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1、目 錄摘要 3關鍵詞 30 引言31 生防微生物的分類31.1 生防微生物種類31.1.1 生防細菌31.1.2 放線菌41.1.3 生防真菌41.1.4 生防病毒41.2 微生態(tài)系分類41.2.1 根際微生物41.2.2 氣（葉）圍微生物41.2.3 內生微生物52 生防微生物的作用機制52.1 產生次級代謝產物52.2 誘導植物產生ISR52.3 促進養(yǎng)分和水分吸收，提高植物的抗逆能力62.4 競爭生態(tài)位和營養(yǎng)物質63 生防微生物的應用63.1 蘇云金芽孢桿菌基因工程及應用63.2 熒光假單胞菌用于植物病害生物防治73.3昆蟲真菌的遺傳改良73.4新型病害生防制劑Harpin的開發(fā)74 生

2、防微生物展望8參考文獻9生防微生物的研究進展摘要：由于化學農藥的大量使用，帶來了嚴重的環(huán)境污染，所以生防微生物越來越受到大家的重視。主要介紹了生防微生物的種類、生防微生物的作用機理和生防微生物在農業(yè)上的應用，以及國內外對生防微生物的研究現(xiàn)狀，并展望了生防微生物的發(fā)展前景。關鍵詞：生防微生物；生物防治；內生微生物；研究進展0 引言 早在2000多年前，我國西漢時就有關于各種有益微生物防治土傳病的記載，記載中將一些動物骨頭研碎，用水煮開，存放若干天，然后將動物糞同自然發(fā)酵的骨汁混合搗亂成糊狀，在把種子拌入，晾干，待天氣暖和，再次拌種，使種子外面附上一層厚厚的骨糞層，再次晾干，即可播種。種子經拌種后

3、，莊稼產量是平常的十倍。在20世紀50年代，用于防病的生防菌產品有5406、G4、1013等，5406在我國應用面積達670萬hm2 ，是當時的世界記錄。國際上20世紀七八十年代興起的“促進植物生長的根細菌”統(tǒng)稱為PGPR（plant growth promoting rhizobacteria），多半用熒光假單胞菌，現(xiàn)在也轉向使用各種微生物1。據(jù)統(tǒng)計，目前已知的細菌有4800種，估計可能有4萬種，已知種只占12%；已知真菌7萬種，估計有150萬種，已知種只占5%，如此豐富的微生物資源，為人類篩選、利用各種生防微生物提供了前提2。生防微生物的應用是植物病蟲害綜合治理的重要手段，是保護生態(tài)環(huán)境，

4、實現(xiàn)農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有力保證。通過自然菌株選育開發(fā)微生物農藥已有久遠的歷史，對于農業(yè)生產的發(fā)展起到了重要作用。1 生防微生物的分類1.1 生防微生物種類自然界微生物能占有各種空間和生境（habitat）包括動植物，一株植物從幼苗到結果，其根際、體表與體內都存在著各種真菌、細菌、病毒、類菌原體和原生動物。除少數(shù)病原物以外，絕大部分不是致病菌甚至是有益的正常菌落，大致有以下幾類。1.1.1 生防細菌用于防治各種植物病害的拮抗性細菌，常見的有：假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、土壤桿菌屬、無定形孢囊菌屬、節(jié)桿菌屬、產堿桿菌屬、固氮菌屬、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、黃干菌屬、哈夫尼菌屬、巴斯德芽菌屬、根瘤菌屬、沙雷氏

5、菌屬、和黃單胞菌屬。已開發(fā)成生防農藥的生防細菌有假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、土壤桿菌屬等。1.1.2 放線菌放線菌是抗生素等一系列生物活性物質的重要生產者。目前世界上報道的上萬種抗生素中，70%上是由放線菌產生的，且臨床上使用的抗生素有三分之二來自放線菌。放線菌產生的抗生素在農作物病蟲害防治方面也有重要作用，有的放線菌還有除草活性。應用廣泛的有：鏈霉菌屬、羅卡氏菌屬、小單胞菌屬。1.1.3 生防真菌1908年，M.C.Potter 首次報道植物病原菌可被其自身代謝產物所抑制。之后，人們相繼證實了土壤中木霉菌、青霉菌、曲霉菌以及鏈霉菌等可以產生抗生物質，也認識到真菌對防治有害生物的重要性。近年來，有

6、些真菌類生物殺菌劑已相繼問世，并廣泛用于生產。生防真菌的種類繁多，目前常見的主要有木霉菌、毛殼菌、內生真菌、酵母菌、腐霉菌等。1.1.4 生防病毒 昆蟲病毒防治害蟲最早開始于20世紀30年代，用核型多角體病毒防治歐洲云杉葉蜂等膜翅目葉蜂類森林害蟲的防治，隨著應用病毒防治森林害蟲的成功，進一步引起了對其他害蟲防治效果的研究。從20世紀70年代初，桿狀病毒就被WHO推薦為一種安全的生物殺蟲劑用于害蟲防治。目前開發(fā)成商品的有美洲棉鈴蟲NPV、甜菜夜蛾NPV、菜青蟲GV、斜紋夜蛾NPV、馬尾松毛蟲CPV和蟑螂DNV等。1.2 微生態(tài)系分類植物微生態(tài)系的微生物基本上可以分為兩大類，即習居菌和暫居菌。植物

7、不同的體表空間及其體內各組織中都有習居菌和暫居菌，這種微生物組成的特異性是在共同進化中行成的。習居菌是固定的經常生活在植物體的一些種群，故又稱常駐菌或原籍菌。暫居菌是偶爾闖入或者人為引進的，又稱引進菌或外籍菌。而微生物在生態(tài)系統(tǒng)中的分布可以分為根際微生物、氣（葉）圍微生物、內生微生物等。1.2.1 根際微生物 1904年德國微生物學家Lorenz Hiltner提出了根際概念，他將根際定為根際周圍、受根際影響的土體。而將根際土壤區(qū)域的微生物種群統(tǒng)稱為根際微生物3。根際微生物以細菌為主，并且是革蘭氏陰性菌占優(yōu)勢。常見的有假單胞菌、黃桿菌、產堿桿菌、土壤桿菌和色桿菌等。1.2.2 氣（葉）圍微生物

8、 Blackman在1981年把葉圍微生物的概念引入微生物生態(tài)學。葉圍微生物又可以稱之為葉表微生物，葉面微生物，指的是附生或寄生于植物葉部周圍的微生物4。姜廣華等曾對華東地區(qū)為主的29科38屬42種種子植物葉圍煤污菌進行了研究，其中，屬于煤污菌11種；出芽短梗霉、芽枝狀枝孢、多主枝孢、大孢枝孢、鏈格孢、煙長殼色孢等5。不同地區(qū)植物上煤污菌種群組合不盡相同，不同植物上的優(yōu)勢種也不盡相同。1.2.3 內生微生物 內生微生物多指內生菌是指生活在植物體內，通常被宿主細胞膜包圍或是細胞機制包圍，與宿主植物互惠共生，不表現(xiàn)植物病害特征的一類菌，包括真菌和細菌。內生菌不僅存在高等植物之中，也存在低等的孢子植

9、物如苔蘚、蕨類和地衣中。初步統(tǒng)計，在植物體內存在的微生物有15%是有益的，有15%是有害的，有7%利害不明顯，“益”和“害”之間沒有絕對界線，在適當?shù)谋壤秶鷥炔粫斐晌：Γ瑢僬＞?。按照內生菌在植物體內存在方式，可以將其分為幾類:永久內生菌，暫時內生菌，兼性內生菌，專性內生菌，非專性內生菌，定點內生菌。2 生防微生物的作用機制生防微生物的作用機制一般有產生抗生素、酶類物質或植物激素、誘導植物產生ISR空間和營養(yǎng)競爭等。2.1 產生次級代謝產物生防微生物能產生一些次生物質，包括一些抗生素類物質、水解酶類、植物激素等。這些物質對植物抵抗病菌侵入、潛伏、擴展和蔓延都是非常重要的?？股仡愇镔|。

10、抗生素是一類異源小分子化合物，在低濃度下可以對微生物的生長或代謝產生影響。在植物病害的生物防治中根部定殖的細菌產生的抗生素起著很重要的作用?？股刂饕p乙酰藤黃酚（Phl）、吩嗪羧酸（PCA）、藤黃綠膿素（pyolterin）、吡咯菌素（pyrolnitrin）、HCN和丁酸內脂根際內生菌產生的一類鼠李糖脂生物表面活性劑物質，破壞腐霉菌卵孢子的原生質膜，引起卵孢子細胞壁的水解破裂，Bacillus strains能產生一些脂多肽類抗生素對植物根部病害有顯著的抑制作用7。產生水解酶類和促生物質。生防微生物另一個重要的生防機制就是水解酶類，其分泌的酶對物質進行降解，即可給植物提供營養(yǎng)，又可減少

11、植物病害的發(fā)生。單胞桿菌可產生包括幾丁質在類的多種酶，幾丁質酶具有分解真菌細胞壁的特性。目前某些生防菌幾丁質酶基因已經被完全克隆，可以將此基因轉到內生細菌中，發(fā)揮內生細菌的優(yōu)勢，提高防病效果8。用內生細菌防治棉花枯萎病，可能產生某些蛋白酶降解毒素或產生抑制物抑制病菌產生致病因子達到防病的效果。2.2 誘導植物產生ISRVan認為根際定殖的細菌能誘導植物產生一種不同于傳統(tǒng)SAR（systemic acquired resistance）的另一種抗性，將其命名為根際細菌誘導抗性即ISR。其表型與病菌誘導的系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）相似。根際細菌調控誘導的系統(tǒng)抗性對許多植物如豆類、黃瓜等上的真菌、細菌

12、、病毒有抵抗作用。用內生菌Bacillus pumilus SE34接種基因轉化豌豆，然后接種病毒，雖然細菌和真菌相互接觸，真菌菌絲和細菌在根表相互作用，真菌仍保持旺盛生長而且能穿透根皮層，因此 保護機制不能依靠直接的根圍拮抗9。一些根部定殖的假單胞菌則表現(xiàn)的是另外一種誘導抗病性，如水楊酸的積累被認為是引發(fā)植物抗病基因表達的重要因素，在P.aeruginosa中水楊酸生物合成的基因pchA和pchB已被克隆，各自編碼鄰-香豆酸-丙酮酸裂解酶，均為pchDCB操縱子的一部分，這兩種酶在離體情況下或在原位均能催化鄰-香豆酸轉變?yōu)樗畻钏?。另一類脂多糖也是重要的誘導物，其誘導系統(tǒng)抗性的可能機制為產生抗

13、微生物的低分子量化學物質，如植物保衛(wèi)素、木質素和富含羥脯氨酸的糖蛋白10。誘導一些水解酶和氧化酶類，如幾丁質酶、葡聚糖酶和過氧化物酶，誘導病程相關蛋白的產生等。2.3 促進養(yǎng)分和水分吸收，提高植物的抗逆能力一些生防細菌能幫助植物吸收營養(yǎng)，如內生固氮菌，某些固氮菌能提供植物高達80%的氮量。分離自松樹根組織中Bacillus strain（pw2）具有固氮酶活性，并且較容易的定殖松樹根內11。內生菌在非常惡劣的自然環(huán)境中通過增加多年生樹木生理可塑性，在維持森林生態(tài)系統(tǒng)中可能也發(fā)揮重要作用。根際內生細菌能產生某些物質刺激VA菌根孢子提前萌發(fā)，參與植物的養(yǎng)分運輸，提高植物抗干旱、鹽堿等能力。微生物對

14、一些難容性無機物的轉化和分解有機質改善植物營養(yǎng)從而能提高植物的抗病能力。國內外學者已將一些假單胞菌研制成無機磷細菌肥料施于土壤，轉化難溶性無極磷，并對優(yōu)良菌株的分離與有關功能機理進行了研究。根際土壤有機磷細菌主要為假單胞菌屬，無機磷主要為假單胞菌屬和歐文氏菌屬。Annette Deubel等研究證明，PsIA12 分解葡萄糖比分解果糖、木糖、阿拉伯糖和乳糖對植物根際溶磷的能力高12。Miroslav Vosdtka等研究假單胞菌P.putida與Glomus fistulosum相互關系發(fā)現(xiàn)，假單胞菌培養(yǎng)物中低分子量的提取物能促進Glomus fistulosum生長和磷酸脂酶產生，假單胞菌可

15、明顯促進玉米生長和提高根內磷酸酶活性，其培養(yǎng)物能促進馬鈴薯和玉米生長，減少病害發(fā)生13。2.4 競爭生態(tài)位和營養(yǎng)物質 微生物之間競爭包括營養(yǎng)競爭和位點競爭，微生物的強競爭能力是發(fā)揮生物防治作用的關鍵，而微生物在根內的成功定殖才能真正發(fā)揮生物防治的價值，某些生物防治細菌生長速度很快，可以很快占領根圍空間，使致病菌侵染時缺少靶位點。一些根際定殖內生細菌能產生噬鐵素與病菌競爭鐵元素，如假單胞菌JKIY2在無鐵的環(huán)境下能分泌高親和力鐵的載體，在低鐵條件下鐵載體的分泌量減少，而在富鐵環(huán)境下則不能分泌鐵載體，故擁有一種對異源噬鐵素的受體，能在根際獲得競爭優(yōu)勢14。病原微生物本身不能產生噬鐵素或產生很少，所

16、產生的噬鐵素也被假單胞菌所利用，而假單胞菌能產生噬鐵素，并且不被病原微生物所利用，這樣病原微生物由于缺鐵而不能生長繁殖。3 生防微生物的應用3.1 蘇云金芽孢桿菌基因工程及應用蘇云金芽孢桿菌（Bt）制劑是目前國內外產量最大、應用范圍最廣的微生物殺蟲劑。Bt殺蟲作用的主要機制是在其生長過程中產生不同類型的殺蟲晶體蛋白（ICPs）。自1981年Schnepf分離了第一個cry基因以來 ，迄今全世界從Bt中發(fā)現(xiàn)并正式命名的ICP基因已有42大類，總數(shù)超過250種。在國家863計劃的支持下，近年我國Bt分子生物學的研究發(fā)展迅速。1997以來已經克隆了28種ICP基因，占同期國際新記載Bt基因總數(shù)的1/

17、3。除ICP以外，Bt以及蠟樣芽孢桿菌營養(yǎng)生長階段產生的另一種殺蟲蛋白VIP亦引起了廣泛注意，有的Vip基因對一些重要農業(yè)害蟲更顯特異性，因而具有很大的開發(fā)應用潛力15。為了進一步提高Bt的殺蟲效果，如延長持效期、擴大殺蟲譜等，可以通過殺蟲基因的修飾、改造、轉移等基因工程手段構建新型的工程菌。在國外，已有Conder、MVP等10余種Bt工程菌制劑投入了商業(yè)應用。在我國，也開發(fā)出多種高效Bt和熒光假單胞菌的組合基因工程菌劑，其中WG001已于2000年通過安全性審批，允許生產和應用16。3.2 熒光假單胞菌用于植物病害生物防治假單胞菌屬中的一些種，尤其是熒光假單胞菌（Pseudomonas f

18、luorescens）大量存在于植物根際，也習于定值植物根面。由于他們繁殖迅速，能產生嗜鐵素和抗生素，而成為植物位點和空間微環(huán)境的有力競爭者，是研究報告較多的一類生物防治細菌。不過抗逆性能力差給生產和利用這類細菌造成一定困難。生防菌株2P24、CPF-10對番茄青枯菌，棉花立枯絲核菌、棉花枯萎菌具有明顯的拮抗作用；P751復合菌劑對松赤落葉病菌孢子的溶菌率達96.41%，對泡桐炭疽病菌和鐮刀菌的溶菌率分別為99.25%和85.67%17。劉國奇等從韭菜根內分離篩選出來自突變菌株P.F.NKDE2，通過拌種和拌培養(yǎng)土回接韭菜，能定值于韭菜跟表、根內和根圍中，有明顯的促生效果18。祝新德等報道熒光

19、假單胞菌株M18在離體條件下，能有效抑制甜瓜蔓枯病菌的菌絲生長，在苗期還具有誘導甜瓜幼苗生產系統(tǒng)性抗甜瓜蔓枯病菌的能力，在大田試驗中可以保持80%的防效19。3.3昆蟲真菌的遺傳改良在國際記載的800多種昆蟲病原真菌中，應用效果最好的是白僵菌（Beauveria）和綠僵菌（Metarhizium）。這類微生物殺蟲劑具有能多次感染害蟲引起流行的優(yōu)點，但也存在侵染過程易受環(huán)境因素影響、毒力發(fā)揮較慢等不足。昆蟲真菌分子生物學和生物技術研究國內外起步稍晚，但近年來某些關鍵技術已取得突破。我國在國際上首次建立了球孢白僵菌（B. bassiana）的農桿菌轉化體系，并從該菌中克隆了類枯草桿菌蛋白酶基因（B

20、bpr1）、幾丁質酶基因（Bbchit1）和真菌孢子形成相關基因20。新構建的含有前兩種基因的工程菌較單一Bbpr1基因工程菌殺蟲毒力提高近一倍，侵染致病時間縮短近一半。3.4新型病害生防制劑Harpin的開發(fā)Harpin是一類能激活、誘導植物保衛(wèi)反應和產生系統(tǒng)抗性的新型蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于梨火疫病菌（Erwinia amylovora）的侵染機理研究。由于這類蛋白具有作用機制獨特、防病和促進植物生長效果顯著和環(huán)境友好的突出優(yōu)點，現(xiàn)已迅速開發(fā)成為一類新型的“綠色農藥”并進入了國際市場。我國在水稻白葉枯病菌、水稻條斑病菌等多種細菌的研究中發(fā)現(xiàn)，Harpin不僅廣泛存在，而且其基因結構具有豐富的遺傳多

21、樣性。這就為這類激活蛋白作用機理的進一步研究和生防制劑的后續(xù)開發(fā)創(chuàng)造了良好的條件21。4 生防微生物展望 為了更好地解決生防微生物的定值問題，研究工作者在篩選分離生防細菌時目標常常選定在根際或植物內部的細菌種群。根際細菌與內生細菌作為生防因子相對于腐生細菌而言有更大的生態(tài)優(yōu)勢，進一步擴寬根際細菌和內生細菌領域將會是生防細菌研究趨勢之一。根際細菌是從根際分離的細菌，依據(jù)其對植物的作用將其分為有益菌、有害菌和中性菌等三類，其主要特點有兩個方面：一是與根親和力強，認為革蘭氏陰性菌細胞壁上具有與根表面外源凝聚素相結合的結構，較易在植物根部定居、繁殖，對其占領空間和生長競爭很有利。二是拮抗性強，根際細菌

22、是根防御病原物侵染的第一道防線，根際土壤比非根際土壤的細菌多，活動頻繁，拮抗性強。從根際或根表面很容易分離到拮抗細菌。有益根際細菌又稱促生根細菌，指與根有密切聯(lián)系并能強定殖于根系，能促進植物生長的根際細菌。冰核細菌作為生防因子在凍殺害蟲方面研究較多。冰核活性反映是由威斯康星大學植物病理學家發(fā)現(xiàn)的。當水中有草生歐文氏（Erwinia herbicola）、丁香假單胞菌（Ps.syringae）、熒光假單胞菌（Ps.fluorescens）等時，水容易結冰。受冰河細菌污染的植物很容易發(fā)生凍害。冰核細菌已用于制造降雪劑、人工調節(jié)天氣、冷凍濃縮食品、海水淡化等反面研究22。特別是冰核基因在應用領域里的

23、研究工作已成國際熱點，涉及細菌細胞表面展示、報告基因、病原微生物高敏檢測、促凍殺蟲，作物抗寒育種等多個領域，有良好的應用前景。此外，生物技術在生防科技中的應用也逐步增多。應用現(xiàn)代微生物技術可以選育微生物菌株，開發(fā)微生物農藥，將自然存在的生防微生物中含有一些不良的生物學特性進行改良，克隆優(yōu)良形狀的基因，這是許多傳統(tǒng)的手段難以達到的?，F(xiàn)代生物技術的發(fā)展，特別是基因工程的應用，給農業(yè)微生物的研究注入了新的活力，現(xiàn)以成為微生物遺傳改良的有效途徑。目前大多數(shù)微生物的研究還停留在試驗室階段走向田間是一個復雜的過程，阻礙許多生防菌田間應用的一個重要問題是菌劑的貨架儲藏期短，特別是由Pseudonomas制成

24、的生防菌劑，這一問題表現(xiàn)的更為突出，對于此類制劑的研制，可以將它制成干粉劑型，以延長菌劑的儲藏期，而由Bacillus制成的菌劑明顯的優(yōu)于Pseudonomas，因為它能產生耐熱抗逆的芽孢，便于菌劑的研制和菌劑的加工，這也是市場上由Bacillus開發(fā)的菌劑較多的主要原因。其次是生防菌的防效極易受環(huán)境條件的影響，不易在根圍或葉圍定植。再次植物病原菌也能對生防菌的拮抗物質產生抗性23。這些難點都要求科研工作者們不懈努力，進一步篩選高毒力菌株，研制混合菌株生防制劑，改進生產工藝，發(fā)展產品劑系列化，提高效價與毒力，規(guī)范產品質量檢測技術及商品質量標準化，加強制劑的穩(wěn)定性、分散性、黏著力、田間殘效及貨架

25、壽命的研究，解決孢子粉含水量偏高，產品污染嚴重等問題，展開國外生防資源引種、檢疫及風險性分析工作，為經濟、安全、持續(xù)解決我國重大病蟲害問題提供條件。參考文獻1 賀字典, 高玉峰.生防菌在植物病害防治中的研究進展（綜述）J.河北職業(yè)技術師范學院學報, 2003, 17（2）：56-59.2 陳秀峰.植物病害生物防治M.西安：陜西人民教育出版社, 1993.3 李金云.根癌病生防菌E26菌株生產細菌素的初步研究J.中國農業(yè)科學, 2004, 37（12）：1860-1865.4 黃金水, 何益良, 林慶源.白僵菌粘膏的研制和林間應用J.生物防治通報, 1990, 11（3）：60-64.5 蘭琪, 姜廣華, 吳文君.農用植物內生菌研究進展J.世界農藥, 2002, 24（4）：10-12.6 李農昌, 王成樹, 唐燕平, 等.白僵菌油劑劑型的研究J.安徽農業(yè)大學報, 1996, 23（3）：329-335.7 申繼忠.微生物農藥劑型加工研究進展J.中國生物防治, 1998, 14（