緩沖溶液的配制

1、緩沖溶液 緩沖溶液是一類能夠抵制外界加入少量酸和堿的影響，仍能維持pH值基本不變的溶液。該溶液的這種抗pH變化的作用稱為緩沖作用。緩沖溶液通常是由一或兩種化合物溶于溶劑（即純水）所得的溶液，溶液內(nèi)所溶解的溶質(zhì)（化合物）稱之為緩沖劑，調(diào)節(jié)緩沖劑的配比即可制得不同pH的緩沖液。 緩沖溶液的正確配制和pH值的準(zhǔn)確測定，在生物化學(xué)的研究工作中有著極為重要的意義，因?yàn)樵谏矬w內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)過程都是在精確的pH值下進(jìn)行的，而且受到氫離子濃度的嚴(yán)格調(diào)控，能夠做到這一點(diǎn)是因?yàn)樯矬w內(nèi)有完善的天然緩沖系統(tǒng)。生物體內(nèi)細(xì)胞的生長和活動(dòng)需要一定的pH值，體內(nèi)pH環(huán)境的任何改變都將引起與代謝有關(guān)的酸堿電離平衡移動(dòng)

2、，從而影響生物體內(nèi)細(xì)胞的活性。為了在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確地模擬生物體內(nèi)的天然環(huán)境，就必須保持體外生物化學(xué)反應(yīng)過程有體內(nèi)過程完全相同的pH值，此外，各種生化樣品的分離純化和分析鑒定，也必須選用合適的pH值，因此，在生物化學(xué)的各種研究工作中和生物技術(shù)的各種開發(fā)工作中，深刻地了解各種緩沖試劑的性質(zhì)，準(zhǔn)確恰當(dāng)?shù)剡x擇和配制各種緩沖溶液，精確地測定溶液的pH值，就是非常重要的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)工作。下表列出某些人體體液的pH值： 表13 人體體液pH 體 液 pH 體 液pH 血 清 7.357.45 大腸液8.38.4 成人胃液 0.91.5 淚6.66.9 唾 液 6.37.1 尿4.87.5 胰 液 7.58.0

3、 腦脊液7.357.457.1 基本概念 Brönsted-Lowry酸堿理論（又稱酸堿質(zhì)子理論）。1923年由丹麥化學(xué)家J.N.Brönsted和英國化學(xué)家T.M.Lowry同時(shí)提出了酸堿質(zhì)子學(xué)說，發(fā)展了酸堿理論，被后人稱為酸堿質(zhì)子理論或Brönsted-Lowry酸堿理論。他們認(rèn)為凡能釋放質(zhì)子的分子或離子（如：H2O，HCl，NH4+，HSO4 等）稱為酸，凡能接受質(zhì)子的分子或離子（如：H2O，NH3，Cl等）稱為堿。因此，一種酸釋放質(zhì)子后即成為堿，稱為該酸的共軛堿，同樣一種堿與質(zhì)子結(jié)合后，形成對應(yīng)的酸，稱為該堿的共軛酸。 AH B A BH 酸1 堿2 堿1

4、 酸2 酸1 是 堿1的共軛酸， 堿2 是 酸2 的共軛堿。 如鹽酸在水中的解離： HCl Cl H+ HCl是酸，Cl是它的共軛堿。 緩沖體系的設(shè)計(jì)： 強(qiáng)電解質(zhì)溶于水幾乎全部解離為正負(fù)離子，弱電解質(zhì)溶于水時(shí)，則不完全解離，只有部分的分子解離出正負(fù)離子，其馀以分子形式存在于溶液中。例如弱酸（HA）及其鹽溶于水時(shí)，只有部分HA解離為 H+ 和 A離子，其平衡方程式如下： K1 HA A H+ (1-1) K2 (1-2) (1-2)式兩邊取負(fù)對數(shù)： (1-3) (1-3)式中： HA 為弱酸的濃度 H+ 為HA解離出的氫離子濃度 A 為HA的共軛堿的離子濃度 K1 為酸解離的速度常數(shù) K2 為A

5、與H+ 締合的速度常數(shù) Ka 為反應(yīng)方程(1-1)達(dá)平衡時(shí)HA的解離平衡常數(shù) 現(xiàn)將HA的pKa 定義為 lg Ka，將HA溶液的pH定義為 logH+，   (1-3)式可寫為 ： (1-4) 或： ( 1-5) 方程(1-4)稱為：Henderson-Hassel-Balch方程，此方程對于生物化學(xué)學(xué)科，在理論與實(shí)踐上都具有重要意義。該方程表示了溶液pH與溶質(zhì)中可解離基團(tuán)pKa之間的關(guān)系。很明顯，當(dāng)AHA時(shí)： pH pKa這就意味著當(dāng)HA有一半解離時(shí)，溶液的pH等于 pKa，此弱酸堿緩沖體系的pKa即代表緩沖范圍的中點(diǎn)。一個(gè)緩沖體系的有效緩沖范圍，通常是在pKa值為中點(diǎn)的兩個(gè)pH單

6、位范圍內(nèi)，即：緩沖劑的有效pH范圍pKa±1，所以，當(dāng)緩沖溶液的pH等于該緩沖劑的pKa時(shí)，緩沖能力最大。若要設(shè)計(jì)一個(gè)新的緩沖體系時(shí)，只需按所要求的pH值查出pKa值等于此pH值的各種緩沖劑并從中進(jìn)行挑選即可。1960年，N.E.Good和他的同事們提出，適合生命科學(xué)研究使用的緩沖體系應(yīng)具有以下特性： pKa值在68之間； 在水中的溶解度高； 不易穿透生物膜； 鹽效應(yīng)??； 離子濃度、溶液組成和溫度對解離的影響??； 不與金屬離子生成復(fù)合物或沉淀； 該緩沖劑化學(xué)穩(wěn)定； 紫外和可見光波長范圍內(nèi)光吸收??； 易制得高純度的鹽。 按照這些要求可以設(shè)計(jì)和選擇最為合適的緩沖劑來配制所需的緩沖溶液。

7、7.2 生物化學(xué)常用緩沖液 磷酸鹽緩沖液 磷酸鹽是生物化學(xué)研究中使用最廣泛的一種緩沖劑，由於它們是二級解離，有二個(gè)pKa值，所以用它們配制的緩沖液，pH范圍最寬： NaH2PO4： pKa12.12， pKa27.21 Na2HPO4： pKa17.21， pKa212.32 配酸性緩沖液： 用 NaH2PO4，pH14， 配中性緩沖液： 用混合的兩種磷酸鹽，pH68， 配堿性緩沖液： 用 Na2HPO4，pH1012。 用鉀鹽比鈉鹽好，因?yàn)榈蜏貢r(shí)鈉鹽難溶，鉀鹽易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的緩沖液時(shí)，只能用磷酸鈉而不能用磷酸鉀，因?yàn)镾DS（十二烷基硫酸鈉）會(huì)與鉀鹽生成難溶的十二烷基

8、硫酸鉀。 磷酸鹽緩沖液的優(yōu)點(diǎn)為：容易配制成各種濃度的緩沖液；適用的pH范圍寬；pH受溫度的影響小；緩沖液稀釋后pH變化小，如稀釋十倍后pH的變化小于0.1。 其缺點(diǎn)為：易與常見的鈣Ca+離子、鎂Mg+離子以及重金屬離子締合生成沉淀；會(huì)抑制某些生物化學(xué)過程，如對某些酶的催化作用會(huì)產(chǎn)生某種程度的抑制作用。 Tris（三羥甲基氨基甲烷，N-Tris(hydroxymethyl)aminomethane）緩沖液 Tris緩沖液在生物化學(xué)研究中使用的越來越多，有超過磷酸鹽緩沖液的趨勢，如在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中已都使用Tris緩沖液，而很少再用磷酸鹽。 Tris緩沖液的常用有效pH范圍是在“中性”

9、范圍，例如： Tris-HCl緩沖液： pH7.58.5 Tris-磷酸鹽緩沖液： pH5.09.0 配制常用的緩沖液的方法有兩種：按書后附錄中所列該緩沖液表中的方法，分別配制0.05mol/L Tris和0.05mol/L HCl溶液，然后按表中所列體積混合。由于標(biāo)準(zhǔn)濃度的稀鹽酸不易配制，所以常用另一種方法；若配1L 0.1mol/L的Tris-HCl緩沖液：先稱12.11g Tris堿溶于950mL970mL 無離子水中，邊攪拌邊滴加4N HCl，用pH計(jì)測定溶液pH值至所需的pH值，然后再加水補(bǔ)足到1L。 Tris-HCl緩沖液的優(yōu)點(diǎn)是： 因?yàn)門ris堿的堿性較強(qiáng)，所以可以只用這一種緩沖

10、體系配制pH范圍由酸性到堿性的大范圍pH值的緩沖液；對生物化學(xué)過程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發(fā)生沉淀。其缺點(diǎn)是：緩沖液的pH值受溶液濃度影響較大，緩沖液稀釋十倍，pH值的變化大于0.1；溫度效應(yīng)大，溫度變化對緩沖液pH值的影響很大，即：pKa0.031 ，例如：4時(shí)緩沖液的pH8.4，則37時(shí)的pH7.4，所以一定要在使用溫度下進(jìn)行配制，室溫下配制的Tris-HCl緩沖液不能用于04。 易吸收空氣中的CO2，所以配制的緩沖液要蓋嚴(yán)密封。 此緩沖液對某些pH電極發(fā)生一定的干擾作用，所以要使用與Tris溶液具有兼容性的電極。 有機(jī)酸緩沖液 這一類緩沖液多數(shù)是用羧酸與它們的鹽配制而成，pH

11、范圍為酸性，即pH3.06.0，最常用的是甲酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等。 甲酸甲酸鹽緩沖液很有用，因其揮發(fā)性強(qiáng)，使用后可以用減壓法除之。乙酸乙酸鈉和檸檬酸檸檬酸鈉緩沖體系也使用的較多，檸檬酸有三個(gè)pKa值：pKa13.10， pKa24.75， pKa36.40。琥珀酸有二個(gè)pKa值：pKa14.18， pKa25.60。 有機(jī)酸緩沖液的缺點(diǎn)是：所有這些羧酸都是天然的代謝產(chǎn)物，因而對生化反應(yīng)過程可能發(fā)生干擾作用；檸檬酸鹽和琥珀酸鹽可以和過渡金屬離子（Fe3+、Zn+、Mg+等）結(jié)合而使緩沖液受到干擾；這類緩沖液易與Ca+離子結(jié)合，所以樣品中有Ca+離子時(shí)，不能用這類緩沖液。 硼酸鹽緩沖液 常用

12、的有效pH范圍是：pH8.510.0，因而它是堿性范圍內(nèi)最常用的緩沖液，其優(yōu)點(diǎn)是配制方便，只使用一種試劑，缺點(diǎn)是能與很多代謝產(chǎn)物形成絡(luò)合物，尤其是能與糖類的羥基反應(yīng)生成穩(wěn)定的復(fù)合物而使緩沖液受到干擾。 氨基酸緩沖液 此緩沖液使用的范圍寬，可用于pH=2.011.0，例如最常用的有： 甘氨酸HCl緩沖液：pH=2.05.0， 甘氨酸NaOH緩沖液：pH=8.011.0， 甘氨酸Tris緩沖液：pH=8.011.0，（此緩沖液用于廣泛使用的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的電極緩沖液）， 組氨酸緩沖液：pH=5.56.5， 甘氨酰胺（glycine amide）緩沖液：pH=7.88.8， 甘氨酰甘氨酸（

13、glycylglycine）緩沖液：pH=8.09.0。 此類緩沖體系的優(yōu)點(diǎn)是：為細(xì)胞組份和各種提取液提供更接近的天然環(huán)境。其缺點(diǎn)是：與羧酸鹽和磷酸鹽緩沖體系相似，也會(huì)干擾某些生物化學(xué)反應(yīng)過程，如代謝過程等。試劑的價(jià)格較高。 兩性離子緩沖液（Zwitterionic buffers），又稱Goods緩沖液1960年，N.E.Good和他的同事們總結(jié)了現(xiàn)有的各種緩沖試劑的優(yōu)缺點(diǎn)后認(rèn)為，必須用人為設(shè)計(jì)和人工合成的方法來找到專門用于生命科學(xué)研究的特定的緩沖體系，這些緩沖體系應(yīng)具有前面所述的九條要求和特性。他們合成的一系列Goods緩沖液可查閱有關(guān)的資料。Goods緩沖液的主要優(yōu)點(diǎn)是不參加和不干擾生物

14、化學(xué)反應(yīng)過程，對酶化學(xué)反應(yīng)等無抑制作用，所以它們專門用于細(xì)胞器和極易變性的、對pH敏感的蛋白質(zhì)和酶的研究工作。其缺點(diǎn)是：價(jià)格昂貴，對測定蛋白質(zhì)含量的雙縮脲法和Lowry法不適用，因?yàn)樗鼈儠?huì)使空白管的顏色加深。常用緩沖溶液的配制方法1 甘氨酸鹽酸緩沖液（0.05mol/L）X毫升0.2 mol/L甘氨酸+Y毫升0.2 mol/L HCI，再加水稀釋至200毫升pHXYpHXY2.02.42.62.85050505044.032.424.216.83.03.23.43.65050505011.48.26.45.0甘氨酸分子量 = 75.07，0.2 mol/L甘氨酸溶液含15.01克/升。

15、0;2鄰苯二甲酸鹽酸緩沖液（0.05 mol/L）X毫升0.2 mol/L鄰苯二甲酸氫鉀 + 0.2 mol/L HCl，再加水稀釋到20毫升pH(20)XYpH(20)XY2.22.42.62.83.0555554.0703.9603.2952.6422.0223.23.43.63.855551.4700.9900.5970.263鄰苯二甲酸氫鉀分子量 = 204.23，0.2 mol/L鄰苯二甲酸氫溶液含40.85克/升 3磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液pH0.2mol/L Na2HPO4（毫升）0.1mol/L檸檬酸（毫升）pH0.2mol/L Na2HPO4 （毫升）0.1mol/L

16、檸檬酸（毫升）2.22.42.62.83.03.23.43.63.84.04.24.44.64.85.00.401.242.183.174.114.945.706.447.107.718.288.829.359.8610.3010.6018.7617.8216.8315.8915.0614.3013.5612.9012.2911.7211.1810.6510.149.705.25.45.65.86.06.26.46.66.87.07.27.47.67.88.010.7211.1511.6012.0912.6313.2213.8514.5515.4516.4717.3918.1718.7319.

17、1519.459.288.858.407.917.376.786.155.454.553.532.611.831.270.850.55Na2HPO4分子量 = 14.98，0.2 mol/L溶液為28.40克/升。Na2HPO4·2H2O分子量 = 178.05，0.2 mol/L溶液含35.01克/升。C4H2O7·H2O分子量 = 210.14，0.1 mol/L溶液為21.01克/升。 4檸檬酸氫氧化鈉-鹽酸緩沖液pH鈉離子濃度（mol/L）檸檬酸（克）C6H8O7·H2O氫氧化鈉(克)NaOH 97%鹽酸（毫升）HCl（濃）最終體積（升）2.23

18、.13.34.35.35.86.50.200.200.200.200.350.450.3821021021021024528526684838383144186156160116106456810512610101010101010     使用時(shí)可以每升中加入1克克酚，若最后pH值有變化，再用少量50% 氫氧化鈉溶液或濃鹽酸調(diào)節(jié)，冰箱保存。5檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液（0.1 mol/L）pH0.1   mol/L檸檬酸（毫升）0.1   mol/L檸檬酸鈉（毫升）pH0.1   mol/

19、L檸檬酸（毫升）0.1   mol/L檸檬酸鈉（毫升）3.03.23.43.63.84.04.24.44.64.818.617.216.014.914.013.112.311.410.39.21.42.84.05.16.06.97.78.69.710.85.05.25.45.65.86.06.26.46.68.27.36.45.54.73.82.82.01.411.812.713.614.515.316.217.218.018.6檸檬酸C6H8O7·H2O：分子量210.14，0.1 mol/L溶液為21.01克/升。檸檬酸鈉Na3 C6H5O7·2H2

20、O：分子量294.12，0.1 mol/L溶液為29.41克/毫升。 6乙酸乙酸鈉緩沖液（0.2 mol/L） pH(18)0.2   mol/L NaAc(毫升)0.3   mol/L HAc(毫升) pH(18)0.2   mol/LNaAc(毫升)0.3   mol/LHAc(毫升)2.63.84.04.24.44.60.751.201.802.653.704.909.258.808.207.356.305.104.85.05.25.45.65.85.907.007.908.60

21、9.109.404.103.002.101.400.900.60Na2Ac·3H2O分子量 = 136.09，0.2 mol/L溶液為27.22克/升。7磷酸鹽緩沖液（1）磷酸氫二鈉磷酸二氫鈉緩沖液（0.2） pH0.2   mol/L Na2HPO4(毫升)0.3   mol/L NaH2PO4(毫升) pH0.2   mol/L Na2HPO4(毫升)0.3   mol/L NaH2PO4(毫升)5.85.96.06.16.26.36.46.56.66.76.86.98.010.0

22、12.315.018.522.526.531.537.543.549.555.092.090.087.785.081.577.573.568.562.5 56.551.045.07.07.17.27.37.47.57.67.77.87.98.061.067.072.077.081.084.087.089.591.593.094.739.033.028.023.019.016.013.010.58.57.05.3Na2HPO4·2H2O分子量 = 178.05，0.2 mol/L溶液為85.61克/升。Na2HPO4·12H2O分子量 = 358.22，0.2 mol/L溶液

23、為71.64克/升。NaH2PO4·2H2O分子量 = 156.03，0.2mol/L溶液為31.21克/升。（2）磷酸氫二鈉磷酸二氫鉀緩沖液（1/15 mol/L）pHmol/L/15Na2HPO4(毫升)mol/L/15KH2PO4(毫升)pHmol/L/15Na2HPO4(毫升)mol/L/15KH2PO4(毫升)4.925.295.916.246.476.646.816.980.100.501.002.003.004.005.006.009.909.509.008.007.006.005.004.007.177.387.738.048.348.678.187.008.009.

24、009.509.759.9010.003.002.001.000.500.250.100Na2HPO4·2H2O分子量 = 178.05，1/15M溶液為11.876克/升。KH2PO4分子量 = 136.09，1/15M溶液為9.078克/升。 8磷酸二氫鉀氫氧化鈉緩沖液（0.05M）X毫升0.2M K2PO4 + Y毫升0.2N NaOH加水稀釋至29毫升 pH(20)X (毫升)Y（毫升）pH(20)X (毫升)Y（毫升）5.86.06.26.46.66.85555550.3720.5700.8601.2601.7802.3657.07.27.47.67.88.055

25、55552.9633.5003.9504.2804.5204.680 9巴比妥鈉-鹽酸緩沖液（18）pH0.04M巴比妥鈉溶液0.2V鹽酸pH0.04M巴比妥鈉溶液(毫升)0.2N鹽酸(毫升)6.87.07.27.47.67.88.08.210010010010010010010010018.417.816.715.313.411.479.397.218.48.68.89.09.29.49.61001001001001001001001005.213.822.521.651.130.700.35巴比妥鈉鹽分子量=206.18;0.04M溶液為8.25克/升 10Tris鹽酸

26、緩沖液（0.05M，25）50毫升0.1M三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液與X毫升0.1N鹽酸混勻后，加水稀釋至100毫升。pHX(毫升)pHX(毫升)7.107.207.307.407.507.607.707.807.908.0045.744.743.442.040.338.536.634.532.029.28.108.208.308.408.508.608.708.808.9026.222.919.917.214.712.410.38.57.0三羥甲基氨基甲烷（Tris）HOCH2 CH2OH CHOCH2 NH2分子量=121.14;0. 1M溶液為12.114克/升。Tris溶液可從空

27、氣中吸收二氧化碳，使用時(shí)注意將瓶蓋嚴(yán)。 11硼酸硼砂緩沖液（0.2M硼酸根）pH0.05M硼砂（毫升）0.2M硼砂（毫升）pH0.05M硼砂（毫升）0.2M硼酸（毫升）7.47.67.88.01.01.52.03.09.08.58.07.08.28.48.79.03.54.56.08.06.55.54.02.0硼砂Na2B4O7·H2O,分子量=381.43;0.05M溶液（=0.2M硼酸根）含19.07克/升。硼酸H2BO3,分子量=61.84,0.2M溶液為12.37克/升。硼砂易失去結(jié)晶水，必須在帶塞的瓶中保存。 11硼酸-硼砂緩沖液（0.2M硼酸根）pH0

28、.05M硼砂（毫升）0.2M硼酸（毫升）pH0.05M硼砂（毫升）0.2M硼酸（毫升）7.47.67.88.01.01.52.03.09.08.58.07.08.28.48.79.03.54.56.08.06.55.54.02.0硼砂Na2B4O7·10H2O,分子量=381.43;0.05M溶液（=0.2M硼酸根）含19.07克/升。硼酸H2BO3，分子量=61.84, 0.2M溶液為12.37克/升。硼砂易失去結(jié)晶水，必須在帶塞的瓶中保存。 12甘氨酸氫氧化鈉緩沖液（0.05M）X毫升0.2M甘氨酸+Y毫升0.2NnaOH加水稀釋至200毫升pHXYpHXY8.68.8

29、9.09.29.450505050504.06.08.812.016.89.69.810.010.410.6505050505022.427.232.038.645.5甘氨酸分子量=75.07;0.2M溶液含15.01克/升。 13硼砂-氫氧化鈉緩沖液（0.05M硼酸根）X毫升0.05M硼砂+Y毫升0.2NNaOH加水稀釋至200毫升pHXYpHXY9.39.49.65050506.011.023.09.810.010.150505034.043.046.0硼砂Na2B4O7·10H2O,分子量=381.43;0.05M溶液為19.07克/升。 14碳酸鈉-碳酸氫

30、鈉緩沖液（0.1M）Ca2+、Mg2+存在時(shí)不得使用pH0.1MNa2CO3(毫升)0.1MN2HCO3(毫升)20379.169.409.519.789.9010.1410.2810.5310.838.779.129.409.509.729.9010.0810.2810.57123456789987654321Na2CO2·10H2O分子量=286.2;0.1M溶液為28.62克/升。N2HCO3分子量=84.0;0.1M溶液為8.40克/升。 15“PBS”緩沖液PH7.67.47.27.0H2ONaClNa2HPO4NaH2PO410008.52.20.110008.

31、52.20.210008.52.20.31000ml8.5g2.2g0.4g16.伯瑞坦-羅比森緩沖溶液Britton-Robinson緩沖溶液 別名：B-R緩沖溶液，B-R緩沖液英文名：Britton-Robinson Buffer Solution（伯瑞坦-羅比森緩沖溶液）在100ml三酸混合液（磷酸、乙酸、硼酸，濃度均為0.04mol/L）中，加入表中指定體積的0.2mol/LNaOH，即得表中相應(yīng)PH值的緩沖溶液。pHNaOH（ml）pHNaOH（ml）pHNaOH（ml）1.810.005.0235.09.1570.01.892.55.3337.59.3772.51.985.05.7240.09.6275.02.097.56.0942.59.9177.52.211