腫瘤抗原致敏DC誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖及殺傷效率

1、腫瘤抗原致敏DC誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖及殺傷效率【摘要】 目的： 探討胃癌細(xì)胞抗原致敏的樹突狀細(xì)胞（DC）誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞 (T lymphocyte) 增殖和殺傷胃癌細(xì)胞的效率. 方法： 應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGMCSF）、重組人白細(xì)胞介素4（rhIL4）和腫瘤壞死因子（TNF），體外誘導(dǎo)培養(yǎng)獲取成熟DC，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表面CD83，CD80，CD86及HLADR表型；同時(shí)經(jīng)重組人白細(xì)胞介素2（rhIL2）誘導(dǎo)擴(kuò)增T淋巴細(xì)胞，檢測(cè)CD3，CD4，CD8及CD56表型. 以人胃癌OCUM2MD3細(xì)胞株凍融抗原致敏DC，然后刺激T淋巴細(xì)胞

2、，得到腫瘤抗原特異的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）. MTT法檢測(cè)致敏DC對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響和致敏DC活化的特異性CTL對(duì)胃癌細(xì)胞的體外殺傷效率. 結(jié)果：體外誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞，可獲得大量形態(tài)典型、具備強(qiáng)烈刺激增殖能力、且高表達(dá)CD80，CD86的DC及高表達(dá)CD3的T淋巴細(xì)胞；MTT法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞抗原致敏DC組刺激T淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)顯著高于未致敏DC組和對(duì)照組(P0.01)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞抗原致敏DC主要刺激T淋巴細(xì)胞增殖為CD8+的CTL（60.588.43）%，經(jīng)胃癌細(xì)胞抗原致敏DC刺激后，對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)顯著增加，致敏DC組對(duì)胃癌細(xì)胞殺傷活性（71.5

3、74.83）%，較未致敏DC組（12.531.62）%和單純T淋巴細(xì)胞組（10.451.40）%作用更為顯著（P0.01）,而且隨著效靶比增加，其殺傷效應(yīng)亦顯著增加. 結(jié)論： 胃癌細(xì)胞抗原致敏DC可顯著刺激T淋巴細(xì)胞增殖為CD8+ CTL，進(jìn)而發(fā)揮其高效殺傷胃癌細(xì)胞的作用. 【關(guān)鍵詞】 樹突細(xì)胞；T淋巴細(xì)胞；胃腫瘤；T淋巴細(xì)胞，細(xì)胞毒性0引言樹突狀細(xì)胞（dendritic cells, DC）是專職的抗原提呈細(xì)胞，與機(jī)體抗腫瘤免疫關(guān)系密切1. DC加工處理提呈抗原信息后，通過激活T淋巴細(xì)胞而發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞的免疫效應(yīng). 研究2表明，各種人DC前體細(xì)胞如臍血、骨髓及外周血CD34+細(xì)胞或CD14+

4、細(xì)胞等在聯(lián)合應(yīng)用GMCSF，IL4，TNF等因子體外培養(yǎng)下，均可誘導(dǎo)成為成熟DC. 在多種腫瘤的臨床試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)DC免疫治療具有一定的效果3. 我們以人外周血為DC來源，利用胃癌細(xì)胞凍融抗原致敏DC，觀察其誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphotytes，CTL）對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷效率，為DC治療胃癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).1材料和方法1.1材料人胃癌高侵襲OCUM2MD3細(xì)胞株，由日本大分醫(yī)科大學(xué)外一科八代正和教授惠贈(zèng). 外周血取自健康志愿者. 重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGMCSF），重組人白細(xì)胞介素4（rhIL4），白細(xì)胞介素2（rhIL2）和重組人腫瘤壞死因子（r

5、hTNF）（美國(guó)Cytolab 公司）；抗人CD3PE，CD4PE，CD8PE和CD56PE（美國(guó)Becton Dickinson公司）；四甲基偶氮唑藍(lán)（美國(guó)Sigma公司）；抗人CD83PC5，CD86PE，CD80FITC和HLADRFITC（美國(guó)BECKMAN COUNTER公司）.1.2方法1.2.1DC分離培養(yǎng)及鑒定應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血單核細(xì)胞,以rhGMCSF和rhIL4誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d后，加入TNF，于第7日收集DC，光鏡及電鏡下觀察其形態(tài). 同時(shí)分別加入熒光標(biāo)記的CD83PC5，CD80FITC，CD86PE和HLADRFITC，間接免疫熒光染色，采用文獻(xiàn)4的方法，流式

6、細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面CD83，CD80，CD86及HLADR表達(dá).1.2.2胃癌細(xì)胞凍融法制備抗原致敏DC胰蛋白酶消化、吹打收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌OCUM2MD3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2107/mL. 將人胃癌OCUM2MD3細(xì)胞以液氮反復(fù)凍融法5 制備腫瘤抗原. DC培養(yǎng)至第5日加入胃癌細(xì)胞抗原，第7日加入TNF，第8日收獲胃癌OCUM2MD3細(xì)胞抗原致敏的DC.1.2.3MTT法檢測(cè)致敏DC誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖將胃癌細(xì)胞抗原致敏DC,未致敏DC和T淋巴細(xì)胞，經(jīng)60Co照射滅活，分別取1103，3103， 1105接種于96孔培養(yǎng)板，分為致敏DC組、未致敏DC組和T細(xì)胞組. 每孔加入1105 T淋巴

7、細(xì)胞，終體積為200 L. 混合培養(yǎng)96 h后，加入MTT溶液20 L，繼續(xù)靜置培養(yǎng)4 h后，吸棄培養(yǎng)基，加入DMSO 150 L，均勻震蕩混勻10 min，自動(dòng)酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)492 nm處測(cè)定吸光度A值，空白培養(yǎng)基孔作為對(duì)照，按下面公式計(jì)算刺激增殖指數(shù)(SI). SI=各刺激組孔A492 nm /空白孔A492 nm.1.2.4MTT法檢測(cè)CTL對(duì)胃癌細(xì)胞的體外殺傷效應(yīng)將負(fù)載胃癌抗原DC,未負(fù)載胃癌 抗原DC分別取2104個(gè)細(xì)胞與T 淋巴細(xì)胞混合后及單純T淋巴細(xì)胞置于48孔培養(yǎng)板上，分為致敏DC組、未致敏DC組、T細(xì)胞組，以人胃癌OCUM2MD3細(xì)胞為靶細(xì)胞，另設(shè)單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞組和單獨(dú)靶細(xì)胞組.

8、 按效靶比101，201，401加入人胃癌OCUM2MD3細(xì)胞的培養(yǎng)液，靜置培養(yǎng)24 h. 每孔加入MTT溶液200 L，孵育4 h后全自動(dòng)酶標(biāo)儀于492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值. 殺傷活性按下式計(jì)算：殺傷活性(%)=1（實(shí)驗(yàn)組A值-單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞組A值）/單獨(dú)靶細(xì)胞A值100%.1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞表型收集T淋巴細(xì)胞（T細(xì)胞組）和經(jīng)胃癌細(xì)胞抗原致敏DC刺激擴(kuò)增的T淋巴細(xì)胞（致敏DC組），制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5106/mL，加入藻紅蛋白標(biāo)記的CD3，CD4，CD8及CD56熒光抗體孵育30 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3，CD4，CD8及CD56的表達(dá)量.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)結(jié)果以

9、xs表示，選用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，采用t檢驗(yàn)和方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1體外培養(yǎng)的DC形態(tài)人外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)rhGMGSF, rhIL4聯(lián)合誘導(dǎo)7 d后,光鏡下觀察細(xì)胞表面有毛刺狀突起；掃描電鏡(SEM) 觀察DC表面粗糙，胞體向四周伸出大量樹枝狀或裙褶狀不規(guī)則突起，有的突起末梢呈球狀膨大，眾多突起甚至遮蓋了胞體，充分展示出DC的典型形態(tài)特征；透射電鏡(TEM)下成熟DC的胞體較大，可見明顯的突起, 胞漿細(xì)胞器較發(fā)達(dá)（圖1）.2.2DC細(xì)胞表型分析培養(yǎng)7 d時(shí)，收獲的細(xì)胞以成熟DC為主. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表面CD83，CD80，CD86及HL

10、ADR表型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD80，CD86的陽(yáng)性細(xì)胞比率分別為（43.816.19）%和（51.074.32）%，CD83陽(yáng)性細(xì)胞比率可達(dá)（61.945.87）%，HLADR達(dá)（72.267.65）% （圖2）.2.3T 淋巴細(xì)胞經(jīng)胃癌細(xì)胞抗原致敏DC刺激前后改變獲得T淋巴細(xì)胞于鏡下觀察可見細(xì)胞體積較小呈圓形，符合典型淋巴細(xì)胞的形態(tài). 經(jīng)胃癌細(xì)胞抗原致敏DC刺激后，T淋巴細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，數(shù)量明顯增多，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其CD3的表達(dá)率為（99.450.35）%（圖3）.A： 光鏡下見DC表面有毛刺狀突起400； B： 掃描電鏡下見DC表面有大量皺褶和樹狀突起3500； C： 透射電鏡下見DC表面有

11、明顯突起，胞漿細(xì)胞器較發(fā)達(dá)3500.圖1培養(yǎng)7 d DC形態(tài)（略）圖2DC表面分子表型（略）A： DC刺激前T淋巴細(xì)胞； B： DC刺激后T淋巴細(xì)胞.圖3T淋巴細(xì)胞變化200（略）2.4胃癌細(xì)胞抗原致敏DC對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞增殖的影響MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，致敏DC組SI值為(57.311.5)%，顯著高于未致敏DC組（18.37.4）%,T細(xì)胞組（18.52.6）%和對(duì)照組（17.65.3）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）.2.5胃癌細(xì)胞抗原致敏DC對(duì)T淋巴細(xì)胞表型的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，T細(xì)胞組及致敏DC組的T淋巴細(xì)胞均高表達(dá)CD3，其陽(yáng)性率分別為（99.450.35）%和（98.

12、50.71）%；而致敏DC組的CD8陽(yáng)性率（60.588.43）%顯著高于T細(xì)胞組（32.524.09）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P0.05，圖4）.圖4胃癌細(xì)胞抗原致敏DC對(duì)T淋巴細(xì)胞表型的影響（略）2.6胃癌細(xì)胞抗原致敏DC誘導(dǎo)特異性CTL對(duì)胃癌細(xì)胞的體外殺傷效應(yīng)經(jīng)胃癌細(xì)胞抗原致敏DC誘導(dǎo)特異性CTL對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)顯著增加，與未致敏DC組和對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05, 圖5）.圖 5不同效應(yīng)細(xì)胞誘導(dǎo)特異性CTL對(duì)胃癌細(xì)胞的體外殺傷效應(yīng)（略）3討論DC作為機(jī)體內(nèi)專職的抗原提呈細(xì)胞，在攝取、提呈抗原及激發(fā)后續(xù)特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮著不可替代的作用. 而在DC處理提呈抗原

13、過程中，其表面分子CD80，CD86，HLADR的表達(dá)水平又起到重要的制約作用，直接關(guān)系到DC免疫激發(fā)的功能狀態(tài). 其中CD80，CD86作為DC激活T淋巴細(xì)胞過程中的重要共刺激分子作用尤為重要，其表達(dá)水平標(biāo)志著DC免疫激活能力的高低5-6. 因此測(cè)定胃癌患者體內(nèi)DC細(xì)胞表面分子的表達(dá)水平對(duì)正確判斷患者預(yù)后及確定相應(yīng)生物治療方案有一定的參考價(jià)值. 我們以外周血單個(gè)核細(xì)胞作為DC來源，應(yīng)用rhGMCSF+rhIL4+rhTNF細(xì)胞因子組合，經(jīng)78 d 培養(yǎng)，通過光鏡和掃描電鏡觀察，細(xì)胞表面有大量皺襞和樹狀突起，證明獲取到具有典型形態(tài)學(xué)特征的成熟DC，流式細(xì)胞儀分析顯示其高表達(dá)CD80及CD86共

14、刺激分子，表明DC具有高效激活T淋巴細(xì)胞的能力.宿主攻擊腫瘤依賴于特異性的抗腫瘤免疫，尤其是T細(xì)胞免疫. DC作為一專職抗原遞呈細(xì)胞，能夠誘導(dǎo)出高效而特異的抗腫瘤免疫. 其抗腫瘤機(jī)制據(jù)認(rèn)為是DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，其中CD8+ CTL可直接殺傷腫瘤細(xì)胞，是腫瘤免疫反應(yīng)的主要環(huán)節(jié). 研究表明T細(xì)胞功能與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其CD4+，CD8+比數(shù)量關(guān)系更能反應(yīng)宿主的細(xì)胞免疫狀態(tài)和抗腫瘤能力7. 張坤等8采用細(xì)胞融合技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)： SGC7901胃癌細(xì)胞DC融合疫苗激活T淋巴細(xì)胞可使其增殖能力明顯增強(qiáng). 我們用攜帶腫瘤抗原的DC刺激T淋巴細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)其增殖能力也明顯增強(qiáng)，檢

15、測(cè)其細(xì)胞表型發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞主要增殖為CD8+ CTL，CD4及CD56無(wú)明顯變化，說明腫瘤抗原DC主要通過刺激T淋巴細(xì)胞增殖為CD8+ CTL發(fā)揮抗瘤免疫功能.研究發(fā)現(xiàn)，給予動(dòng)物腫瘤相關(guān)多肽或蛋白致敏的DC不僅能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞特異性增殖，并且能產(chǎn)生針對(duì)腫瘤侵襲的防御保護(hù)能力9-11. 我們用攜帶胃癌抗原的DC刺激T淋巴細(xì)胞增殖產(chǎn)生的特異性CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞有極強(qiáng)的殺傷活性，其殺傷率可高達(dá)(71.574.83)%，表現(xiàn)出明顯的殺傷胃癌細(xì)胞的作用. 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明胃癌抗原致敏DC可通過激活腫瘤特異性CTL而具有明顯的抗腫瘤活性，為臨床應(yīng)用DC治療胃癌提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù).【參考文獻(xiàn)】 1 Banch

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