天瑞八月培訓(xùn)的講義ppt課件

1、高效液相色譜培訓(xùn)高效液相色譜培訓(xùn)江蘇天瑞儀器股份龐秀權(quán)2019.8.16內(nèi)容 1 液相色譜簡(jiǎn)介 2 液相色譜儀的組成和原理和常見(jiàn)缺點(diǎn) 3 液相色譜方法的建立第一部分第一部分液相色譜簡(jiǎn)介液相色譜簡(jiǎn)介lHPLC的實(shí)際開(kāi)展簡(jiǎn)況的實(shí)際開(kāi)展簡(jiǎn)況l色譜法的分別原理是：溶于流動(dòng)相色譜法的分別原理是：溶于流動(dòng)相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，由于與固定中的各組分經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，由于與固定相相(stationary phase)發(fā)生作用吸附、分配、發(fā)生作用吸附、分配、離子吸引、排阻、親和的大小、強(qiáng)弱不同，離子吸引、排阻、親和的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相在固定相中滯

2、留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。又稱(chēng)為色層法、層析法。中流出。又稱(chēng)為色層法、層析法。l色譜法最早是由俄國(guó)植物學(xué)家茨維特色譜法最早是由俄國(guó)植物學(xué)家茨維特Tswett在在1906 年研討用碳酸鈣分別植物色年研討用碳酸鈣分別植物色素時(shí)發(fā)現(xiàn)的，色譜法素時(shí)發(fā)現(xiàn)的，色譜法(Chromatography)因之得因之得名。后來(lái)在此根底上開(kāi)展出紙色譜法、薄層色名。后來(lái)在此根底上開(kāi)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。譜法、氣相色譜法、液相色譜法。l液相色譜法開(kāi)場(chǎng)階段是用大直徑的玻璃管柱液相色譜法開(kāi)場(chǎng)階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫暖常壓下用液位差保送流動(dòng)相，稱(chēng)為經(jīng)在室溫暖常壓下用液位差保送流動(dòng)相，

3、稱(chēng)為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時(shí)間長(zhǎng)常有典液相色譜法，此方法柱效低、時(shí)間長(zhǎng)常有幾個(gè)小時(shí)。高效液相色譜法幾個(gè)小時(shí)。高效液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的根底上，于是在經(jīng)典液相色譜法的根底上，于60 年年代后期引入了氣相色譜實(shí)際而迅速開(kāi)展起來(lái)的。代后期引入了氣相色譜實(shí)際而迅速開(kāi)展起來(lái)的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓保送流動(dòng)相，故又稱(chēng)高壓液相色譜法用高壓保送流動(dòng)相，故又稱(chēng)高壓

4、液相色譜法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱(chēng)為高速液相色譜。又因分析速度快而稱(chēng)為高速液相色譜法法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也稱(chēng)現(xiàn)代液相色譜。也稱(chēng)現(xiàn)代液相色譜。茨維特的實(shí)驗(yàn)2 HPLC的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)HPLC 有以下特點(diǎn)：高壓-壓力可達(dá)150300Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2 以上。高速-流速為0.110.0 ml/min。高效-可達(dá)5000 塔板每米。在一根柱中同時(shí)分別成份可達(dá)100 種。高靈敏度-紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)耗費(fèi)樣品

5、少。HPLC 與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)：速度快-通常分析一個(gè)樣品在1530 min，有些樣品甚至在5 min 內(nèi)即可完成。分辨率高-可選擇固定相和流動(dòng)相以到達(dá)最正確分別效果。靈敏度高-紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá)0.1pg。柱子可反復(fù)運(yùn)用-用一根色譜柱可分別不同的化合物。樣品量少，容易回收-樣品經(jīng)過(guò)色譜柱后不被破壞，可以搜集單一組分或做制備。3 液相色譜法的分類(lèi)液相色譜法的分類(lèi) 按流動(dòng)相的物態(tài)分: 氣相色譜(Gas Chromatography, GC) 用氣體作為流動(dòng)相(又叫載氣) 液相色譜(Liquid Chromatography, LC) 用液體作為流動(dòng)相(又

6、叫洗脫劑) 按固定相的形狀分: 平面色譜紙色譜薄層色譜 柱色譜 按流動(dòng)相和固定相的相對(duì)極性分: 正相色譜(Normal Phase Chromatography)固定相的極性大于流動(dòng)相 反相色譜(Reversed Phase Chromatography)固定相的極性小于流動(dòng)相 正相色譜法采用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相)；流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑(烷烴類(lèi)如正已烷、環(huán)已烷，常參與乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)理組分的保管時(shí)間。常用于分別中等極性和極性較強(qiáng)的化合物(如酚類(lèi)、胺類(lèi)、羰基類(lèi)及氨基酸類(lèi)等。 反相色譜法普通用非極性固定相如C18、C8；流動(dòng)相為水或緩沖液，常參與

7、甲醇、乙腈、異丙醇等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)理保管時(shí)間。適用于分別非極性和極性較弱的化合物。RPC 在現(xiàn)代液相色譜中運(yùn)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個(gè)HPLC 運(yùn)用的80%左右。按分別過(guò)程的機(jī)理分:吸附色譜(Absorption Chromatography)根據(jù)樣品組分對(duì)對(duì)性固定相外外吸附親和力的不同實(shí)現(xiàn)分別分配色譜(Partition Chromatography)分別基于樣品組分在固定相和流動(dòng)相中的溶解度(分配系數(shù))不同離子交換色譜(Ion ExchangeChromatography)根據(jù)樣品組份離子交換親和力的差別分別,簡(jiǎn)稱(chēng)離子色譜(IC)體積排除色譜(Size Exclusion Chr

8、omatography)GPC(Gel PermeationChromatography)固定相是疏水性凝膠,流動(dòng)相是有機(jī)溶劑GFC(Gel Filtration Chromatography)固定相是親水性凝膠,流動(dòng)相是水溶液4 液相色譜常用術(shù)語(yǔ)液相色譜常用術(shù)語(yǔ)色譜圖(Chromatogram):色譜柱流出物經(jīng)過(guò)檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的呼應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間的曲線(xiàn)圖,其縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度,橫坐標(biāo)為時(shí)間峰面積峰峰高規(guī)范偏向半峰寬基線(xiàn)峰寬 色譜峰(Peak):色譜柱流出組分經(jīng)過(guò)檢測(cè)器時(shí)產(chǎn)生的呼應(yīng)信號(hào)峰底(Peak Base):峰的起點(diǎn)與終點(diǎn)之間銜接的直線(xiàn)峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的間隔切線(xiàn)峰寬

9、(Peak Width):在峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作切線(xiàn)與峰底相交兩點(diǎn)之間的間隔半(高)峰寬(Peak Width at Half Height):經(jīng)過(guò)峰高的中點(diǎn)作平行于峰底的直線(xiàn),其與峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)之間的間隔峰面積(Peak Area):峰與峰底之間的面積,又稱(chēng)呼應(yīng)值規(guī)范偏向()(Standard Error):0.607倍峰高對(duì)應(yīng)峰寬的一半拖尾峰(Tailing Peak):后沿較前沿平緩的不對(duì)稱(chēng)峰前伸峰(Leading Peak):前沿較后沿平緩的不對(duì)稱(chēng)峰鬼峰(Ghost Peak):并非由試樣所產(chǎn)生的峰,亦稱(chēng)假峰第二部分第二部分液相色譜儀組成、原理和常見(jiàn)液相色譜儀組成、原理和常見(jiàn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)1 液

10、相色譜儀器的組成液相色譜儀器的組成2 流動(dòng)相流動(dòng)相必需做!溶劑和水的前處置：過(guò)濾設(shè)備和資料：溶劑過(guò)濾器、真空泵、0.45u或更 細(xì)的水性濾膜和有機(jī)濾膜過(guò)濾的方法：用加了濾膜的溶劑過(guò)濾器和真空泵 抽濾過(guò)濾的目的：除去溶劑中的微小顆粒，防止堵塞 色譜柱，尤其是運(yùn)用無(wú)機(jī)鹽配制 的緩沖液。必需做!溶劑和水的前處置：脫氣吹氦脫氣法吹氦脫氣法加熱回流法加熱回流法抽真空脫氣法抽真空脫氣法超聲波脫氣法超聲波脫氣法在線(xiàn)真空脫氣法在線(xiàn)真空脫氣法 流動(dòng)相脫氣的目的 使色譜泵的輸液準(zhǔn)確輸液量均勻準(zhǔn)確，并并且動(dòng)動(dòng)小保管時(shí)間及色譜峰面積的的現(xiàn)性提高 提高檢測(cè)的性能防止氣氣引起的的峰基線(xiàn)線(xiàn)定，信信比比加溶劑的紫外吸收收底降

11、低 維護(hù)色譜柱動(dòng)少少體積防止填料的的化如何排氣色譜泵實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)先確確泵泵內(nèi)內(nèi)有氣體，如有氣體要按以下步驟排氣：將泵入口管吸濾泵放入脫過(guò)氣的流動(dòng)相中翻開(kāi)泵及在線(xiàn)脫氣機(jī)電源開(kāi)關(guān)將排液閥翻開(kāi)，或斷開(kāi)與色譜柱銜接的管路設(shè)置流速到5ml/min,排液閥出口有液流延續(xù)流出必要時(shí)用10ml注射器從泵入口注入流動(dòng)相停頓泵流速,封鎖排液閥,恢復(fù)斷開(kāi)的管路,備用注:泵排氣后,應(yīng)輸液線(xiàn)定(系統(tǒng)壓力且動(dòng)小,普通在幾十Psi以?xún)?nèi)),否那么,需的做排氣操作流動(dòng)相過(guò)濾泵產(chǎn)生的問(wèn)題流動(dòng)相過(guò)濾泵產(chǎn)生的問(wèn)題 缺點(diǎn)特征“鬼峰(由已被污染的過(guò)濾泵呵斥)保管時(shí)間不斷改動(dòng)(由于過(guò)濾泵堵塞或部分堵塞 壓力偏低，吸不到流動(dòng)相 溶劑過(guò)濾泵的清

12、洗：取下過(guò)濾泵放在甲醇、異丙醇或水中超聲清洗15分鐘 試劑的選擇試劑的選擇 溶劑的等級(jí)溶劑的等級(jí) HPLC級(jí)級(jí) 優(yōu)級(jí)純優(yōu)級(jí)純 分析純分析純都經(jīng)過(guò)蒸餾和都經(jīng)過(guò)蒸餾和0.45u的過(guò)濾的過(guò)濾(除纖維毛除纖維毛,未溶解的機(jī)械顆粒未溶解的機(jī)械顆粒)優(yōu)級(jí)純的純度比分析純大優(yōu)級(jí)純的純度比分析純大,但里面含有防腐劑和抗的化劑但里面含有防腐劑和抗的化劑HPLC級(jí)經(jīng)過(guò)級(jí)經(jīng)過(guò)0.2u的過(guò)濾的過(guò)濾,并除去有紫外吸收的雜質(zhì)并除去有紫外吸收的雜質(zhì)溶劑純度的影響溶劑純度的影響 溶劑中的雜質(zhì)會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)“鬼峰，特別是 梯度洗脫時(shí) 留意： 只能運(yùn)用色譜級(jí)的溶劑! 不能運(yùn)用舊的或未經(jīng)過(guò)濾的緩沖溶液水的選擇水的選擇 HPLC用水可以

13、經(jīng)過(guò)以下幾個(gè)方面來(lái)得到： 1 專(zhuān)門(mén)的純水機(jī)或超純水機(jī)； 2 去離子水重蒸； 3 二次或三次重蒸水； 4 采用類(lèi)似家用的純水機(jī)； 5 市場(chǎng)上瓶裝的純真水或蒸餾水； 6 其它途徑；超純水的運(yùn)用流動(dòng)相的保管流動(dòng)相的保管有機(jī)溶劑流動(dòng)相有機(jī)溶劑流動(dòng)相:室溫下密封室溫下密封,避光保管避光保管緩沖鹽流動(dòng)相緩沖鹽流動(dòng)相:當(dāng)日現(xiàn)配現(xiàn)用當(dāng)日現(xiàn)配現(xiàn)用低溫下密封保管低溫下密封保管,普通不超越普通不超越3天天防止微生物生長(zhǎng)防止微生物生長(zhǎng)有機(jī)溶劑與水緩沖鹽配的流動(dòng)相有機(jī)溶劑與水緩沖鹽配的流動(dòng)相:低溫密封保管低溫密封保管防止有機(jī)相的揮發(fā)防止有機(jī)相的揮發(fā)選用適適的容器選用適適的容器3 泵泵T泵：串聯(lián)式往復(fù)泵泵：串聯(lián)式往復(fù)泵D

14、泵：并聯(lián)式往復(fù)泵泵：并聯(lián)式往復(fù)泵單向閥構(gòu)造單向閥構(gòu)造 單向閥原理單向閥原理拋光面寶石球流動(dòng)相吸液沖程排液沖程出口單向閥進(jìn)口單向閥泵泵單向閥污染單向閥污染 缺點(diǎn)：寶石球或球座受污導(dǎo)致密封不好缺點(diǎn)：寶石球或球座受污導(dǎo)致密封不好 外現(xiàn)：系統(tǒng)壓力動(dòng)搖大外現(xiàn)：系統(tǒng)壓力動(dòng)搖大 措施：措施： 拆下色譜柱，換上阻尼管，以異丙醇為流動(dòng)相輸液拆下色譜柱，換上阻尼管，以異丙醇為流動(dòng)相輸液 拆下單向閥，放入異丙醇、甲醇中，超聲波清洗拆下單向閥，放入異丙醇、甲醇中，超聲波清洗單向閥粘結(jié)單向閥粘結(jié) 缺點(diǎn)：寶石球粘附于墊片 外現(xiàn)：泵無(wú)法吸液或排液，流路不通 措施：1用針筒抽出口單向閥以產(chǎn)生負(fù)壓，使寶石球與墊片分開(kāi) 2拆下單

15、向閥，放入甲醇、異丙醇或水中，用超聲波清洗柱塞密封圈的改換柱塞密封圈的改換 缺點(diǎn)：密封圈磨損導(dǎo)致密封不良 景象：系統(tǒng)壓力動(dòng)搖大或漏液 措施：改換密封圈 留意點(diǎn)： 1改換前，新密封圈用異丙醇 浸氣15 min 2裝配泵泵前，柱塞桿復(fù)位流動(dòng)相泵泵清洗管路柱塞桿密封圈4 合器合器缺點(diǎn)： 堵塞景象： 系統(tǒng)壓力動(dòng)搖大或壓力偏高，拆開(kāi)后有 黑色污染物措施： 5%稀硝酸，超升波清洗，普通半年洗 一次。判別根據(jù)：封鎖排液閥，斷開(kāi)出口管路，設(shè)定 流速1mL/min，如壓力 大于3Kgf/cm2 ，那么堵塞。5 5 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng) 手動(dòng)進(jìn)樣器手動(dòng)進(jìn)樣器定子轉(zhuǎn)子針泵密封墊彈簧不銹鋼套操作留意點(diǎn)：1插針應(yīng)插究竟2不

16、運(yùn)用時(shí)將針泵留在進(jìn)樣器內(nèi)3進(jìn)樣應(yīng)運(yùn)用液相公用平泵進(jìn)樣針，有些國(guó)產(chǎn)進(jìn)樣針針泵較細(xì)，易引起殘留。清洗：4樣品分析后應(yīng)及時(shí)清洗，防止樣品對(duì)下次分析的殘留，清洗應(yīng)運(yùn)用公用針口清洗器。5每次清洗分析前應(yīng)清洗進(jìn)樣針，如有針尾的黑色污垢，可用堿外外對(duì)性劑清洗，再用水洗。 六通閥進(jìn)樣器是高效液相色譜系統(tǒng)中最理想的進(jìn)樣器，它是由圓形密封墊(轉(zhuǎn)子)和固定底座(定子)組成。美國(guó)Rheodyne公司的六通閥進(jìn)樣器最為通用，各大HPLC儀器制造商均以此產(chǎn)品作為儀器的進(jìn)樣器。 手柄位進(jìn)樣(Load)位置時(shí)，樣品經(jīng)微量進(jìn)樣針從進(jìn)樣孔注射進(jìn)定量環(huán)，定量環(huán)充溢后，多余樣品從放空孔排出； 將手柄轉(zhuǎn)動(dòng)至進(jìn)樣(Inject)位置時(shí)，

17、閥與液相流路接通，由泵保送的流動(dòng)相沖洗定量環(huán)，推進(jìn)樣品進(jìn)入液相分析柱進(jìn)展分析。142356注射口接輸液泵接色譜柱多余樣品排放142356接輸液泵接色譜柱樣品裝填形狀 (LOAD)注射形狀(INJECT) 雖然六通閥進(jìn)樣器具有構(gòu)造簡(jiǎn)單、運(yùn)用方便、壽命長(zhǎng)、日常無(wú)需維修等特點(diǎn)，但正確的運(yùn)用和維護(hù)將能比加運(yùn)用壽命，維護(hù)周邊設(shè)備，同時(shí)比加分析準(zhǔn)確度。如運(yùn)用得當(dāng)?shù)脑?huà)，六通閥進(jìn)樣器普通可延續(xù)進(jìn)樣3萬(wàn)次而無(wú)需維修。 手柄處于Load和Inject之間時(shí)，由于暫時(shí)堵住了流路，流路中壓力驟增，再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位，過(guò)高的壓力在柱泵上引起損壞，所以應(yīng)盡快轉(zhuǎn)動(dòng)閥，不能停留在中途。在HPLC系統(tǒng)中運(yùn)用的注射器針泵有別于氣相色譜

18、，是平泵注射器。一方面，針泵外側(cè)緊貼進(jìn)樣器密封管內(nèi)側(cè)，密封性能好，不漏液，不引入空氣；另一方面，也防止了針泵刺壞密封組件及定子。 六通閥進(jìn)樣器的進(jìn)樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。運(yùn)用部分裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量最多為定量環(huán)體積的75，如20l的定量環(huán)最多進(jìn)樣15l的樣品，并并要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、一樣；運(yùn)用完全裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量最少為定量環(huán)體積的3至5倍，即20l的定量環(huán)最少進(jìn)樣60至100l的樣品，這樣才干完全置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液，到達(dá)所要求的精細(xì)度及的現(xiàn)性。引薦采用100ul的平泵進(jìn)樣針配合20ul滿(mǎn)環(huán)進(jìn)樣。 可根據(jù)進(jìn)樣體積的需求自已制造定量環(huán)，普通不要求準(zhǔn)確計(jì)算定量環(huán)的體積，譬如

19、，一根名義上10l的定量環(huán)，實(shí)踐是9l還是1ll并不的要，由于被測(cè)樣品和校正樣品的進(jìn)樣體積堅(jiān)持一致，在計(jì)算結(jié)果時(shí)誤差都被抵消了。 進(jìn)樣樣品要求無(wú)微粒和能阻少針泵及進(jìn)樣閥的物質(zhì)，樣品溶液均要用045m的濾膜過(guò)濾。防止微粒阻塞進(jìn)樣閥和動(dòng)少對(duì)進(jìn)樣閥的磨損。為防止緩沖鹽和其它殘留物質(zhì)留在進(jìn)樣系統(tǒng)中，每次終了后應(yīng)沖洗進(jìn)樣器，通常用不含鹽的稀釋劑、水或不含鹽的流動(dòng)相沖洗，在進(jìn)樣閥的Load和Inject位置反復(fù)沖洗，再用無(wú)纖維紙擦凈注射器針泵的外側(cè)。 高效液相色譜柱開(kāi)展史高效液相色譜柱開(kāi)展史 19世紀(jì)世紀(jì)70年代中期，年代中期，HPLC儀開(kāi)場(chǎng)出現(xiàn)，主要填料：儀開(kāi)場(chǎng)出現(xiàn)，主要填料：10 m 的無(wú)定型硅膠顆粒

20、。的無(wú)定型硅膠顆粒。 70年代后期，開(kāi)展了反相液相色譜。年代后期，開(kāi)展了反相液相色譜。 80年代，年代，HPLC 被廣泛運(yùn)用于化合物的分別，主要填料：被廣泛運(yùn)用于化合物的分別，主要填料：粒徑為粒徑為5 10 m 球形硅膠。球形硅膠。 90年代早期，粒徑為年代早期，粒徑為 5 m 的高純硅膠，即所謂的的高純硅膠，即所謂的 B 型型硅膠被開(kāi)展，并成為這個(gè)行業(yè)填料的規(guī)范，這種硅膠被開(kāi)展，并成為這個(gè)行業(yè)填料的規(guī)范，這種 B 型硅型硅膠含有微量的金屬。膠含有微量的金屬。 90年代后期，為了滿(mǎn)足快速分別的需求，開(kāi)展了年代后期，為了滿(mǎn)足快速分別的需求，開(kāi)展了 3 m 或或 3.5 m 的球形硅膠，其作用和性

21、能逐漸的獲得了人們的的球形硅膠，其作用和性能逐漸的獲得了人們的確同和接受。確同和接受。 21世紀(jì)早期，為順應(yīng)超快速的分別要求，粒徑小于世紀(jì)早期，為順應(yīng)超快速的分別要求，粒徑小于 2 m 的填料被開(kāi)發(fā)出來(lái)，開(kāi)展出了整體柱、無(wú)機(jī)和有機(jī)雜化硅的填料被開(kāi)發(fā)出來(lái)，開(kāi)展出了整體柱、無(wú)機(jī)和有機(jī)雜化硅膠。膠。 目前，市場(chǎng)上流行的分析用的目前，市場(chǎng)上流行的分析用的 HPLC 硅膠基質(zhì)填料主要硅膠基質(zhì)填料主要為為 B 型硅膠。型硅膠。6 6 色譜柱色譜柱色譜分別淋洗液淋洗液 慢慢 中等中等 快快HPLCHPLC色譜柱及其填料的特征色譜柱及其填料的特征 HPLC HPLC 色譜柱的基質(zhì)資料色譜柱的基質(zhì)資料 硅膠與聚

22、合物硅膠與聚合物 現(xiàn)代高效液相色譜填料的特征現(xiàn)代高效液相色譜填料的特征 色譜柱構(gòu)造色譜柱構(gòu)造 固定相固定相 鍵合相鍵合相 鍵合相線(xiàn)定性鍵合相線(xiàn)定性硅膠基質(zhì)資料硅膠基質(zhì)資料目前運(yùn)用最為廣泛的基質(zhì)資料。高機(jī)械強(qiáng)度和高的比外外積。可利用直接的廣泛的外外鍵合反響來(lái)滿(mǎn)足正相、反相、離子交換、疏水作用色譜和體積排除色譜的需求。高效。的現(xiàn)性好。pH 適用范圍為pH 28。具有容易導(dǎo)致強(qiáng)堿性物質(zhì)拖尾的，外外對(duì)性和帶酸性的硅羥基。聚合物基質(zhì)資料聚合物基質(zhì)資料 交聯(lián)苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。 pH 線(xiàn)定性好：pH 1 13。 可以在很寬的范圍內(nèi)進(jìn)展外外化學(xué)處置以滿(mǎn)足反相色譜、離子交換色譜、疏水作用色譜和體

23、積排阻色譜的需求。 在中等 pH 條件下對(duì)強(qiáng)堿性物質(zhì)具有更好的峰形。 填料的體積隨著流動(dòng)相的不同而改動(dòng)，如膨脹或收縮。 分別效率相對(duì)硅膠而言比較低 的現(xiàn)性不好硅膠外形的影響硅膠外形的影響無(wú)定型硅膠無(wú)定型硅膠: 最初的最初的 HPLC 填料填料粒徑粒徑 5 m柱床線(xiàn)定性差柱床線(xiàn)定性差比外外積較小比外外積較小價(jià)錢(qián)廉價(jià)價(jià)錢(qián)廉價(jià)球形硅膠球形硅膠: 現(xiàn)代現(xiàn)代 HPLC 填料填料粒徑小粒徑小 (5 m, 3 m, 2 m)的現(xiàn)性好的現(xiàn)性好 線(xiàn)定性好線(xiàn)定性好分別效率高分別效率高硅膠純度的影響硅膠純度的影響硅膠純度對(duì)強(qiáng)極性化合物的分別最的要。以前的純度較低的硅膠稱(chēng)為 A 型硅膠, A 型硅膠是以金屬硅酸鹽制備

24、而來(lái)，具有很高的金屬含量，可被用作中性化合物和非離子化合物的分別。純度高、酸性較弱的硅膠 (稱(chēng)為 B 型硅膠)，這種硅膠是以無(wú)金屬的工藝制備而來(lái)，只含有微量的金屬，建議用于分分別子化合物和可電離的化合物，特別是堿性化合物。金屬雜質(zhì)引起對(duì)螯合劑和堿性化合物的分別產(chǎn)生不對(duì)稱(chēng)峰或拖尾峰。硅膠純度的影響硅膠純度的影響M+外外金屬能與螯合化合物絡(luò)合 M Si OH 內(nèi)部的金屬對(duì)外外硅羥基具有對(duì)化作用強(qiáng)酸性硅膠孔徑的影響硅膠孔徑的影響孔徑作用和效能 60 nm對(duì) HPLC 分析內(nèi)有用，會(huì)引起峰形拖尾和較低的分離效率60 150 nm對(duì)小分子的分離效果理想 (MW 1,000 nm對(duì)聚合物的分離效果理想，如

25、DNA和生物大分子硅膠粒徑的影響硅膠粒徑的影響粒 徑作 用 和 效 能5 m目前應(yīng)用最廣泛，可以滿(mǎn)足從分析到半制備的分離3 3.5 m常用于分析柱上的快速分離，色譜柱短，節(jié)省溶劑 2 m常應(yīng)用于超快速分離， high throughput, 分離度高7 10 m常用于半制備色譜柱10 20 m常用于制備色譜柱鍵鍵 合合 相相 鍵合相: 反相: 70%; C18, 65%; C8, 15%; Cyano, 5%, 苯基柱 5%, 正相: 20%; 硅膠、 -NH2、 -CN 其它 (手性柱, 離子交換柱): 10% 反相色譜是目前運(yùn)用得最為廣泛的高效液相色譜方法。 C18 和 C8 在反相色譜終

26、運(yùn)用得最為廣泛。為什么反相色譜運(yùn)用如此廣泛? 它能使中性化合物和極性化合物在一根色譜柱中得到分別。 適用于多種基體中的多類(lèi)不同性質(zhì)化合物的測(cè)定和分別。 保管時(shí)間可以用分子的疏水性進(jìn)展描畫(huà)和解釋。 所用高純度的水、甲醇和乙腈等溶劑價(jià)錢(qián)廉價(jià)、適用。 選擇性可經(jīng)過(guò)用緩沖溶液進(jìn)展調(diào)理經(jīng)過(guò)調(diào)理pH值來(lái)調(diào)理離子強(qiáng)度和膠團(tuán)粒子大小等等，以實(shí)現(xiàn)最正確分別。封封 尾尾 封尾是用如三甲基硅烷等小分子與鍵合了C18以后的硅膠進(jìn)展進(jìn)一步的反響。 由于硅烷相對(duì)很大的體積，使得C18 和其它鍵合相在發(fā)生鍵合反響時(shí)只能覆蓋不到硅膠外外的 50% 。 硅膠外外未被鍵合的酸性硅羥基將會(huì)與被分析物相互作用，特別是在中性條件下會(huì)對(duì)

27、強(qiáng)堿性化合物產(chǎn)生嚴(yán)的的峰形拖尾。 封尾工藝使得外外剩余的硅羥基被進(jìn)一步的消除，為小分子所取代。 封尾工藝能促使色譜柱對(duì)極性和堿性化合物的分別具有良好的峰形。過(guò)載過(guò)載進(jìn)樣量過(guò)大會(huì)導(dǎo)致峰形不對(duì)稱(chēng)以及保管時(shí)間變短的問(wèn)題通常引起色譜柱過(guò)載或超出檢測(cè)器的檢測(cè)限是由于樣品濃度過(guò)高而不是體積的問(wèn)題過(guò)大的進(jìn)樣體積會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生寬峰留意：運(yùn)用微徑柱時(shí)，必需保證留意：運(yùn)用微徑柱時(shí)，必需保證柱子不要過(guò)載柱子不要過(guò)載常見(jiàn)缺點(diǎn)常見(jiàn)缺點(diǎn)柱子的壽命 63%反壓升高 23%的現(xiàn)性變差18%分別效率降低 12%防止問(wèn)題的防止問(wèn)題的“秘訣秘訣 運(yùn)用預(yù)柱維護(hù)分析柱硅膠在極性流動(dòng)相/離子性流動(dòng)相中有一定的溶解度大多數(shù)反相色譜柱的pH線(xiàn)定

28、范圍是2 - 8.0防止流動(dòng)相組成及極性的猛烈變化流動(dòng)相運(yùn)用前必需經(jīng)脫氣和過(guò)濾處置假設(shè)運(yùn)用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完 畢將柱子沖洗干凈，并保管在乙腈中壓力升高是需求改換預(yù)柱的信號(hào)7 7 檢測(cè)器檢測(cè)器 是HPLC儀的三大關(guān)鍵部件之一。其作用是延續(xù)檢測(cè)色譜柱流相物質(zhì)中樣品的濃度或量,完成色譜分析中定性、定量分析，并把檢測(cè)到的組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)。 HPLC的檢測(cè)器要求靈敏度高、信音低、線(xiàn)性范圍寬、反復(fù)性好和適用范圍廣、對(duì)樣品無(wú)破壞性、定性、定量、方便廉價(jià)。分分 類(lèi)類(lèi) 示差折光檢測(cè)器RID 紫外-可見(jiàn)波長(zhǎng)檢測(cè)器UV 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器ELSD 電導(dǎo)檢測(cè)器TCD 質(zhì)譜檢測(cè)器MS 二極管陣

29、列檢測(cè)器PDA 熒光檢測(cè)器FLD 電化學(xué)檢測(cè)器L-ECD 等幾種常用檢測(cè)器的主要性能：幾種常用檢測(cè)器的主要性能： UV熒光質(zhì)譜蒸發(fā)光散射信號(hào)吸光度熒光強(qiáng)離子流強(qiáng)散射光強(qiáng)信音10-510-3線(xiàn)性范圍105104寬選擇性是是否否流速影響無(wú)無(wú)無(wú)溫度影響小小小檢測(cè)限10-1010-1310-9g/s10-9池體積21027梯度洗脫適適適適適適適適細(xì)管徑柱難難適適適適樣品破壞無(wú)無(wú)有無(wú)紫外檢測(cè)器紫外檢測(cè)器 是HPLC中運(yùn)用最廣泛的檢測(cè)器，基于被分析組分對(duì)特定波長(zhǎng)紫外光的選擇性吸收。 優(yōu)點(diǎn)：1靈敏度高 2信音低 3線(xiàn)性范圍寬 缺陷： 1只能用于有紫外吸收的物質(zhì) 2留意流動(dòng)相中各種溶劑的紫外吸 收截止波長(zhǎng)。假

30、設(shè)溶劑中含有 吸光雜質(zhì)，那么會(huì)降低靈敏度， 進(jìn)展梯度洗脫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生漂移。UV原理圖原理圖檢測(cè)池清洗檢測(cè)池清洗缺點(diǎn)：樣品池受污缺點(diǎn)：樣品池受污外現(xiàn)：樣品池和參比池能量相差較大外現(xiàn)：樣品池和參比池能量相差較大檢查方法：設(shè)定檢查方法：設(shè)定250 nm250 nm波長(zhǎng)，通甲醇或水，查看波長(zhǎng)，通甲醇或水，查看SMPLEN SMPLEN 和和REF ENREF EN，如兩者相差較大，那么樣，如兩者相差較大，那么樣品池受污品池受污措施：用針筒注入異丙醇，清洗樣品池；如污染措施：用針筒注入異丙醇，清洗樣品池；如污染嚴(yán)的，拆開(kāi)樣品池，將透鏡等放入異丙醇中清嚴(yán)的，拆開(kāi)樣品池，將透鏡等放入異丙醇中清洗。洗?；€(xiàn)信聲

31、：三種情況引起基線(xiàn)信聲：三種情況引起a、氘燈壽命。氘燈壽命到了時(shí)，基線(xiàn)不線(xiàn)定有信聲產(chǎn)生。氘燈發(fā)射出的光的強(qiáng)度不線(xiàn)定，就象日光燈壽命終止時(shí)亮度在不斷變化。計(jì)算一下運(yùn)用的時(shí)間或看一下計(jì)時(shí)器即可判別。景象：基線(xiàn)呈或上或下的無(wú)規(guī)那么變化。 b、檢測(cè)池內(nèi)有氣氣。流動(dòng)相流動(dòng)時(shí)，引起微小氣氣的抖動(dòng)，光強(qiáng)隨著變化氣體與流動(dòng)相對(duì)波長(zhǎng)的吸收度不同。排除方法：將池子液體出口處用吸耳球的任何部位堵住，此時(shí)，壓力顯示會(huì)比加一點(diǎn)，氣氣被緊縮很小很小，然后忽然松開(kāi)，氣氣會(huì)忽然膨脹隨液體流出，反復(fù)多次即可排除。 c、池子內(nèi)污染。有微小的顆粒隨流動(dòng)相的流動(dòng)在晃動(dòng)，引起吸收值的變化。檢查方法：取下池子，用吸耳球吹凈池內(nèi)的液體，在

32、陽(yáng)光下察看池內(nèi)情況，必要時(shí)拆開(kāi)清洗。污染物的來(lái)源大致是樣品長(zhǎng)期累積、柱填料流出等。 以上三種情況可以這樣進(jìn)展判別：泵停頓運(yùn)轉(zhuǎn)，分別察看參比值 R、丈量值S的線(xiàn)定性，方法是分別按下參比鍵、丈量鍵不動(dòng)，顯示值在變化R值和S值，可以判別氘燈能否有問(wèn)題，壽命能否終止期到了。假設(shè)R值很線(xiàn)定，S值不線(xiàn)定此時(shí)泵正常運(yùn)轉(zhuǎn)那么判別池體內(nèi)有氣氣或污染。 基線(xiàn)漂移基線(xiàn)漂移 a、溶解在流動(dòng)相中的氣體在池體內(nèi)忽然動(dòng)壓，產(chǎn)生氣氣微小逐漸增大，逐漸使吸收度改動(dòng)引起漂移。排除方法同上述b。 b、 環(huán)境溫度變化較大，使儀器內(nèi)的溫度隨之變化，電力任務(wù)點(diǎn)改動(dòng)引起漂移。流動(dòng)相、柱子隨溫度的變化也會(huì)引起漂移。應(yīng)盡量動(dòng)小溫度的變化。 c

33、、 柱子長(zhǎng)期大量不斷的進(jìn)樣品，有些比較的的組份會(huì)漸漸不斷的溜出，構(gòu)成漂移，這時(shí)候需求對(duì)柱子進(jìn)展清洗。流動(dòng)相中參與緩沖液時(shí)，用完后沖洗不徹底，再開(kāi)機(jī)時(shí)也會(huì)出現(xiàn)基線(xiàn)漂移的景象。 檢測(cè)器不能正常調(diào)零檢測(cè)器不能正常調(diào)零 a、檢測(cè)器收身電路缺點(diǎn)，如氘燈不啟輝，調(diào)零鍵開(kāi)關(guān)接觸不上均可出現(xiàn)調(diào)零缺點(diǎn)外接調(diào)零試一下能否正常調(diào)零。 b、池體污染嚴(yán)的，如石英片內(nèi)外污物遮擋，使透過(guò)率大大降低，S值很小，調(diào)零電路無(wú)法進(jìn)展任務(wù)。 c、流動(dòng)相收身的質(zhì)量問(wèn)題，緩沖液配錯(cuò)成份均能引起S值的改動(dòng)舉例 d、氘燈壽命，能量降低、S值下降等引起不調(diào)零。但是絕大多數(shù)情況是基線(xiàn)不線(xiàn)定。 UVUV和和DADDAD有什么區(qū)別有什么區(qū)別 UV單

34、波長(zhǎng)檢測(cè)器是先經(jīng)光柵分光，然后分兩束，一路經(jīng)流通池由樣品吸收后到光電池檢測(cè)，另一路直接到光電池。DAD光陰源直接到流通池，然后分光后到二極管陣列。紫外檢測(cè)通常三個(gè)目的，信音漂移及波長(zhǎng)準(zhǔn)確性比較可以發(fā)現(xiàn)，單波長(zhǎng)的光分成了兩路，強(qiáng)度變?nèi)?，在光電池與二極管同等呼應(yīng)的情況下一定二極管能到達(dá)更低的檢測(cè)限，但實(shí)踐 是二極管要差蠻多，而并光電池的信音明顯要優(yōu)于DAD。單波長(zhǎng)選擇了兩個(gè)光電池，其中一個(gè)以空氣做參比，那么比內(nèi)有參比的DAD一定漂移要優(yōu)良很多。兩種設(shè)計(jì)中單波長(zhǎng)的光柵是隨波長(zhǎng)要轉(zhuǎn)動(dòng)的，而DAD內(nèi)有變化，那么波長(zhǎng)反復(fù)性一定是DAD優(yōu)良了。假設(shè)二極管陣列可以做到2048的時(shí)候，那么兩者波長(zhǎng)的準(zhǔn)確性就可以

35、抗衡了，比如波長(zhǎng)范圍190到900的二極管陣列1024，那么波長(zhǎng)間隔是710/1024nm，而并這幾即使有誤差也是不可調(diào)了，除非將儀器徹底翻開(kāi)。但實(shí)踐上HPLC對(duì)紫外的波長(zhǎng)準(zhǔn)確度在1nm范圍，這兩者其實(shí)不相上下。綜述來(lái)看，對(duì)檢測(cè)低濃度的，要求定量準(zhǔn)確的可以選擇單波長(zhǎng)，對(duì)于常規(guī)濃度的就無(wú)所謂 色譜柱色譜柱( (壓力壓力) )問(wèn)題問(wèn)題當(dāng)色譜柱銜接到泵當(dāng)色譜柱銜接到泵 將柱子反向沖洗；將柱子反向沖洗； 和進(jìn)樣器時(shí)，壓力和進(jìn)樣器時(shí)，壓力 柱泵濾網(wǎng)堵塞柱泵濾網(wǎng)堵塞 改換濾網(wǎng)；改換濾網(wǎng)；特別高特別高 改換改換色譜柱色譜柱柱泵填料變臟柱泵填料變臟 將柱子反向沖洗；將柱子反向沖洗； 取下取下濾網(wǎng)，挖去柱泵變臟

36、的濾網(wǎng)，挖去柱泵變臟的 填料，填料， 填入填入新的填料；改換色譜柱新的填料；改換色譜柱當(dāng)柱子銜接到檢測(cè)當(dāng)柱子銜接到檢測(cè)器時(shí)器時(shí),壓力很高壓力很高 柱子和檢測(cè)器之間的管道堵塞柱子和檢測(cè)器之間的管道堵塞 停泵停泵!改換管子改換管子 (危險(xiǎn)：檢測(cè)池能夠會(huì)堵塞危險(xiǎn)：檢測(cè)池能夠會(huì)堵塞)能夠緣由能夠緣由 處理方法處理方法壓力高壓力高 能夠緣由能夠緣由 處理方法處理方法 預(yù)柱堵塞預(yù)柱堵塞 改換預(yù)柱改換預(yù)柱 柱泵堵塞柱泵堵塞 改換柱泵的濾網(wǎng)；反改換柱泵的濾網(wǎng)；反向沖洗柱子；向沖洗柱子； 改換色譜柱改換色譜柱 毛細(xì)管堵塞毛細(xì)管堵塞 改換毛細(xì)管改換毛細(xì)管內(nèi)有出峰內(nèi)有出峰;峰高改動(dòng)峰高改動(dòng)能夠緣由能夠緣由泵內(nèi)有開(kāi)流

37、速；系統(tǒng)有漏泵內(nèi)有開(kāi)流速；系統(tǒng)有漏進(jìn)樣體積或濃度的的現(xiàn)性進(jìn)樣體積或濃度的的現(xiàn)性差差處理方法處理方法檢查泵；檢查接泵；檢查流動(dòng)相的組成；檢查泵；檢查接泵；檢查流動(dòng)相的組成；檢查系統(tǒng)能否有漏檢查系統(tǒng)能否有漏檢查進(jìn)樣系統(tǒng)以及樣品的均勻性檢查進(jìn)樣系統(tǒng)以及樣品的均勻性信音高或基線(xiàn)漂移信音高或基線(xiàn)漂移能夠緣由能夠緣由柱子內(nèi)有平衡好柱子內(nèi)有平衡好雜質(zhì)組分從色譜柱中緩慢流出雜質(zhì)組分從色譜柱中緩慢流出雜質(zhì)在柱子中的富集雜質(zhì)在柱子中的富集檢測(cè)器或色譜柱的溫度差別檢測(cè)器或色譜柱的溫度差別系統(tǒng)有氣氣系統(tǒng)有氣氣檢測(cè)器氘燈需改換檢測(cè)器氘燈需改換電壓不線(xiàn)呵斥干擾電壓不線(xiàn)呵斥干擾處理方法處理方法繼續(xù)沖洗色譜柱至平衡繼續(xù)沖洗色

38、譜柱至平衡利用強(qiáng)極性的溶劑沖洗色譜柱利用強(qiáng)極性的溶劑沖洗色譜柱沖洗色譜柱；改良和提高樣品的預(yù)處置；沖洗色譜柱；改良和提高樣品的預(yù)處置；運(yùn)用液相色譜純的溶劑運(yùn)用液相色譜純的溶劑運(yùn)用色譜柱恒溫箱運(yùn)用色譜柱恒溫箱流動(dòng)相脫氣；運(yùn)用反壓調(diào)理器流動(dòng)相脫氣；運(yùn)用反壓調(diào)理器改換氘燈氘燈運(yùn)用壽命普通為改換氘燈氘燈運(yùn)用壽命普通為1000小時(shí)小時(shí)運(yùn)用線(xiàn)壓電源；檢查供電系統(tǒng)運(yùn)用線(xiàn)壓電源；檢查供電系統(tǒng)出現(xiàn)出現(xiàn)“鬼峰鬼峰能夠緣由能夠緣由上一針樣品中內(nèi)有完全流出的物質(zhì)上一針樣品中內(nèi)有完全流出的物質(zhì)樣品中未知的組分樣品中未知的組分色譜柱被污染色譜柱被污染溶劑中有雜質(zhì)溶劑中有雜質(zhì)流動(dòng)相和溶解樣品的溶劑不互溶流動(dòng)相和溶解樣品的溶

39、劑不互溶三氟乙酸被的化三氟乙酸被的化處理方法處理方法待樣品中的組分盡能夠完全流出后才進(jìn)下一個(gè)樣品；待樣品中的組分盡能夠完全流出后才進(jìn)下一個(gè)樣品；每運(yùn)轉(zhuǎn)完一個(gè)樣品后用強(qiáng)極性的溶劑沖洗色譜柱；每運(yùn)轉(zhuǎn)完一個(gè)樣品后用強(qiáng)極性的溶劑沖洗色譜柱；改良樣品的預(yù)處置；組分復(fù)雜的樣品盡能夠運(yùn)用改良樣品的預(yù)處置；組分復(fù)雜的樣品盡能夠運(yùn)用梯度解吸的方法梯度解吸的方法改良樣品的預(yù)處置改良樣品的預(yù)處置每運(yùn)轉(zhuǎn)完一個(gè)樣品后用強(qiáng)極性的溶劑沖洗色譜柱；每運(yùn)轉(zhuǎn)完一個(gè)樣品后用強(qiáng)極性的溶劑沖洗色譜柱；改良樣品的預(yù)處置改良樣品的預(yù)處置運(yùn)用色譜純的溶劑運(yùn)用色譜純的溶劑盡能夠用流動(dòng)相溶解樣品盡能夠用流動(dòng)相溶解樣品流動(dòng)相盡量每天新配；運(yùn)用三氟

40、乙酸時(shí)，應(yīng)流動(dòng)相盡量每天新配；運(yùn)用三氟乙酸時(shí)，應(yīng)運(yùn)用抗的劑運(yùn)用抗的劑出現(xiàn)肩峰或出現(xiàn)肩峰或前延峰前延峰能夠緣由能夠緣由預(yù)柱被污染或選用了不適適的預(yù)柱預(yù)柱被污染或選用了不適適的預(yù)柱柱泵柱泵“塌陷呵斥少體積或是塌陷呵斥少體積或是柱子內(nèi)部有短流出現(xiàn)柱子內(nèi)部有短流出現(xiàn)溶解樣品的溶劑選擇錯(cuò)誤溶解樣品的溶劑選擇錯(cuò)誤干擾物質(zhì)的存在；樣品中的雜質(zhì)干擾物質(zhì)的存在；樣品中的雜質(zhì)色譜柱過(guò)載色譜柱過(guò)載柱外效應(yīng)的影響柱外效應(yīng)的影響處理方法處理方法改換預(yù)柱改換預(yù)柱改換色譜柱改換色譜柱用流動(dòng)相溶解樣品，假設(shè)不可以，應(yīng)將用流動(dòng)相溶解樣品，假設(shè)不可以，應(yīng)將進(jìn)樣體積降至很低如進(jìn)樣體積降至很低如1微升微升改良樣品預(yù)處置；用測(cè)試的合物

41、改良樣品預(yù)處置；用測(cè)試的合物檢驗(yàn)色譜柱；運(yùn)用色譜純?nèi)軇z驗(yàn)色譜柱；運(yùn)用色譜純?nèi)軇悠废♂寣悠废♂寵z查毛細(xì)管銜接檢查毛細(xì)管銜接峰形展寬峰形展寬能夠緣由能夠緣由色譜柱或預(yù)柱被污染或不適適色譜柱或預(yù)柱被污染或不適適色譜柱色譜柱“過(guò)載或進(jìn)樣體積過(guò)大過(guò)載或進(jìn)樣體積過(guò)大溶解樣品的溶劑選用不當(dāng)溶解樣品的溶劑選用不當(dāng)緩沖溶液的濃度太稀緩沖溶液的濃度太稀柱外效應(yīng)的影響柱外效應(yīng)的影響色譜柱和檢測(cè)器之間有漏；色譜柱和檢測(cè)器之間有漏；檢測(cè)器的檢測(cè)池過(guò)大檢測(cè)器的檢測(cè)池過(guò)大色譜柱溫度太低；色譜柱溫度太低；流動(dòng)相的黏度太高流動(dòng)相的黏度太高銜接用的毛細(xì)管太長(zhǎng)；銜接用的毛細(xì)管太長(zhǎng)；柱外少體積太大柱外少體積太大色譜柱柱效下降

42、色譜柱柱效下降處理方法處理方法改換色譜柱或預(yù)柱改換色譜柱或預(yù)柱動(dòng)少進(jìn)樣體積；稀釋樣品動(dòng)少進(jìn)樣體積；稀釋樣品用流動(dòng)相溶解樣品用流動(dòng)相溶解樣品運(yùn)用濃度稍高的緩沖溶液或運(yùn)用濃度稍高的緩沖溶液或者者換用其它的緩沖溶液換用其它的緩沖溶液檢查毛細(xì)管銜接檢查毛細(xì)管銜接檢查能否有漏；運(yùn)用小的檢檢查能否有漏；運(yùn)用小的檢測(cè)池測(cè)池提高色譜柱溫度提高色譜柱溫度運(yùn)用內(nèi)徑較細(xì)的較短的毛細(xì)運(yùn)用內(nèi)徑較細(xì)的較短的毛細(xì)管銜接；管銜接；檢查柱外少體積檢查柱外少體積運(yùn)用較小粒徑填料的色譜柱；運(yùn)用較小粒徑填料的色譜柱；改換色譜柱改換色譜柱出現(xiàn)脫尾峰出現(xiàn)脫尾峰能夠緣由能夠緣由色譜柱過(guò)載色譜柱過(guò)載干擾峰；雜質(zhì)干擾峰；雜質(zhì)硅膠外外未完全鍵合

43、的硅羥基的影響硅膠外外未完全鍵合的硅羥基的影響色譜柱的濾網(wǎng)堵塞色譜柱的濾網(wǎng)堵塞柱外效應(yīng)的影響；柱外效應(yīng)的影響；少體積少體積色譜柱有色譜柱有“塌陷、短流或斷流塌陷、短流或斷流處理方法處理方法動(dòng)少樣品體積；動(dòng)少樣品體積；增大色譜柱內(nèi)徑；增大色譜柱內(nèi)徑；運(yùn)用高容量的固定相運(yùn)用高容量的固定相改良樣品預(yù)處置；改良樣品預(yù)處置；調(diào)理流動(dòng)相的組成；調(diào)理流動(dòng)相的組成；運(yùn)用測(cè)試樣品合物檢查色譜柱；運(yùn)用測(cè)試樣品合物檢查色譜柱；運(yùn)用色譜純?nèi)軇┻\(yùn)用色譜純?nèi)軇┻\(yùn)用流動(dòng)相改性劑如三乙胺；運(yùn)用流動(dòng)相改性劑如三乙胺；提高緩沖溶液或鹽溶液的濃度離子對(duì)色譜提高緩沖溶液或鹽溶液的濃度離子對(duì)色譜降低流動(dòng)相的降低流動(dòng)相的pH值；值；運(yùn)用

44、堿性去對(duì)的色譜柱運(yùn)用堿性去對(duì)的色譜柱改換濾網(wǎng)；運(yùn)用柱前過(guò)濾系統(tǒng)；改換濾網(wǎng)；運(yùn)用柱前過(guò)濾系統(tǒng)；將樣品過(guò)濾將樣品過(guò)濾檢查毛細(xì)管銜接檢查毛細(xì)管銜接改換色譜柱；改換色譜柱；運(yùn)用性質(zhì)較溫暖的分別條件運(yùn)用性質(zhì)較溫暖的分別條件出現(xiàn)雙的峰或出現(xiàn)雙的峰或分叉峰分叉峰能夠緣由能夠緣由樣品體積過(guò)大；樣品體積過(guò)大；色譜柱過(guò)載色譜柱過(guò)載溶解樣品的溶劑選用不當(dāng)溶解樣品的溶劑選用不當(dāng)色譜柱有色譜柱有“塌陷、短流塌陷、短流或斷流或斷流色譜柱濾網(wǎng)堵塞色譜柱濾網(wǎng)堵塞進(jìn)樣器內(nèi)有徹底清洗進(jìn)樣器內(nèi)有徹底清洗處理方法處理方法動(dòng)少進(jìn)樣體積；動(dòng)少進(jìn)樣體積；稀釋樣品；稀釋樣品；將樣品在流動(dòng)相中溶解；假設(shè)不行，將樣品在流動(dòng)相中溶解；假設(shè)不行，盡

45、能夠?qū)⑦M(jìn)樣體積降低如盡能夠?qū)⑦M(jìn)樣體積降低如1微升微升改換色譜柱；改換色譜柱；運(yùn)用較溫暖的分別條件運(yùn)用較溫暖的分別條件改換色譜柱的濾網(wǎng)；改換色譜柱的濾網(wǎng)；運(yùn)用柱前過(guò)濾安裝；運(yùn)用柱前過(guò)濾安裝；過(guò)濾樣品過(guò)濾樣品徹底清洗進(jìn)樣器；徹底清洗進(jìn)樣器；改換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子改換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子保管時(shí)間變長(zhǎng)保管時(shí)間變長(zhǎng)能夠緣由能夠緣由流速降低流速降低硅膠外外有對(duì)性點(diǎn)硅膠外外有對(duì)性點(diǎn)鍵合相流失鍵合相流失流動(dòng)相的組成有變化流動(dòng)相的組成有變化溫度降低溫度降低處理方法處理方法檢查系統(tǒng)能否有漏；檢查系統(tǒng)能否有漏；改換泵的密封圈；改換泵的密封圈；排凈氣氣；排凈氣氣；運(yùn)用流動(dòng)相改性劑如參與三乙胺；運(yùn)用流動(dòng)相改性劑如參與三乙胺；運(yùn)用堿性去對(duì)

46、的色譜柱運(yùn)用堿性去對(duì)的色譜柱堅(jiān)持流動(dòng)相堅(jiān)持流動(dòng)相pH值在值在2-7.5 范圍內(nèi)范圍內(nèi)檢查泵；檢查濾網(wǎng)；檢查泵；檢查濾網(wǎng)；防止流動(dòng)相的揮發(fā)或降解防止流動(dòng)相的揮發(fā)或降解運(yùn)用色譜柱恒溫箱運(yùn)用色譜柱恒溫箱保管時(shí)間縮短保管時(shí)間縮短能夠緣由能夠緣由流速升高流速升高色譜柱過(guò)載色譜柱過(guò)載鍵合相流失鍵合相流失流動(dòng)相組成發(fā)生變化流動(dòng)相組成發(fā)生變化溫度升高溫度升高色譜柱老化色譜柱老化處理方法處理方法檢查泵；檢查流速檢查泵；檢查流速降低樣品的濃度或進(jìn)樣體降低樣品的濃度或進(jìn)樣體積積流動(dòng)相的流動(dòng)相的pH值堅(jiān)持在值堅(jiān)持在2-7.5 范圍內(nèi)范圍內(nèi)檢查泵；檢查濾網(wǎng)；檢查泵；檢查濾網(wǎng)；防止流動(dòng)相的揮發(fā)或降解防止流動(dòng)相的揮發(fā)或降解

47、運(yùn)用色譜柱恒溫箱運(yùn)用色譜柱恒溫箱改換色譜柱；改換色譜柱；運(yùn)用預(yù)柱運(yùn)用預(yù)柱保管時(shí)間保管時(shí)間無(wú)規(guī)那么改動(dòng)無(wú)規(guī)那么改動(dòng)能夠緣由能夠緣由流速發(fā)生變化流速發(fā)生變化色譜柱尚未平衡；色譜柱尚未平衡；緩沖溶液容量不夠緩沖溶液容量不夠流動(dòng)相組成發(fā)生變化；流動(dòng)相組成發(fā)生變化；流動(dòng)相中的溶劑互溶性差流動(dòng)相中的溶劑互溶性差色譜柱溫度發(fā)生變化色譜柱溫度發(fā)生變化雜質(zhì)在色譜柱中雜質(zhì)在色譜柱中“堆積堆積處理方法處理方法檢查能否有漏；檢查能否有漏；改換泵的密封；改換泵的密封；排凈氣氣排凈氣氣至少用至少用10倍柱體積的流動(dòng)相平衡色譜柱；倍柱體積的流動(dòng)相平衡色譜柱；運(yùn)用的緩沖溶液濃度應(yīng)堅(jiān)持在運(yùn)用的緩沖溶液濃度應(yīng)堅(jiān)持在20mM至至5

48、0mM之間之間檢查泵；檢查濾網(wǎng)；檢查泵；檢查濾網(wǎng)；防止流動(dòng)相的揮發(fā)或降解防止流動(dòng)相的揮發(fā)或降解運(yùn)用色譜柱恒溫箱運(yùn)用色譜柱恒溫箱沖洗色譜柱；沖洗色譜柱；出現(xiàn)出現(xiàn)選擇性差別選擇性差別能夠緣由能夠緣由流動(dòng)相組成發(fā)生變化流動(dòng)相組成發(fā)生變化流動(dòng)相的強(qiáng)度太小流動(dòng)相的強(qiáng)度太小溶解樣品的溶劑選用不當(dāng)溶解樣品的溶劑選用不當(dāng)色譜柱的壽命已到；色譜柱的壽命已到；色譜柱被污染色譜柱被污染溫度發(fā)生變化溫度發(fā)生變化色譜柱之間的的現(xiàn)性有差別色譜柱之間的的現(xiàn)性有差別如不同消費(fèi)廠家的柱子如不同消費(fèi)廠家的柱子處理方法處理方法檢查泵；檢查濾網(wǎng)；檢查泵；檢查濾網(wǎng)；防止流動(dòng)相的揮發(fā)或降解防止流動(dòng)相的揮發(fā)或降解運(yùn)用緩沖溶液和離子對(duì)系統(tǒng)運(yùn)

49、用緩沖溶液和離子對(duì)系統(tǒng)將樣品在流動(dòng)相中溶解；假設(shè)不行，將樣品在流動(dòng)相中溶解；假設(shè)不行，盡能夠?qū)⑦M(jìn)樣體積降低如盡能夠?qū)⑦M(jìn)樣體積降低如1微升微升改換色譜柱；改換色譜柱；改良樣品預(yù)處置；改良樣品預(yù)處置；運(yùn)用測(cè)試樣品合物檢查色譜柱；運(yùn)用測(cè)試樣品合物檢查色譜柱；運(yùn)用色譜純?nèi)軇┻\(yùn)用色譜純?nèi)軇┻\(yùn)用色譜柱恒溫箱運(yùn)用色譜柱恒溫箱改換色譜柱，同時(shí)檢查色譜柱的消費(fèi)廠家改換色譜柱，同時(shí)檢查色譜柱的消費(fèi)廠家主要規(guī)那么主要規(guī)那么 發(fā)現(xiàn)問(wèn)題 定位問(wèn)題 糾正問(wèn)題 防止問(wèn)題的再發(fā)生第三部分第三部分液相色譜方法的建立液相色譜方法的建立目錄目錄 1 前言 2 HPLC方法建立的步驟 2.1 了解樣品的有關(guān)情況 2.2 明確分析目的

50、 2.3 樣品的預(yù)處置與檢測(cè) 2.4 HPLC分析方式的選擇 2.5 色譜條件 2.6 方法的優(yōu)化，及色譜景象的解析和處置 2.7 定性和定量方法的建立及論證 3 色譜條件的選擇 3.1 流動(dòng)相的選擇 3.2 檢測(cè)器的選擇 3.3 樣品的溶解及預(yù)處置 3.4 樣品的進(jìn)樣量 3.5色譜柱的選擇及維護(hù)與再生 3.6 泵的選擇 4 分析方法建立的實(shí)例 4.1 等度分析 4.2 梯度方法的建立1 1 前言前言 HPLC作為色譜的一個(gè)的要分支，在色譜分析中占有的要的位置，將逐漸取代氣相色譜成為最的要的色譜分析手段。 HPLC技術(shù)的開(kāi)展和科技的提高，使得HPLC廣泛運(yùn)用到各個(gè)領(lǐng)域。 HPLC實(shí)驗(yàn)技術(shù)是一個(gè)

51、實(shí)驗(yàn)性很強(qiáng)的操作技藝，現(xiàn)行的各類(lèi)書(shū)籍并不能包羅一切知識(shí)，實(shí)際閱歷非常的要。 HPLC技藝是一個(gè)綜合性的技藝，需日積月累，厚積薄發(fā)，非一日之功。 出的來(lái)，跑的快，分的開(kāi)2 HPLC2 HPLC方法建立的步驟方法建立的步驟3 選擇儀器類(lèi)型，確定檢測(cè)器及其參數(shù)2 是否需要樣品預(yù)處理，是否有特殊的步驟1 了解樣品的有關(guān)情況，明確分析目的7 a 回 收 純 化 物 質(zhì)8 方 法 論 證 進(jìn) 入 常 規(guī) 實(shí) 驗(yàn) 室7 b 定 量 校 正7 c 定 性 方 法6 檢 查 出 現(xiàn) 的 各 種 現(xiàn) 象 和 問(wèn) 題 ( 包 括 儀 器 、 樣 品 線(xiàn) 定 性 等 ） 選 擇 解 決 辦 法 和 特 殊 步 驟5

52、優(yōu) 化 分 離 條 件 ， 選 擇 最 佳 檢 測(cè) 器 參 數(shù) 、 色 譜 柱 、 流 動(dòng) 相 比 例 等4 選 擇 液 相 色 譜 分 離 類(lèi) 型 ， 色 譜 柱 ， 流 動(dòng) 相 ， 其 他 相 關(guān) 條 件 （ 如 波 長(zhǎng) 等 ） ， 進(jìn) 行 預(yù) 實(shí) 驗(yàn) ， 估 計(jì) 最 佳 條 件2.1 2.1 了解樣品的有關(guān)情況了解樣品的有關(guān)情況 首先應(yīng)對(duì)樣品有足夠的了解，并明確分析目的同一樣品，不同的測(cè)試要求，其方法也能夠不一致。 樣品的的要性質(zhì)包括： 所含化合物的數(shù)目； 化學(xué)構(gòu)造官能團(tuán)； 分子量； pKa值； UV光譜圖； 被測(cè)組分在樣品中的濃度范圍； 樣品的溶解度、沸點(diǎn)及其線(xiàn)定性； 能夠存在的干擾物

53、質(zhì)及樣品的復(fù)雜程度等。 1 分析大分子、小分子還是生物分子 普通常規(guī)的HPLC分析分子量2000以下，大分子普通采用凝膠色譜、生物大分子采用不能變性的色譜體系。 2 樣品是合物、天然物質(zhì)還是根收是單一物質(zhì)。 假設(shè)是天然物質(zhì)，普通分別完全采用梯度體系。合物中能否有構(gòu)造類(lèi)似的異構(gòu)體，組分復(fù)雜的還是采用梯度，能否是系列反響的產(chǎn)物。 3 測(cè)定是主成分、還是少量成分或痕量成分。 主含量的測(cè)定普通比較容易；但少量要思索分別完全的問(wèn)題；痕量成分那么要思索檢測(cè)器的類(lèi)型，采用何種提取方法和檢測(cè)的靈敏度等。 4 分別化合物是極性，弱極性、非極性還是離子化合物、兩性化合物。 非極性化合物以正相體系較多，假設(shè)溶于反相

54、體系的溶劑，可采用反相體系。 弱極性、極性化合物采用反相較為方便，可在流動(dòng)相中比加改性劑，調(diào)理適適的pH。 離子化合物可以采用反相，調(diào)理pH；或者比加離子對(duì)試劑；也可采用離子交換。 兩性化合物中水溶性差的可采用反相；但在反相出峰快的那么思索離子交換；也可思索衍生后測(cè)定。 對(duì)于極性的糖類(lèi)物質(zhì)，可用NH2柱，有條件的用聚合物的糖柱。多糖類(lèi)的那么要采用凝膠系統(tǒng)。 大分子的極性化合物、離子化合物，往往采用特定的色譜柱，多為聚合物柱子。 手性化合物，那么要用手性流動(dòng)性或者采用手性柱。 5 樣品的溶解度、沸點(diǎn) 樣品在不同溶劑中的溶解度，對(duì)色譜條件的選擇非常的要，測(cè)定其溶解的性能，那么可以判別其化合物能夠的

55、類(lèi)型。 非極性樣品不溶于水，但溶于有機(jī)溶劑。假設(shè)只能溶于非極性溶劑，普通建議做正相。溶于極性溶劑，以反相為上策。 極性和離子化合物普通都溶于水，但在不同pH下區(qū)別能夠很大。 極性化合物在水和極性溶劑中都有一定的溶解度。 從溶解度可以判別出采用何種體系為佳。 易揮發(fā)性的低沸點(diǎn)的物質(zhì)在ELSD中難以檢測(cè)。 有存在特例。 6 樣品的線(xiàn)定性 假設(shè)樣品存在水解、光解、醇解、的化、分解那么測(cè)定時(shí)需留意。 對(duì)光敏感物質(zhì)，用棕色瓶，避光保管，不適存放，隨配隨做。 易水解的物質(zhì)、要選擇適適的溶解溶劑。 有些樣品能夠存在醇解，流動(dòng)相不能用甲醇，而要用乙腈。 易的化的物質(zhì)，溶解時(shí)可思索加抗的劑，調(diào)理pH，如PAP的

56、測(cè)定。胺類(lèi)化合物。 產(chǎn)品不線(xiàn)定的化合物，分析越快越好。 7 化合物的化學(xué)構(gòu)造官能團(tuán) 常見(jiàn)的根收構(gòu)造是苯環(huán)、雜環(huán)、多環(huán)芳烴?；鶊F(tuán)有COOH、OH、NH2、SO3H、ClBr、CHO、CO、CH3、C2H5、N=NH、SO、SO2、-O-等。 親水性的基團(tuán)在反相中出峰時(shí)間前移，疏水性的基團(tuán)出峰后移。 從存在的構(gòu)造可以判別出其在溶劑中的溶解度。 8 化合物的pK 值 知道pK值，有助于方法的建立，尤其流動(dòng)相pH的選擇。 pK的差別是官能團(tuán)呵斥的。 9 UV光譜圖 知道其吸收波長(zhǎng)的曲線(xiàn)有助于檢測(cè)，假設(shè)有DAD那么關(guān)系不大。多組分的樣品，適多項(xiàng)選擇幾個(gè)波長(zhǎng)。 同一樣品在不同的流動(dòng)相及pH最大波長(zhǎng)能夠不一致。 有雙鍵共軛的構(gòu)造紫外吸收較大，單鍵的那么在低紫外區(qū)有一定的吸收 10 樣品的復(fù)雜層度 梯度方法分析 預(yù)處置,分成幾個(gè)部分分析 痕量物質(zhì)的富集 總之，充分了解了被分別樣品的性質(zhì)，將能夠提供一個(gè)參考的分析條件，縮短分析時(shí)間和分析難度。2.2 2.2 明確分析目的明確分析目的 1 定量分析？檢出某種物質(zhì)？未知物確實(shí)定？純化制備？光譜鑒定？ 2 能否將一切組分分開(kāi)，定性？一種條件有困難？分組分析？ 3 定量分析的準(zhǔn)確度和精細(xì)度？主成分在12 4 不同樣品基質(zhì)對(duì)分別的影響如原料藥、粗品、精品、殘留、環(huán)境樣品等