飲料中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(DBS610007-2015)

1、 DBS61陜 西 省 食 品 安 全 地方標(biāo)準(zhǔn)DB S61/00072015飲料中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法Determination of 4-(5-)-methylimidazole and 2-methylimidazole in beverage by Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometric method 2015 - 02-28發(fā)布2015 -03 -28實(shí)施陜西省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布DBS61/00072015前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1-2009給出的規(guī)則起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉

2、及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B均為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由陜西省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)陜西出入境檢驗(yàn)檢驗(yàn)局提出并起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：張璐、何強(qiáng)、鄒陽(yáng)、李瑩、付騁宇、孔祥虹、李建華、吳雙民。本標(biāo)準(zhǔn)屬首次發(fā)布。飲料中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飲料中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）的檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于碳酸飲料、特殊用途飲料、茶飲料、咖啡飲料等中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的測(cè)定。2 規(guī)范性引用文件 下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日

3、期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3 原理 試樣中的4-甲基咪唑和2-甲基咪唑經(jīng)水溶解或稀釋，振蕩后，陽(yáng)離子固相萃取柱（MCX）凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。4 試劑與材料除非另有說(shuō)明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和GB/T6682中規(guī)定的一級(jí)水。4.1 標(biāo)準(zhǔn)品：4-甲基咪唑（CAS：822-36-6， C4H6N2）和2-甲基咪唑（CAS：693-98-1， C4H6N2）含量均 98.0 %。4.2 內(nèi)標(biāo)物：氘代4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)品：含量 99.0

4、%。4.3 甲醇：色譜純。4.4 乙腈：色譜純。4.5 甲酸：色譜純。4.6 甲酸銨。4.7 氨水。4.8 MCX固相萃取柱：60 mg/3mL，或相當(dāng)者。4.9 甲酸水溶液（2 %）：準(zhǔn)確量取2 mL甲酸和98 mL水，混合后備用。4.10 氨水甲醇溶液（5 %）：準(zhǔn)確量取5 mL氨水和95 mL甲醇，混合后備用。4.11 甲酸銨溶液（5 mmol/L）：準(zhǔn)確稱取0.0945 g甲酸銨溶解于300 mL水中，混合后備用。4.12 乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液（9:1, V/V）：準(zhǔn)確量取90 mL乙腈和10 mL 5 mmol/L甲酸銨（4.11）,混合備用。4.13 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 m

5、g/mL）：分別準(zhǔn)確稱取4-甲基咪唑和2-甲基咪唑各10 mg，用甲醇溶解定容至10 mL，搖勻，0 4 避光保存，有效期1年。4.14 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（1 mg/mL）：準(zhǔn)確稱取氘代4-甲基咪唑10 mg，用甲醇溶解定容至10 mL，搖勻，0 4 避光保存，有效期1年。4.14 混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（1 mg/mL）： 分別準(zhǔn)確量取1 mg/mL 4-甲基咪唑和2-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各0.025 mL，于25 mL容量瓶中，用乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液（4.12）溶解，定容于25 mL，0 4 避光保存，有效期6個(gè)月。4.15 氘代4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(1 mg/mL) ：準(zhǔn)確量取1 mg

6、/mL氘代4-甲基咪唑內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液0.025 mL，于25 mL容量瓶中，用甲醇溶液，定容于25 mL，0 4 避光保存，有效期6個(gè)月。4.16 混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：根據(jù)需要，臨時(shí)吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（4.14）和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（4.15），用乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液（4.12）稀釋配制適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，每毫升混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中含有氘代4-甲基咪唑?yàn)?.01 mg。5 儀器與設(shè)備5.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源。5.2 分析天平：感量0.01 mg。 5.3 天平：感量0.01 g。5.4 振蕩器5.5 渦旋混勻器5.6 離心機(jī)5.7 固相萃取裝置5.8

7、氮吹儀5.9 聚四氟乙烯離心管：15 mL。5.10 濾膜：0.22 mm。 6 試樣制備與保存取有代表性試樣500 g，混合均勻，裝入潔凈容器中，密閉并標(biāo)明標(biāo)記，冷藏保存。7 測(cè)定步驟7.1 提取準(zhǔn)確稱取試樣3 g（精確至0.01 g），于15 mL離心管中，加入氘代4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（4.15）100 mL，用水溶解或稀釋，定容至10 mL，振蕩10 min。4500 r/min下離心5 min，待凈化。7.2 凈化MCX固相萃取柱依次用甲醇3 mL和水5 mL活化，取待凈化液過(guò)柱，控制流速1滴/34 s，依次用2 %甲酸水溶液（4.9）5 mL和甲醇5 mL淋洗，再用5 %氨水甲醇

8、溶液（4.10）9 mL洗脫，收集洗脫液，于40 氮?dú)獯蹈?。用乙?5 mmol/L甲酸銨溶液（4.12）1 mL溶解殘?jiān)?，渦旋混勻，濾膜（5.10）過(guò)濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。7.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備準(zhǔn)確量取1 mg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液和1 mg/mL氘代4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)中間溶液適量，用乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液（4.12）稀釋，配制成9.0，15.0，50.0，100.0，500 .0 mg/L系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，其中氘代4-甲基咪唑濃度為10 mg/L，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。以目標(biāo)化合物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和

9、相關(guān)系數(shù)。7.4 測(cè)定7.4.1 液相色譜條件色譜柱：HILIC （2.1×100 mm，1.7 mm）, 或相當(dāng)者；柱溫：40 ；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：2.0 mL; 流動(dòng)相：乙腈+5 mmol/L甲酸銨溶液（9+1，V/V），等度洗脫；7.4.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源;掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)；電離電壓：2.9 kV；離子源溫度： 115 ；脫溶劑氣溫度：350 ；脫溶劑氣：600 L/h；錐孔氣：50 L/h；定性、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓和碰撞電壓見(jiàn)表1表1a 4-甲基咪唑和2-甲基咪唑定性、定量離子對(duì)和錐孔電壓及碰撞電壓化合物定性離

10、子對(duì)定量離子錐孔電壓碰撞電壓4-甲基咪唑（4-Mel）82.9/42.182.9/55.9301582.9/55.9142-甲基咪唑（2-Mel）82.9/42.182.9/42.1371482.9/55.914氘代4-甲基咪唑（4-Mel-d6）88.0/60.188.0/60.13015a對(duì)于不同質(zhì)譜儀器，儀器參數(shù)可能存在差異，測(cè)定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。非商業(yè)性聲明：表1所列參數(shù)是在Waters ACQUITY UPLC-Quattro Premier質(zhì)譜儀完成的，此處列出的實(shí)驗(yàn)用儀器僅是為了提供參考，并不涉及商業(yè)目的，鼓勵(lì)標(biāo)準(zhǔn)使用者嘗試不同型號(hào)的儀器。7.4.3 測(cè)定法按照7.4.1

11、和7.4.2液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件測(cè)定試樣和混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（4.16），按內(nèi)標(biāo)法以峰面積比計(jì)算?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)使用溶液及試樣溶液中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑和氘代4-甲基咪唑的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍之內(nèi)。試樣溶液中的離子對(duì)相對(duì)豐度與混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液的離子相對(duì)豐度比符合表2的要求。在上述色譜條件下4-甲基咪唑和2-甲基咪唑參考保留時(shí)間分別為1.96 min和2.63 min。標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子流圖參見(jiàn)附錄A中圖A.1。表2 試樣溶液中離子相對(duì)豐度的允許偏差范圍相對(duì)豐度（%）50 2050102010允許偏差（%）±20±25±30±507.5 空白試驗(yàn)除不

12、加試樣外，均按上述測(cè)定條件和步驟進(jìn)行。8 結(jié)果計(jì)算和表達(dá)計(jì)算或峰面積比值，標(biāo)準(zhǔn)曲線校正。其中：4-甲基咪唑定量離子對(duì)峰面積； 2-甲基咪唑定量離子對(duì)峰面積；氘代4-甲基咪唑峰離子對(duì)面積；由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：求得和，則試樣中4-甲基咪唑或2-甲基咪唑殘留量（mg/kg）：按下式計(jì)算： 式中： 混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液中4-甲基咪唑或2-甲基咪唑的峰面積；混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液中內(nèi)標(biāo)氘代4-甲基咪唑的峰面積；混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液中內(nèi)標(biāo)氘代4-甲基咪唑的濃度，單位為微克每升，mg/L；混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液中4-甲基咪唑或2-甲基咪唑，單位為微克每升，mg/L；試樣中4-甲基咪唑或2-甲基咪唑的濃度，單位為微克每升，mg/L；

13、試樣中4-甲基咪唑或2-甲基咪唑的峰面積；試樣中內(nèi)標(biāo)氘代4-甲基咪唑的峰面積；試樣中待分析物的殘留量，單位為微克每千克（mg/kg）； 溶解殘余物的體積，單位為毫升，mL；試樣質(zhì)量，單位為克，g。注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。9 定量限、回收率和精密度9.1 定量限本方法對(duì)4-甲基咪唑、2-甲基咪唑的定量限均為10.0 mg /kg。9.2 回收率碳酸飲料、特殊用途飲料、茶飲料、咖啡飲料中4-甲基咪唑、2-甲基咪唑的回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)附錄B.1，在10.075.0 mg/kg添加濃度水平上的回收率范圍為88.8 %119.9 %。9.3 精密度本

14、方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差10 %。附 錄 A（資料性附錄）圖A.1 4-甲基咪唑（4-Mel）、2-甲基咪唑（2-Mel）和氘代4-甲基咪唑（4-Mel-d6）的選擇離子色譜圖（10 mg/kg）附 錄 B（資料性附錄）4-甲基咪唑和2-甲基咪唑殘留檢測(cè)的添加回收率數(shù)據(jù)表B.1 碳酸飲料、特殊用途飲料、茶飲料、咖啡飲料中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑添加濃度及回收率（n=5）樣品化合物添加水平 （mg/kg）回收率（%）碳酸飲料4-甲基咪唑1089.095.02598.4119.950105.2111.77595.0112.42-甲基咪唑1092.596.12588.4104.45099.4104.475