、氫化可的松或其他適宜的免疫抑制劑進(jìn)行藥物造模.造模原理：4.1.1 環(huán)磷酰胺主要通過DNA烷基化破壞DNA的合成而非特

7、異性地殺傷淋巴細(xì) 胞,并可抑制淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化；環(huán)磷酰胺對(duì)B細(xì)胞的抑制比T細(xì)胞強(qiáng),一般對(duì)體液 免疫有很強(qiáng)的抑制作用,對(duì)NK細(xì)胞的抑制作用較弱.4.1.2 氫化可的松主要通過與相應(yīng)受體結(jié)合成復(fù)合物后進(jìn)入細(xì)胞核,阻礙NF-kB進(jìn)入細(xì)胞核,抑制細(xì)胞因子與炎癥介質(zhì)的合成和釋放, 到達(dá)免疫抑制目的.氫化 可的松還可損傷漿細(xì)胞,抑制巨噬細(xì)胞對(duì)抗原的吞噬、處理、和呈遞作用,所以 氫化可的松對(duì)細(xì)胞免疫、體液免疫和巨噬細(xì)胞的吞噬、NK作用都有一定的抑制作用.免疫抑制劑劑量選擇環(huán)磷酰胺可選擇40mkg,腹腔注射,連續(xù)兩天,末次注射給藥后第 5天 測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)；氫化可的松可選擇 40mkg,肌內(nèi)注射,隔天一次,共 5次

8、, 末次注射給藥后次日測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo).各指標(biāo)對(duì)兩種模型敏感性不同,環(huán)磷酰胺模型比擬適合抗體生成細(xì)胞檢測(cè)、 血清溶血素測(cè)定、白細(xì)胞總數(shù)測(cè)定；氫化可的松模型比擬適合遲發(fā)型變態(tài)反響、 碳廓清實(shí)驗(yàn)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球?qū)嶒?yàn)、NK細(xì)胞活性測(cè)定,建議根據(jù)不同的免疫功能指標(biāo)選擇適宜的模型.受試物給予連續(xù)給予受試物4周或30天,在第3周后開始給予免疫抑制劑,進(jìn)行模型 與預(yù)防性給藥相結(jié)合的實(shí)驗(yàn).5.實(shí)驗(yàn)方法血液白細(xì)胞數(shù)測(cè)定 小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)檢測(cè)方法 儀器法 全血用EDTA a抗凝后經(jīng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè),可測(cè)定白細(xì)胞數(shù)量,并可對(duì) 白細(xì)胞進(jìn)行分分類計(jì)數(shù).5.1.1 儀器和材料乙二胺四乙酸二鉀(EDT

9、A & 2HQ),離心管,全血細(xì)胞分析儀上樣管, 眼科銀子,振蕩器,加樣槍,冷凍離心機(jī),全血細(xì)胞分析儀.5.1.2 實(shí)驗(yàn)步驟5.1.2.1 試劑配制血液抗凝：EDTA &能與血液中的鈣離子結(jié)合成為螯合物,從而阻止血液凝 固,的EDTA &可阻止1ml血液凝固.抗凝劑配制：稱量8mgEDTA K2加純潔水至100ml制成抗凝劑,50屋抗凝 劑可抗凝1ml小鼠全血.5.1.2.2 采血以摘除小鼠眼球的方法采集全血,采用干凈無菌的眼科銀子摘取小鼠一側(cè)或 雙側(cè)眼球,讓血液自由滴入裝有抗凝劑的離心管(或商品化的抗凝管)中,采血 過程中不斷混勻血液與抗凝劑預(yù)防血液凝固,每只動(dòng)物采集

10、抗凝全血約1ml.5.1.2.3 檢測(cè)分析上機(jī)前血液顛倒混勻,注意檢查是否存在凝塊.在24h內(nèi)以全血細(xì)胞分析儀 檢測(cè)白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù).上機(jī)操作參照儀器說明書.5.1.3 數(shù)據(jù)分析一般采用方差分析,按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn), 方差齊,計(jì)算 F值,p>,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性意義；F值>,P<,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比擬方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行 適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊性要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；假設(shè) 變量轉(zhuǎn)換后仍未到達(dá)正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì).受試樣品組的白細(xì)胞總數(shù)顯著高于陰性對(duì)照組,可判定該

11、項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性.ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)可任選以下方法之一5.2.1 MTT 法5.2.1.1 原理當(dāng)T淋巴細(xì)胞受ConA®激后發(fā)生母細(xì)胞增殖反響,活細(xì)胞特別是增殖細(xì)胞 通過線粒體水解酶將MTT 一種淡黃色的唾氮鹽分解為蘭紫色結(jié)晶而顯色,其 光密度值能反映細(xì)胞的增殖情況.5.2.1.2 儀器和材料RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清、2-琉基乙醇2-ME、青霉素、鏈霉素、 刀豆蛋白A ConA、鹽酸、異丙醇、MTT Hank's液、PBSg沖液紗布、200目篩網(wǎng)、24孔培養(yǎng)板,96孔培養(yǎng)板平底,手術(shù)器械、大號(hào)注 射器內(nèi)芯、二氧化碳培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、分光光度計(jì)、超凈

12、工作臺(tái)、高壓滅菌器、 無菌濾器.5.2.1.3 實(shí)驗(yàn)步驟5.2.1.3.1 試劑配制完全培養(yǎng)液RPMI1640培養(yǎng)液過濾除菌,用前參加10%小牛血清,1 %谷 氨酰胺200mmol/L,青霉素100U/mL,鏈霉素100ug/L及 5X10 5mol/L 的2-琉基乙醇,用無菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOHS pH至,即完全培 養(yǎng)液.ConA液 用雙蒸水配制成100ug/mL的溶液,過濾除菌,在低溫冰箱-20C 保存.無菌Hank's液 用前以的無菌NaHCOtl.MTTW 將5mgMT落于1mL的PBS中,現(xiàn)配現(xiàn)用.酸性異丙醇溶液96mL異丙醇中參加4mL 1mol/

13、L的HCl,臨用前配制.5.2.1.3.2 脾細(xì)胞懸液制備無菌取脾,置于盛有適量3-5ml無菌Hank's液平皿中,并在脾上面放置 一塊紗布,用大號(hào)注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎,制成單個(gè)細(xì)胞懸液.經(jīng)200目篩網(wǎng) 過濾,用Hank's液洗2次,每次離心10min 1000r/min .然后將細(xì)胞懸浮于 2mL的完全培養(yǎng)液中,用全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)脾細(xì)胞,或用臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)應(yīng)在95%Z上,調(diào)整細(xì)胞濃度為3X 106個(gè)/mL.5.2.1.3.3 淋巴細(xì)胞增殖反響將細(xì)胞懸液分兩孔參加24孔培養(yǎng)板中,每孔1mL一孔加75仙l ConA液相 當(dāng)于g/mL,另一孔作為對(duì)照,置5%CO, 3

14、7c CO孵箱中培養(yǎng)72h.培養(yǎng)結(jié)束 前4h,每孔輕輕吸去上清液,參加不含小牛血清的RPMI1640W養(yǎng)液,同時(shí)參加MTT5mg/mL 50 l /孔,繼續(xù)培養(yǎng)4h.培養(yǎng)結(jié)束后,每孔參加1mL酸性異丙 醇,超聲震蕩2秒或人工吹打混勻,使紫色結(jié)晶完全溶解.然后分裝到 96 孔培養(yǎng)板中,每個(gè)孔分裝3孔作為平行樣,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀,以570nm波長(zhǎng)測(cè) 定光密度值.也可將溶解液直接移入 2mL比色杯中,分光光度計(jì)上在波長(zhǎng) 570nm 測(cè)定ODfi.5.2.1.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊, 計(jì)算F值,F®< ,結(jié)論：各組均數(shù)間差

15、異無顯著性；F值?,P0,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組 和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比擬方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行 適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；假設(shè)變 量轉(zhuǎn)換后仍未到達(dá)正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì).用加ConAfL的光密度值減去不加ConAfL的光密度值代表淋巴細(xì)胞的增殖能 力,受試樣品組的光密度差值顯著高于對(duì)照組的光密度差值,可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性.5.2.1.5 考前須知ConA的濃度很重要,濃度過低不能刺激足夠的細(xì)胞增殖,濃度過高會(huì)抑制 細(xì)胞增殖,不同批號(hào)的ConA在實(shí)驗(yàn)前要預(yù)試,以找到最正確濃度.5.2.2 XTT 法5.2.2.1 原理由

16、于MTT經(jīng)復(fù)原所產(chǎn)生的甲產(chǎn)物不溶于水,且溶解甲的有機(jī)溶劑有毒 性,可選擇XTT法替代MTT去.其原理是：XTT是二甲氧唾黃,在電子耦合試劑 存在的情況下,活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶可將黃色的 XTT復(fù)原成水溶性的橘黃色的甲月贊,生成的甲月贊能夠溶解在組織培養(yǎng)基中,不形成顆粒,可直接用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)定吸光值.5.2.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟脾細(xì)胞懸7制備同MTTt；淋巴細(xì)胞增殖反響：調(diào)整細(xì)胞濃度為 5X107,取細(xì)月懸液100屋 分別參加96孔培養(yǎng)板中,一孔加510Nl ConA液,另一孔作為對(duì)照,設(shè) 2個(gè)平行孔, 置37c5%CO飽和濕度孵箱中培養(yǎng)72h.培養(yǎng)結(jié)束前4h,向各孔中參加2050屋 的XT

17、T工作液按試劑盒說明現(xiàn)用現(xiàn)配,孵育4小時(shí).用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng) 處檢測(cè)每孔的光密度.5.2.2.3 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊,計(jì)算F值,F®< ,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值?,P0,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組 和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比擬方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行 適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；假設(shè)變 量轉(zhuǎn)換后仍未到達(dá)正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì).用加ConAfL的光密度值減去不加ConAfL的光密度值代表淋巴細(xì)胞的增殖能 力,受試樣品組的光密度差值顯著高于對(duì)

18、照組的光密度差值,可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性.5.2.2.4 考前須知細(xì)胞濃度及培養(yǎng)時(shí)間在實(shí)驗(yàn)前要預(yù)試,以找到最正確效果.5.2.3 澳脫氧尿喀噬核昔標(biāo)記酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 BrdU-ELISA法5.2.3.1 原理T 淋巴細(xì)胞在有絲分裂原ConA等的刺激下產(chǎn)生增殖反響,BrdU可競(jìng)爭(zhēng)摻入 到增殖細(xì)胞中新合成的DNAg內(nèi),將BrdU標(biāo)記的細(xì)胞作為抗原結(jié)合到固相載體 外表,參加酶連接的抗-BrdU抗體,使BrdU抗原與酶標(biāo)抗體充分結(jié)合,抗原抗 體復(fù)合物與底物作用后產(chǎn)生有色物質(zhì),其光密度可反映細(xì)胞增殖的程度.5.2.3.2 儀器和材料低溫離心機(jī),全自動(dòng)酶標(biāo)儀、超7工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、96孔培養(yǎng)板平

19、底、倒置顯微鏡、移液器、手術(shù)器械、200目篩網(wǎng)、細(xì)胞活性分析儀；RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清、青霉素、鏈霉素、刀豆蛋白A ConA、Hank's液、PBS緩沖液、BrdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒ELISA、純潔水、終止液.5.2.3.3 實(shí)驗(yàn)步驟5.2.3.試劑配制完全培養(yǎng)液RPMI1640培養(yǎng)液過濾除菌,用前參加10%小牛血清,1%谷氨 酰胺 200mmol/L,青霉素100U/mD,鏈霉素100N g/L及 5X 10 5mol/L 的2-琉基乙醇,用無菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOHS pH至,即完全培 養(yǎng)液.ConA液 用雙蒸水配制成100ug/mL的溶液,

20、過濾除菌,在低溫冰箱-20C 保存.無菌Hank's液 用前以的無菌NaHCOI.BrdU標(biāo)記液 將標(biāo)記劑試劑盒按1: 100的比例加到培養(yǎng)液中混勻,現(xiàn) 配現(xiàn)用.抗體貯存液母液在Anti-BrdU-POD 試劑盒中加雙蒸水充分混合, 存于-20 C備用.抗體工作液 每100屋 抗體母液加10ml抗體稀釋液試劑盒,現(xiàn)配現(xiàn)用.洗液 每10ml清洗緩沖液試劑盒加100ml雙蒸水.5.2.3.脾細(xì)胞懸液制備無菌取脾,置于盛有適量無菌 Hank's液平皿中,并在脾上面放置一塊紗布, 用大號(hào)注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎,制成單個(gè)細(xì)胞懸液.經(jīng) 200目篩網(wǎng)過濾,用 Hank's液洗2次,每

21、次離心10min 1000r/min .然后將細(xì)胞懸浮于2mL的完全 培養(yǎng)液中,用全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)脾細(xì)胞, 或用臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù) 應(yīng) 在95姒上,調(diào)整細(xì)胞濃度為2X107個(gè)/mL.5.2.3.淋巴細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞參加96孔培養(yǎng)板中,10仙1/孔,每份細(xì)胞加2孔,第1孔再參加90N11640培養(yǎng)液,第2孔參加85仙11640培養(yǎng)液和世1 ConA同時(shí)設(shè)3個(gè)空白 孔,每孔僅加100以1 1640培養(yǎng)液,置5%CO 37c培養(yǎng)箱孵育72h,培養(yǎng)結(jié)束 前4 h參加BrdU標(biāo)記液,101/孔,培養(yǎng)結(jié)束后離心1000r/min,10min , 棄上清,吹干細(xì)胞,放4c冰箱保存待測(cè).1.1.1.1

22、聯(lián)免疫吸附測(cè)定每孔加200屋 固定液,常溫放置30min后,吸棄固定液.參加100仙1 BrdU 抗體工作液,37c孵育60min；吸棄未結(jié)合的抗體,力口 250屋 洗液洗3次,輕 拍移去洗液.加底物溶液含 TMB 1001 /孔,常溫孵育15min.用酶標(biāo)儀測(cè) 量吸光值,不加終止液時(shí),測(cè)定發(fā)射波長(zhǎng)為370nm 記為樂.,參考波長(zhǎng)492nm記為A92；加終止液時(shí),測(cè)定發(fā)射波長(zhǎng)為 450nm 記為性.,參考波長(zhǎng)690nm 記為 A590.5.2.3.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定計(jì)算每孔標(biāo)記指數(shù)LI , LI= A370- A空白370- A192- A 空白 492或 LI= A50- A空白450

23、- A590- A空白690.用加ConA孔的LI值減去不加ConA孔的LI值所得 的差值代表淋巴細(xì)胞的增殖程度.采用方差分析對(duì)標(biāo)記指數(shù)差值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,按方差分析的程序先進(jìn)行方 差齊性檢驗(yàn),方差齊,計(jì)算F值,F®< ,那么各組均數(shù)間差異無顯著性；F值?,P < ,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比擬方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方 差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；假設(shè)變量轉(zhuǎn)換后仍未到達(dá)正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì).受試樣品組的LI值差值顯著高于對(duì)照組的LI值差值,可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 陽性.5.2.3.5 考前

24、須知選擇有絲分裂原時(shí)ConA的濃度很重要,ConA的濃度過高會(huì)產(chǎn)生抑制作用, 不同批號(hào)的ConA在實(shí)驗(yàn)前要預(yù)試,以找到最正確刺激分裂濃度遲發(fā)型變態(tài)反響DTH遲發(fā)型變態(tài)反響是細(xì)胞免疫的體內(nèi)檢測(cè)法,當(dāng)致敏 T細(xì)胞再次與抗原接觸, 引起T細(xì)胞活化,釋放出多種細(xì)胞因子,致局部組織發(fā)生以單核細(xì)胞為主的炎癥 反響,一般在2448h達(dá)頂峰.可任選以下方法之一試驗(yàn).5.3.1 二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠DTH 耳月中脹法5.3.1.1 原理二硝基氟苯DNFB稀釋液可與腹壁皮膚蛋白結(jié)合成完全抗原,由此刺激T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞.47d后再將其涂抹于耳部進(jìn)行抗原攻擊, 使局 部月中脹,一般在抗原攻擊后2448h達(dá)頂

25、峰,其月中脹程度可以反映遲發(fā)型變態(tài)反 應(yīng)程度.5.3.1.2 材料DNFB、丙酮、麻油、硫化鋼、打孔器.5.3.1.3 實(shí)驗(yàn)步驟5.3.1.3.1 試劑配制DNFB§液DNFB溶液應(yīng)新鮮配制,稱取DNFB50mg置清潔枯燥小瓶中,將 預(yù)先配好的5mL丙酮麻油溶液丙酮：麻油=1: 1,倒入小瓶,蓋好瓶塞并用膠 布密封.混勻后,用250屋 注射器通過瓶蓋取用.5.3.1.3.2 致敏每鼠腹部皮膚用硫化鋼脫毛,范圍約 3cmx 3cm用DNFB溶 液50屋 均勻涂抹致敏.5.3.1.3.3 DTH的產(chǎn)生與測(cè)定5天后,用DNFB溶液10仙1均勻涂抹于小鼠右 耳兩面進(jìn)行攻擊.攻擊后 24h頸椎

26、脫臼處死小鼠,剪下左右耳殼.用打孔 器取下直徑8mml勺耳片,稱重.5.3.1.4 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果判定一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊,計(jì)算F值,F®< ,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值?,P0,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組 和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比擬方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行 適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；假設(shè)變 量轉(zhuǎn)換后仍未到達(dá)正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)用左右耳重量之差表示DTH的程度.受試樣品組的重量差值顯著高于與對(duì)照組的重量差值,可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性.5.3.1.5 考前須知：操作

27、時(shí)應(yīng)預(yù)防DNFBW皮膚接觸.5.3.2 綿羊紅細(xì)胞SRBC誘導(dǎo)小鼠DTH足跖增厚法5.3.2.1 原理SRBC可刺激T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞,4天后,當(dāng)再以SRBOJ擊時(shí), 攻擊部位出現(xiàn)月中脹,其月中脹程度可反映遲發(fā)型變態(tài)反響程度.5.3.2.2 儀器與材料游標(biāo)卡尺精密度0.02mn、SRBC微量注射器50膜、足趾容積測(cè)量?jī)x.5.3.2.3 實(shí)驗(yàn)步驟5.3.2.3.1 致敏 小鼠用2%v/vSRBC腹腔或靜脈免疫,每只鼠注射約1X 108個(gè) SRBC.5.3.2.3.2 DTH 的產(chǎn)生與測(cè)定 免疫后4天,測(cè)量左后足跖部厚度或月中脹度, 然后在測(cè)量部位皮下注射20% v/vSRBC,每只鼠2

28、0屋 約1X108個(gè)SRBC, 注射后于24h測(cè)量左后足跖部厚度或月中脹度,同一部位測(cè)量三次,取平均值.測(cè)量方法：用游標(biāo)卡尺測(cè)量肉眼讀數(shù).或用足趾容積測(cè)量?jī)x進(jìn)行測(cè)量足跖部月中脹度,操作方法按儀器操作指引進(jìn)行.5.3.2.4 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊,計(jì)算F值,F®< ,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值?,P0,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組 和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比擬方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行 適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；假設(shè)變 量轉(zhuǎn)換后仍未到達(dá)正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行

29、統(tǒng)計(jì).以攻擊前后足跖厚度或月中脹度的差值來表示DTH的程度.受試樣品組的差值顯著高于對(duì)照組的差值,可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性.5.3.2.5 考前須知前后兩次測(cè)量足跖厚度時(shí),最好由專人來進(jìn)行.卡尺緊貼足跖部,但不要加 壓,否那么會(huì)影響測(cè)量結(jié)果.攻擊時(shí)所用的SRBCM新鮮(保存期不超過1周).抗體生成細(xì)胞檢測(cè)(改進(jìn)法)5.4.1 原理溶血空斑試驗(yàn)是檢測(cè)產(chǎn)生IgM、IgG等抗體分泌細(xì)胞數(shù)體外試驗(yàn)法.用綿羊 紅細(xì)胞(SRBC免疫的小鼠脾細(xì)胞懸液與一定量的 SRBC昆合,在補(bǔ)體參與下, 使抗體分泌細(xì)胞周圍的SRBO解,形成肉眼可見的空斑.5.4.2 儀器和材料溶血空斑自動(dòng)圖象分析儀、二氧化碳培養(yǎng)箱、恒溫水

30、浴、離心機(jī)、手術(shù)器械、 200目篩網(wǎng)、SRBC補(bǔ)體(豚鼠血清)、Hank's液、RPMI1640W養(yǎng)液、SA緩沖液(CHNQ 0.46g, MgC2 0.1g, 0.2g, NaCl 8.38g, NaHCO0.252g and GHNNaO 0.3g,加蒸儲(chǔ)水至1000mL、滅菌生理鹽水、瓊脂糖.5.4.3 實(shí)驗(yàn)步驟：5.4.3.1 SRBC 綿羊頸靜脈取血,將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中, 朝一 個(gè)方向搖動(dòng),以脫纖維,生理鹽水 2500rpm/min , 15min,洗滌3次,制備壓積 SRBC放入4 c冰箱保存?zhèn)溆?5.4.3.2 完全培養(yǎng)基的制備：新生小牛血清經(jīng)綿羊紅細(xì)胞(v

31、/v, 5: 1)吸收, 4C, 30-60min后,參加不完全培養(yǎng)基 RPMI 1640中,制備成含20%、牛血清的 完全培養(yǎng)基.5.4.3.3 補(bǔ)體制備 股動(dòng)脈取血,靜置 30-60min, 2500rpm/min, 15min別離 血清,將5-10只豚鼠血清混合后,與壓積 SRBCZ 5: 1 (v/v)比例混合,4c 冰箱放置30-60min,問或震蕩,2500rpm/min, 15min別離血清,分裝,-80 C冰 箱保存.用時(shí)以完全培養(yǎng)基1: 10 (v/v)比例稀釋.5.4.3.4免疫動(dòng)物壓積SRBC以生理鹽水制成2% (v/v)的細(xì)胞懸液(約1 X 108個(gè)SRBC,每只鼠腹腔

32、注射.5.4.3.5 脾細(xì)胞懸液制備 將SRBC&疫4-5天后的小鼠頸椎脫臼處死,無菌取脾臟,并在脾上面放置一塊紗布,用大號(hào)注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎,制成單個(gè) 細(xì)胞懸液,200目篩網(wǎng)過濾,1000rpm/min, 10min,去上清,Hank'液洗2遍, 以完全培養(yǎng)基RPMI 1640制備成5X 1061 X 107個(gè)細(xì)胞/mL的脾細(xì)胞懸液.5.4.3.6 空斑的測(cè)定5.4.3.6.1 底層培養(yǎng)基制備0.5g瓊脂糖參加100mL滅菌生理鹽水中,加熱溶解,待溫度于50c左右時(shí),以1mL仇的量加至六孔培養(yǎng)板中,瓊脂凝固后備用.5.4.3.6.2 頂層培養(yǎng)基制備0.5g瓊脂糖參加100

33、mLHank' s液中,加熱溶 解,以試管的量加至46-50.叵溫的試管中.5.4.3.6.3 鋪板：50屋20%SRBC生理鹽水配制,v/v、200屋 脾細(xì)胞懸液 先后參加含有頂層的試管中,迅速混勻,倒入六孔板中并鋪平頂層混合液, 每個(gè) 樣本做兩個(gè)平行孔.5.4.3.6.4 空斑測(cè)定：已制備好培養(yǎng)板放入 37C、5%CO加養(yǎng)箱中孵育1h,然 后每孔參加500屋以完全培養(yǎng)基稀釋的補(bǔ)體v/v, 1: 10,繼續(xù)孵育2h,自 動(dòng)圖象分析儀讀取溶血空斑圖象分析軟件計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù). 取平行孔空斑數(shù)的平 均值為樣本的溶血空斑數(shù)值,以空斑數(shù)/106脾細(xì)胞表示.5.4.4數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定一般采用方

34、差分析,但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊,計(jì)算F值,F®< ,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值?,P0,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組 和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比擬方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行 適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；假設(shè)變 量轉(zhuǎn)換后仍未到達(dá)正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì).用空斑數(shù)/106脾細(xì)胞或空斑數(shù)/全脾細(xì)胞來表示,受試樣品組的空斑數(shù)顯著 高于對(duì)照組的空斑數(shù),可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性.血清溶血素的測(cè)定可任選以下方法之一.5.5.1 血凝法5.5.1.1 原理用SRBQfe疫動(dòng)物后,產(chǎn)生抗SRB仇體(溶血素),利用

35、其凝集SRBC勺程度 來檢測(cè)溶血素的水平.5.5.1.2 儀器和材料SRBC、生理鹽水、微量血凝實(shí)驗(yàn)板、離心機(jī)5.5.1.3 實(shí)驗(yàn)步驟5.5.1.3.1 SRBC綿羊頸靜脈取血,將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中,朝一個(gè)方向搖動(dòng),以脫纖維,放入 4c冰箱保存?zhèn)溆?可保存2周.5.5.1.3.2 免疫動(dòng)物及血清別離 取羊血,用生理鹽水洗滌 3次,每次離心 (2000r/min)10min.將壓積SRBCffl生理鹽水配成2% (v/v )的細(xì)胞懸液,每只 鼠腹腔注射進(jìn)行免疫.45d后,摘除眼球取血于離心管內(nèi),放置約1h,將凝固 血與管壁剝離,使血清充分析出,2000r/min離心10min,收集血

36、清.5.5.1.3.3 凝集反響 用生理鹽水將血清倍比稀釋,將不同稀釋度的血清分別置 于微量血凝實(shí)驗(yàn)板內(nèi),每孔100仙1,再參加100仙l % (v/v)的SRBCt液,混 勻,裝入濕潤(rùn)的平盤內(nèi)加蓋,于 37c溫箱孵育3h,觀察血球凝集程度.5.5.1.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊,計(jì)算F值,F®< ,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值?,P0,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組 和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比擬方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行 適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；假設(shè)變 量轉(zhuǎn)換后仍未到達(dá)正

37、態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì).血清凝集程度一般分為5級(jí)(0-IV)記錄,按下式計(jì)算抗體積數(shù),受試樣 品組的抗體積數(shù)顯著高于對(duì)照組的抗體水平,可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性.抗體水平=(S+2S+3s3nS)式中1、2、3n代表對(duì)倍稀釋的指數(shù),S代表凝集程度的級(jí)別,抗體積數(shù) 越大,表示血清抗體越高.0級(jí) 紅細(xì)胞全部下沉,集中在孔底部形成致密的圓點(diǎn)狀,四周液體清皙.I級(jí)紅細(xì)胞大局部沉集在孔底成園點(diǎn)狀,四周有少量凝集的紅細(xì)胞.R級(jí) 凝集的紅細(xì)胞在孔底形成薄層,中央可以明顯見到一個(gè)疏松的紅點(diǎn).田級(jí) 凝集的紅細(xì)胞均勻地鋪散在孔底成一薄層,中央隱約可見一個(gè)小紅點(diǎn).IV級(jí) 凝集的紅細(xì)胞均勻地鋪散在孔底成一

38、薄層,凝塊有時(shí)成卷折狀.5.5.1.5 考前須知血清稀釋時(shí)要充分混勻.最后一個(gè)稀釋度應(yīng)不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象.5.5.2 半數(shù)溶血值HG的測(cè)定5.5.2.1 原理用SRBCl疫動(dòng)物后,產(chǎn)生抗SRBCM體溶血素,在補(bǔ)體參與下,與SRBC 一起孵育,可發(fā)生溶血反響,釋放血紅蛋白,通過測(cè)定血紅蛋白含量反映動(dòng)物血 清中溶血素的含量.5.5.2.2 儀器和材料分光光度計(jì)、全自動(dòng)酶標(biāo)儀、恒溫培養(yǎng)箱、96孔培養(yǎng)板、離心機(jī)、恒溫水浴、SRBC補(bǔ)體豚鼠血清、SA緩沖液CHMQ0.46g, MgC2 0.1g, 0.2g, NaCl8.38g, NaHCO0.252g and GHiN2NaO0.3g,加蒸儲(chǔ)水至 100

39、0m!、都氏試劑碳 酸氫鈉1.0g、高鐵氟化鉀0.2g、氟化鉀0.05g,加蒸儲(chǔ)水至1000mL5.5.2.3 實(shí)驗(yàn)步驟5.5.2.3.1 SRBC綿羊頸靜脈取血,將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中朝一個(gè)方向搖動(dòng),以脫纖維,放入 4c冰箱保存?zhèn)溆?可保存2周.5.5.2.3.2 制備補(bǔ)體采集豚鼠血,別離出血清至少 5只豚鼠的混合血清, 將1mL壓積SRBO入到5mL豚鼠血清中,放4c冰箱30min,經(jīng)常振蕩,離心取 上清,分裝,70c保存.用時(shí)以SA緩沖液按1 : 8稀釋.5.5.2.3.3 免疫動(dòng)物及血清別離 取羊血,用生理鹽水洗滌 3次,每次離心 2000r/min10min.將壓積SRBC

40、ffl生理鹽水配成2% v/v 的細(xì)胞懸液,每只 鼠腹腔注射進(jìn)行免疫.45d后,摘除眼球取血于離心管內(nèi),放置約1h,使血清 充分析出,2000r/min離心10min,或6000r/min,4min,收集血清.5.5.2.3.4 溶血反響測(cè)定5.5.2.3 ,檢測(cè)方法1 分光光度計(jì)測(cè)定：取血清用SA緩沖液稀釋一般為200500倍.將稀釋后的血清1mL置試 管內(nèi),依次參加10%v/vSRBC ,補(bǔ)體1mL用SA液按1:8稀釋.另設(shè)不加 血清的對(duì)照管以SA液代替.置37恒溫水浴中保溫1530min后,冰浴終 止反響.2000r/min離心10min.取上清液1mL加都氏試劑3mL同時(shí)取10% v/

41、vSRBC加都氏試劑至4mL充分混勻,放置10min后,于540nm處以對(duì)照管 作空白,分別測(cè)定各管光密度值.5.5.2.4 .檢測(cè)方法2全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定：設(shè)樣品孔和空白對(duì)照孔,樣品孔：取血清 10仙1,用1mL1:5稀釋的SA緩沖 液稀釋；每孔參加稀釋后的血清100履；空白對(duì)照孔：每孔參加100屋1:5稀 釋的SA緩沖液,再依次參加10% v/vSRBC 50屋,補(bǔ)體100膜用SA溶液或 PBS容液按1:8稀釋,置37c恒溫水浴中保溫30min, 1500r/min離心10min. 然后樣品孔和空白對(duì)照孔各取上清液 50參加另一個(gè)96孔培養(yǎng)板內(nèi),加都氏 試劑150仙l o同時(shí)設(shè)半數(shù)溶血孔,參

42、加10%v/vSRBC 屋,再加都氏試劑至 200屋.用震蕩器充分混勻,放置10min后,于540nm處用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各 孔光密度值.5.5.2.5 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊, 計(jì)算F值,F®< ,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值?,P0,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組 和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比擬方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行 適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；假設(shè)變 量轉(zhuǎn)換后仍未到達(dá)正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì).溶血素的量以半數(shù)溶血值HQ表示,按以下公式計(jì)算：樣品光密度值X

43、稀釋倍數(shù)樣品HGo=SRBC半數(shù)溶血時(shí)的光密度值樣品光密度值-空白光密度值或樣品HG0=X稀釋倍數(shù)SRBC 半數(shù)溶血時(shí)的光密度值-空白光密度值受試樣品組的HQ顯著高于對(duì)照組的HQ,可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性.小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)5.6.1 原理在一定范圍內(nèi),碳顆粒的消除速率與其劑量呈指函數(shù)關(guān)系.以血碳濃度對(duì)數(shù)值為縱座標(biāo),時(shí)間為橫座標(biāo),兩者呈直線關(guān)系.此直線斜率 K 可表示吞噬速率.動(dòng)物肝、脾重量影響吞噬速率,一般以校正吞噬指數(shù) a表示. 5.6.2儀器和試劑分光光度計(jì)、全自動(dòng)酶標(biāo)儀、計(jì)時(shí)器、血色素吸管、印度墨汁、NaCO5.6.3 實(shí)驗(yàn)步驟5.6.3.1 溶液配制注射用墨汁 將印度墨汁原液用生理鹽水稀釋

44、 34倍.Na 2CO溶液 取,加蒸儲(chǔ)水至100mL5.6.3.2 注射墨汁 稱體重,從小鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨汁, 按每10g體重 計(jì)算.待墨汁注入,立即計(jì)時(shí).5.6.3.3 測(cè)定注入墨汁后2、10min,分別從內(nèi)眥靜脈叢取血 20小,并立即將其加到2mL %N2CO溶液中.用分光光度計(jì)或全自動(dòng)酶標(biāo)儀在600nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度值OD,以NaCO溶液作空白對(duì)照.將小鼠處死,取肝臟和脾臟,用濾紙吸干臟器外表血污,稱重.以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的水平.按下式計(jì)算吞噬指數(shù)a:K=lgOD1-lgOD2體重3吞噬指數(shù) a=*% K肝重十脾重5.6.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定一般采用方差分析,但需按方差分

45、析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊,計(jì)算F值,F值 ,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值?,P0,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組 和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比擬方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行 適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；假設(shè)變 量轉(zhuǎn)換后仍未到達(dá)正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì).受試樣品組的吞噬指數(shù)顯著高于對(duì)照組的吞噬指數(shù),可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽 性.5.6.5 考前須知靜脈注入碳粒的量、取血時(shí)間、取血量一定要準(zhǔn)確.墨汁放置中,碳粒可沉于瓶底,臨用前應(yīng)搖勻.使用新的墨汁時(shí),應(yīng)在實(shí)驗(yàn)前摸索一個(gè)最適墨汁注入量,即正常小鼠在20 30min內(nèi)不易廓清.小鼠腹腔巨噬細(xì)

46、胞吞噬熒光微球試驗(yàn)方法5.7.1 原理：激活的巨噬細(xì)胞具有吞噬外表帶有陽性可調(diào)理基團(tuán)的熒光微球,將 含有巨噬細(xì)胞的腹腔液與調(diào)理過的熒光微球孵育一定時(shí)間后,去除多余未被吞噬 的微球,收集以巨噬細(xì)胞為主的標(biāo)本,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞,計(jì)數(shù)吞噬熒 光微球的巨噬細(xì)胞,計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù),據(jù)此判定巨噬細(xì)胞的吞噬水平.5.7.2 儀器和材料Hank's液,小牛血清,PB或沖液,生理鹽水,熒光微球2 m, 1 %小 牛血清白蛋白BSA.流式細(xì)胞儀,超聲清洗儀,二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱,離心機(jī),6孔培養(yǎng)板,細(xì)胞刮,過濾器75項(xiàng),流式上樣管,流式細(xì)胞儀專用鞘液,移液槍及吸頭,白 細(xì)胞計(jì)數(shù)板,手術(shù)器械一

47、套,注射器,滴管,膠頭吸管.5.7.3 實(shí)驗(yàn)步驟5.7.3.1 試劑配制5.7.3.1.1 含5%小牛血清的 Hank's液：取10ml小牛血清參加200ml Hank's液中,混勻,臨用前配.5.7.3.1.2 PBS緩沖液的配制方法：KHPO 6.66g, NaHPO 12HO 6.38g ,將上述試劑溶于1000ml蒸儲(chǔ)水中調(diào)PH值至即成.5.7.3.1.3 2%綿羊紅細(xì)胞懸液的配制方法：實(shí)驗(yàn)前取綿羊頸靜脈血,置于盛有玻璃珠20個(gè)左右的三角瓶?jī)?nèi),連續(xù)順一個(gè)方向充分搖動(dòng)510分鐘,除去纖維蛋白,用生理鹽水洗滌3次,每次1500rpm離心10分鐘,4c冰箱保存. 實(shí)驗(yàn)前棄去上

48、清,按血球壓積用生理鹽水配制成2%的紅細(xì)胞懸液.5.7.3.1.4 1%BSA勺配制：溶于50mlPBSg沖液中,臨用前配較好.5.7.3.1.5 熒光微球預(yù)調(diào)理：100屋 熒光微球與10ml 1 %BSA 37c避光孵育30min,超聲處理5min,臨用前配.5.7.3.2 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球過程實(shí)驗(yàn)前4天給每只小鼠腹腔注射2%綿羊血紅細(xì)胞激活小鼠巨噬細(xì)胞,實(shí)驗(yàn) 當(dāng)天用頸椎脫臼法處死小鼠,腹腔注射加小牛血清的Hank's液3ml/只,輕輕按 揉腹部20次,以充分洗出腹腔巨噬細(xì)胞,然后將腹壁剪開一個(gè)小口,吸取腹腔 洗液2ml用75 m過濾器過濾至試管內(nèi),調(diào)整巨噬細(xì)胞數(shù)為46X 1

49、05/ml.用移 液槍吸取1ml腹腔洗液于6孔培養(yǎng)板中,參加已經(jīng)預(yù)調(diào)理過的熒光微球1X107/ 板,37c二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱或室溫避光孵育90120分鐘,孵育結(jié)束后棄上清含未貼壁細(xì)胞和多余熒光微球,每次使用緩沖液輕輕洗滌2次,去上 清后再參加4CPBS緩沖液,用細(xì)胞刮刮下貼壁細(xì)胞,輕輕吹打均勻后經(jīng)75 m過濾器過濾后上機(jī)分析.5.7.3.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析5.7.3.3.1 設(shè)門：首先設(shè)立FSC-SS5維散點(diǎn)圖,通過調(diào)節(jié)FSC?口 SSC電壓值,以巨噬細(xì)胞設(shè)門界定分析的巨噬細(xì)胞群, 最大限度地排除其它有核細(xì)胞、細(xì)胞碎 片等的干擾;5.7.3.3.2 獲?。涸跓晒馕⑶虬l(fā)射光的熒光通路檢測(cè)巨噬

50、細(xì)胞的熒光強(qiáng)度,每 份樣本獲取5000個(gè)巨噬細(xì)胞,數(shù)據(jù)可顯示于二維散點(diǎn)圖和直方圖中.在二維散 點(diǎn)圖中可通過設(shè)門圈定未吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞群和吞噬熒光微球的巨噬細(xì) 胞群；在直方圖中可通過標(biāo)尺標(biāo)定未吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞群和吞噬熒光微球 的巨噬細(xì)胞群,全部數(shù)據(jù)經(jīng)相關(guān)軟件分析未吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞和吞噬不同 數(shù)量熒光微球的巨噬細(xì)胞的比例.吞噬一個(gè)熒光微球吞噬二個(gè)熒光微球圖1吞噬熒光微球后的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞圖熒光顯示400 圖2吞噬熒光微球后的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞FSC-SS.口 FL2-SSC二維散點(diǎn)圖R1:總巨噬細(xì)胞群R2:未吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞群R3:吞噬一個(gè)熒光微球的巨噬細(xì)胞群R4:吞噬兩個(gè)

51、光微球的巨噬細(xì)胞群R5:吞噬三個(gè)熒光微球的巨噬細(xì)胞群R6:吞噬四個(gè)或四個(gè)以上熒光微球的巨噬細(xì)胞群圖3吞噬熒光微球后的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞FL2直方圖5.7.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞數(shù)吞噬百分率衿= X 100計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)被吞噬的熒光微球總數(shù)吞噬指數(shù)二計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)以吞噬百分率或吞噬指數(shù)表示小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬水平.吞噬百分率需進(jìn)行 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換,X= Sin -1 JP,式中P為吞噬百分率,用小數(shù)表示,然后再進(jìn)行方差 分析,在進(jìn)行方差分析時(shí),需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊, 計(jì)算F值,F值 ,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值?,p0,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組 和一個(gè)對(duì)照組間

52、均數(shù)的兩兩比擬方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行 適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；假設(shè)變 量轉(zhuǎn)換后仍未到達(dá)正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì).受試樣品組的吞噬百分率、吞噬指數(shù)與對(duì)照組吞噬百分率、吞噬指數(shù)比擬, 差異均有顯著性,可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性.5.7.5 考前須知5.7.5.1 頸椎脫臼處死小鼠勿用力過大,預(yù)防腹腔內(nèi)血管破裂出血,導(dǎo)致腹腔洗液中混雜大量紅細(xì)胞,影響流式細(xì)胞儀的結(jié)果分析.5.7.5.2 孵育、細(xì)胞洗滌和上機(jī)全程注意避光,以保持微球熒光穩(wěn)定性.5.7.5.3 巨噬細(xì)胞、熒光微球濃度要根據(jù)試劑說明書調(diào)整適宜,否那么影響結(jié)果準(zhǔn)確性.

53、5.7.5.4 細(xì)胞處理過程要輕柔,盡量減少碎片和雜質(zhì)對(duì)結(jié)果分析的影響.5.7.5.5 腹水細(xì)胞上機(jī)前一定要用足夠標(biāo)準(zhǔn)的濾器過濾,調(diào)理后多余的熒光微球要盡量去除,以預(yù)防流式細(xì)胞儀堵塞.NK細(xì)胞活性測(cè)定NKffl胞是沒有T和B細(xì)胞外表標(biāo)志的淋巴細(xì)胞,具有非特異性殺傷作用. 可任選以下方法之一測(cè)定.5.8.1 乳酸脫氫酶LDH測(cè)定法5.8.1.1 原理正常情況下,活細(xì)胞的胞漿內(nèi)含有的 LDH不能透過細(xì)胞膜,當(dāng)細(xì)胞受到 NK 細(xì)胞的殺傷后,LDHS放到細(xì)胞外.LDH可使乳酸鋰脫氫,進(jìn)而使NADS®成NADH 后者再經(jīng)遞氫體吩嗪二甲酯硫酸鹽 PMS復(fù)原碘硝基氯化四氮唾INT, INT接 受U

54、被復(fù)原成紫紅色甲月贊類化合物.在酶標(biāo)儀上用490nm比色測(cè)定.5.8.1.2 儀器和材料酶標(biāo)儀、全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、 YAC-1細(xì)胞、Hank's液、RPMI164沈全 培養(yǎng)液、乳酸鋰或乳酸鈉、硝基氯化四氮唾INT、吩嗪二甲酯硫酸鹽PMS、 NAD L 的 Tris-HCl 緩沖液、1%NP40或Triton5.8.1.3 實(shí)驗(yàn)步驟5.8.1.3.1 LDH 基質(zhì)液的配制乳酸鋰 5 x 10-2mol/L硝基氯化四氮唾INT x 10-4mol/L吩嗪二甲酯硫酸鹽PMS X10-4mol/L氧化型輔酶I NAD X10-3mol/L將上述試劑溶于L的Tris-HCl緩沖液中5.8.1.3

55、.2 靶細(xì)胞的傳代YAC-1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前24h將靶細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng).應(yīng)用前以Hank's液洗3次,用RPMI1640 完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4X 105個(gè)/mL.5.8.1.3.3 脾細(xì)胞懸液的制備效應(yīng)細(xì)胞無菌取脾,置于盛有適量無菌 Hank's液的小平皿中,并在脾上面放置一塊 紗布,用大號(hào)注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎,制成單個(gè)細(xì)胞懸液.經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾, 用Hank's液洗2次,每次離心10min 1000r/min .棄上清將細(xì)胞漿彈起,力口 入滅菌水20秒,裂解紅細(xì)胞后再參加倍 Hank' s液及8mLHank s液,1000rpm, 10min離心,然后將細(xì)

56、胞懸浮于2mL的完全培養(yǎng)液中,用全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù) 脾細(xì)胞；或用1mL含10%、牛血清的RPMI164沈全培養(yǎng)液重懸,用1麻醋酸稀 釋后計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)應(yīng)在95%Z上,用臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)應(yīng)在95%Z上, 最后用RPMI1640S全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2X107個(gè)/mL.5.8.1.3.4 NK 細(xì)胞活性檢測(cè)取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100仙l 效靶比50:1 ,參加U型96孔培養(yǎng)板中； 靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100仙l ,靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和1%NP40或Triton各100卜l ;上述各項(xiàng)均設(shè)三個(gè)復(fù)孔,于 37C、5% CO培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)4h,然后將96孔培養(yǎng)板以1500r/

57、min離心5min,每孔吸取上清100口 置平底96孔培養(yǎng)板中,同時(shí)參加LDHS質(zhì)液100仙l ,反響3min,每孔參加1mol/L 的HCl 30小,在酶標(biāo)儀490nm處測(cè)定光密度值OD.按下式計(jì)算NK細(xì)胞活性：反響孔Ot>自然釋放孔ODNK細(xì)胞活性= X 100%最大釋放孔OD-自然釋放孔OD5.8.1.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定NK細(xì)胞活性需進(jìn)彳T數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換,X= Sin-1行,式中P為NKffl胞活性,用小數(shù) 表示,然后再進(jìn)行方差分析,在進(jìn)行方差分析時(shí),需按方差分析的程序先進(jìn)行方 差齊性檢驗(yàn),方差齊,計(jì)算 F值,F值< ,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F < >,P<,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比擬方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正 態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換, 待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換 后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；假設(shè)變量轉(zhuǎn)換后仍未到達(dá)正態(tài)或方差齊的目的, 改用秩和檢驗(yàn)