皮膚科實(shí)驗(yàn)室檢查技術(shù)操作常規(guī)原始版

1、常見皮膚科實(shí)驗(yàn)室檢查技術(shù)操作常規(guī)一真菌（癬菌）直接鏡檢【方法】1取材部位：臨床醫(yī)師采取頭癬，體癬，股癬，足癬，甲癬標(biāo)本。2操作方法：將標(biāo)本置于載玻片上，加一滴5-10%KOH，加蓋玻片，在酒精燈火焰上過三次以消化角質(zhì)蛋白，普通光學(xué)顯微鏡下檢查?！窘Y(jié)果判斷】可見真菌菌絲和/或孢子，可判斷為陽性。二疥螨蟲鏡檢【方法】1取材部位：臨床醫(yī)師采取標(biāo)本。 2操作方法：將標(biāo)本置于載玻片上，加一滴5-10%KOH（或加NS），加蓋玻片，在酒精燈火焰上過三次以消化角質(zhì)蛋白，普通光學(xué)顯微鏡下檢查。【結(jié)果判斷】見到以下任何一項(xiàng)均可判斷為陽性。1成蟲：低倍鏡下看到完整或破碎的成蟲。如用NS，有可能發(fā)現(xiàn)活動的成蟲。2蟲

2、卵：可以見到蟲體的同時(shí)見到成堆或散在的蟲卵。三陰虱檢查【方法】1取材部位：臨床醫(yī)師夾取標(biāo)本。 2操作方法：將標(biāo)本置于載玻片上，加一滴NS，加蓋玻片，普通光學(xué)顯微鏡下檢查?！窘Y(jié)果判斷】見到以下任何一項(xiàng)均可判斷為陽性。1成蟲：低倍鏡下看到完整或破碎的成蟲。如用NS，有可能發(fā)現(xiàn)活動的成蟲。2蟲卵：可以見到蟲體的同時(shí)見到成堆或散在的蟲卵。四毛囊蟲（蠕螨）的檢查【方法】臨床醫(yī)師采取，在擴(kuò)張的毛囊口擠壓出一點(diǎn)皮脂或用刀片刮出些皮脂，在載玻片加一滴液體石蠟或甘油，加蓋片輕壓使皮脂變薄，普通光學(xué)顯微鏡下檢查?！窘Y(jié)果判斷】低倍鏡下發(fā)現(xiàn)活的毛囊蟲，可判斷為陽性。五、淋球菌檢查（一）淋球菌直接鏡檢【方法】1男性患者

3、：先用NS拭盡尿道口，手指擠出尿道內(nèi)膿液，用無菌棉拭子沾取膿液涂在載物玻片上。2女性患者取宮頸口膿液，用無菌棉拭子沾取膿液涂在載物玻片上。3自然干燥后，革蘭染色或美蘭染色待檢?！窘Y(jié)果判斷】涂片中見大量多形核白細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)有革蘭氏陰性球菌，呈卵圓形或圓形，成對排列。為陽性結(jié)果。（二）淋球菌培養(yǎng)【方法】臨床取材后，立即接種于培養(yǎng)基中，不得冷藏后再接種。在5-10% CO2，37度培養(yǎng)24-48小時(shí)后觀察結(jié)果。（市場上可見試劑盒）【結(jié)果判斷】在血平皿可見圓形，平滑，透明或灰白色菌落，直徑0.5-1.0mm，革蘭氏染色陰性。必要時(shí)，做生化檢查確定菌種。六、衣原體檢查（一）免疫熒光法【方法】取材方法：男

4、性患者用白金耳或特制尿道棉拭子插入尿道口內(nèi)2-4cm，轉(zhuǎn)動1周，停留約10秒鐘后取出分泌物；女性患者經(jīng)窺陰器暴露宮頸，用無菌拭子蘸去宮頸表面分泌物，用另外一個(gè)干凈拭子伸入宮頸口內(nèi)1-2cm，轉(zhuǎn)動1周，停留10秒鐘后取出分泌物。取材后用試子頭部在載玻片上涂片，無水乙醇室溫固定15分鐘，室溫晾干，加熒光標(biāo)記的衣原體單克隆抗體，37溫育30分鐘后磷酸鹽緩沖液洗滌次。封片后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。【結(jié)果判斷】陽性標(biāo)本可以見到亮綠色包涵體。敏感性可達(dá)70-90%。（二）細(xì)胞培養(yǎng)法【方法】1.標(biāo)本取材方法同“免疫熒光法”。取材后標(biāo)本可以直接接種，也可-80保存?zhèn)溆谩?.利用滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)沙眼衣原體。將MyC

5、oy細(xì)胞（或Hela細(xì)胞）種植于含圓形蓋玻片或不含蓋玻片的24孔塑料細(xì)胞培養(yǎng)板。細(xì)胞生長液是含10%胎牛血清Dulbecco改良的MEN培養(yǎng)液。3.標(biāo)本接種 標(biāo)本化凍后將標(biāo)本管蝸旋振蕩15-30秒。將24孔塑料細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)液吸取，每孔加入0.2-0.3ml接種物，每份標(biāo)本接種兩孔，一孔接種含蓋玻片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，另一孔接種不含蓋玻片的24細(xì)胞培養(yǎng)板。同事將沙眼衣原體血清型E和L2/434/Bu用衣原體培養(yǎng)液1:400稀釋，每孔加入0.2-0.3ml作為陽性對照，僅加入衣原體培養(yǎng)液的孔作為陰性對照。接種完畢后離心細(xì)胞培養(yǎng)板（×1500g，1小時(shí)，35）。培養(yǎng)板37靜置2小

6、時(shí)，然后吸去接種物病加入衣原體培養(yǎng)液（含萬古霉素、慶大霉素、兩性霉素B、放線菌酮等），37和5%二氧化碳培養(yǎng)72小時(shí)。4、熒光抗體染色鑒定 吸取培養(yǎng)板孔內(nèi)的培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，無水乙醇室溫固定15分鐘，室溫晾干，取出蓋玻片，加入抗沙眼衣原體單克隆熒光抗體。37溫育30分鐘后磷酸鹽緩沖液洗滌3次。封片后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果?！窘Y(jié)果判斷】熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)有3個(gè)以上蘋果綠色的熒光顆粒者判作陽性。陰性標(biāo)本的另一不含蓋玻片的孔應(yīng)進(jìn)行盲傳，即用超聲波破碎機(jī)打擊該孔，接種在新一代McCoy細(xì)胞上。同樣的方法再次熒光抗體染色，鑒定培養(yǎng)結(jié)果。（三）快速酶分析法【方法】取材方法同“免疫熒光法”目前國

7、內(nèi)外許多生物技術(shù)公司都提供沙眼衣原體快速酶免疫分析（EIA）試劑盒，不同廠家對試驗(yàn)要求不盡相同，操作方法有所不同?？梢詤⒄赵噭┖猩咸峁┑木唧w操作步驟進(jìn)行?！窘Y(jié)果判斷】通過顯色條帶肉眼觀察，也可采用酶標(biāo)儀測定結(jié)果。此方法的特點(diǎn)時(shí)快速、簡單，不足之處在于敏感性較低，原因與這種檢查需要疣足夠多的抗原量有關(guān)。七、皰疹病毒免疫熒光法檢查【方法】1.取材部位 在新發(fā)生1-天內(nèi)的水皰部位取材（新發(fā)皰疹處存在的病毒數(shù)量最多，隨著皰疹破潰、愈合、病毒數(shù)量迅速減少）。2.操作方法用手術(shù)刀或鈍刀將水皰挑破，刮取基底部為取材，然后圖片，室溫干燥后用冷丙酮固定10分鐘，磷酸鹽緩沖液洗2次，加入熒光素標(biāo)記抗HSV抗體，3

8、7溫育30分鐘后乙酸鹽緩沖液洗滌3次。封片后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果?！窘Y(jié)果判斷】陽性結(jié)果：細(xì)胞內(nèi)可見亮綠色著色。八、陰道毛滴蟲直接鏡檢【方法】在載玻片上加1滴生理鹽水，將棉拭子蘸取陰道分泌物（男性為尿道分泌物或前列腺液）混入鹽水中，立即在顯微鏡下查看?！窘Y(jié)果判斷】鏡下見到呈波狀移動的毛滴蟲為陽性。有時(shí)可見毛滴蟲周圍的白細(xì)胞被推移。九、皮膚斑貼試驗(yàn)【方法】1. 試驗(yàn)部位：上背部脊柱兩側(cè)的正常皮膚。2. 去除斑試器的保護(hù)紙、將準(zhǔn)備好的變應(yīng)原按順序置于鋁制斑試器內(nèi)。斑試物排練順序?yàn)樽陨舷?，自左右并做?biāo)記。斑試劑用量，軟膏制劑用 25ul 直接放入斑試器中，液體制劑用 25ul 滴在放入斑試器中的濾紙

9、片上（10號甲醛）。注意加斑試物時(shí)盡量不要沾到斑試器邊緣。3. 將加有斑試物的斑試器膠帶自下向上貼牢、貼平并用手掌輕輕壓幾下，以便排出空氣。4. 斑貼試驗(yàn)時(shí)間：48小時(shí)。5. 觀察結(jié)果時(shí)間：貼敷后48小時(shí)，首先去除斑試器，為避免斑試器壓迫皮膚所可能造成的反應(yīng)，應(yīng)在去除斑試器至少30分鐘后觀察結(jié)果。斑貼試驗(yàn)注意事項(xiàng)：1. 皮炎急性期不易作斑貼試驗(yàn)，病人應(yīng)在皮炎完全消退兩周后作斑貼試驗(yàn)。2. 必須囑咐受試者，如發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)，可隨時(shí)去掉斑試物。3. 病人受試前兩周及受試期間不要內(nèi)服皮質(zhì)類固醇激素（強(qiáng)的松15mg/日即可抑制斑貼試驗(yàn)反應(yīng)），試驗(yàn)前兩天及受試期間易停用抗組織胺類藥物。4. 斑試期間不易洗

10、澡、飲酒及搔撓斑試部位。5. 應(yīng)保持斑試物在皮膚上48小時(shí)，盡量不要過早地去除斑試物，試驗(yàn)部位要有標(biāo)記，膠帶粘貼一定要密閉，以避免出現(xiàn)假陽性結(jié)果。必要時(shí)（如高度懷疑對該變應(yīng)原過敏而72小時(shí)呈陰性者），在斑貼后第七天進(jìn)行第三次觀察或重復(fù)試驗(yàn)。6. 斑貼過篩試驗(yàn)的同時(shí)，不應(yīng)忽視對患者實(shí)際接觸的可疑制敏物質(zhì)進(jìn)行斑貼試驗(yàn)?！窘Y(jié)果判斷】（ ） ：無反應(yīng)。（ + ） ：紅斑。（ + + ） ： 紅斑、水腫。（ + + + ） ：紅斑、水腫，并出現(xiàn)水皰。（ + + + + ）：紅斑、水腫。十梅毒實(shí)驗(yàn)室診斷（一）快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR）【方法】采集患者血樣，收集血清。1定性試驗(yàn)：將被檢血清0.05

11、ml（血漿也可）加于專用紙卡的反應(yīng)圈內(nèi)（內(nèi)徑18mm），并鋪展均勻。繼用經(jīng)校準(zhǔn)過的平口針頭（60±2滴/ml）垂直加1滴RPR抗原懸液于反應(yīng)圈內(nèi)的血清中，100r/min機(jī)械式手工轉(zhuǎn)動8min。于光線充足處及時(shí)以肉眼觀看結(jié)果。必要時(shí)可稍許傾斜卡紙，以助觀看。2半定量試驗(yàn)：取一排試管，用生理鹽水將被檢血清作倍比稀釋。其余操作同定性試驗(yàn)。以發(fā)生凝集反應(yīng)的最高稀釋度為該血清的反應(yīng)素滴度。按下法報(bào)告結(jié)果：非反應(yīng)性（N）：炭粒均勻懸浮或中央呈集一點(diǎn)。反應(yīng)性（R）：出現(xiàn)特征性炭黑凝集而不論其凝集程度。凡反應(yīng)性結(jié)果的血清應(yīng)再做半定量試驗(yàn)，標(biāo)明其滴度。每次試驗(yàn)時(shí)用已知陽性血清作為陽性對照?！窘Y(jié)果判斷

12、】陽性 圓圈內(nèi)出現(xiàn)黑色凝集顆?；蛐跗?，根據(jù)沉積物的多少記錄為+、+或+-。陰性 不出現(xiàn)沉積物主要用于初篩實(shí)驗(yàn)或治療后隨訪。（二）不需要加熱血清反應(yīng)素試驗(yàn)（USR）【方法】 玻片定性實(shí)驗(yàn) (1)吸取待檢血清(不必滅活)0.05ml，加于玻片的圓圈中，并分散到整個(gè)圓圈。用1ml注射器專用針頭吸取抗原，每份待檢標(biāo)本上滴加1滴，搖動玻片4分鐘，觀察結(jié)果。 定量試驗(yàn)同RPR【結(jié)果判斷】先用肉眼觀察，再用低倍顯微鏡(放大100倍 )觀察抗原顆?；蚰恋?，按以下方式記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。陰性（-）：顆粒細(xì)小，分布均勻。可疑陽性（±）：顆粒分布不規(guī)則，或?yàn)榧?xì)小的粗糙物。弱陽性（+）：在顯微鏡下可見小塊狀物

13、，均勻分布。陽性（+ +）：肉眼可見小塊狀物，在顯微鏡下可見較大的塊狀物，懸液清亮 。強(qiáng)陽性（+ + + + + + +）：肉眼可見大或較大的塊狀物。玻片半定量實(shí)驗(yàn)玻片定性實(shí)驗(yàn)陽性(+ +)以上者做半定量實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步診斷。先將待檢血清用0.9%氯化鈉稀釋成6個(gè)稀釋度，即血清原液1：2、1：4、1：8、1：16、1：32，各取0.05ml稀釋血清加在玻片的圓圈內(nèi)，按定性實(shí)驗(yàn)方法操作和判定結(jié)果。主要用于初篩實(shí)驗(yàn)或治療后隨訪（三）性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)（VDRL）【方法】1.VDRL抗原配置方法（1）吸取0.3mlVDRL緩沖液置30ml小瓶。（2）吸取0.3mlVDRL抗原逐滴迅速加入小瓶內(nèi)的VDR

14、L緩沖液內(nèi)（約4秒鐘），隨后搖動10秒鐘，使之混勻。（3）立即加入2.4mlVDRL緩沖液，蓋上瓶蓋，來回顛倒搖動小瓶10秒鐘30次，即為VDRL抗原。此抗原僅可用1天。2.VDRL玻片定性和定量試驗(yàn)方法與USR試驗(yàn)完全相同，由于VDRL抗原配置時(shí)混懸的技術(shù)較高，而配置成的VDRL抗原僅可使用1天，往往會造成抗原的浪費(fèi)（每次最少需配置約200人份量），而且待測血清需在試驗(yàn)前滅火，故給實(shí)驗(yàn)室?guī)碓S多不變，臨床上除用腦脊液檢查外已甚少用此方法。 （四）梅毒螺旋體血凝試驗(yàn)（TPHA）【試驗(yàn)原理】試驗(yàn)血球?yàn)橛寐菪w特異性抗原包被經(jīng)過醛化和鞣化的雞紅細(xì)胞，對照血球?yàn)闆]有用上述抗原包被的經(jīng)過醛化和鞣化的雞

15、紅細(xì)胞，如果是陽性標(biāo)本，當(dāng)和致敏的雞紅細(xì)胞混合后，抗體和抗原的結(jié)合會引起致敏血球的凝集，在血凝板底部形成凝集塊，如為陰性標(biāo)本 ，則血細(xì)胞在孔底形成致密的沉淀。【操作方法】1. 在反應(yīng)板的第一排：每孔加25ul（1滴）稀釋液2. 在反應(yīng)板的第二排：每孔加100ul（4滴）稀釋液3. 在反應(yīng)板的第三排和第四排：每孔加25ul（1滴）稀釋液。4. 取標(biāo)本25ul，加在第一排的孔中。5. 對樣品進(jìn)行以下稀釋：用25ul移液器將加樣后的第一排孔中的液體混勻后取出25ul加入第二排的孔中，混勻后再取25ul加入第三排的孔中，混勻后，從第三排孔中吸出25ul丟棄，另從第二排孔中取25ul加入第四排孔中，混勻

16、后，再從第四排孔中吸25ul丟棄。6. 在第四排孔中加25ul（1滴）試驗(yàn)細(xì)胞懸液，在第三排孔中加75ul（1滴）對照細(xì)胞懸液。輕輕搖晃反應(yīng)板后加蓋靜置4560分鐘后判讀結(jié)果。【結(jié)果判斷】目測：凡出現(xiàn)細(xì)胞凝集者為陽性反應(yīng)，不出現(xiàn)凝集者為陰性反應(yīng)。 /不凝集：細(xì)胞沉積在板孔中央呈邊緣光滑的紐扣狀； ±/可凝：細(xì)胞沉積在板孔中央呈邊緣光滑的環(huán)狀； /凝集：細(xì)胞形成多邊形或不規(guī)則環(huán)狀沉積； 2+4+/強(qiáng)凝集：細(xì)胞形成邊緣粗糙不規(guī)則形狀或薄膜狀覆蓋到板孔底。加入對照血細(xì)胞的反應(yīng)孔不應(yīng)出現(xiàn)凝集，如果出現(xiàn)凝集，說明存在抗血細(xì)胞抗體，應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)。重復(fù)試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)先用對照細(xì)胞懸液將細(xì)胞懸液將標(biāo)本按1：

17、4稀釋，在室溫靜置4560分鐘，再經(jīng)1000rpm離心5分鐘，取上清液按1：5稀釋，再進(jìn)行試驗(yàn)，如果加入試驗(yàn)細(xì)胞懸液仍出現(xiàn)凝集，可判為陽性結(jié)果?！咀⒁馐马?xiàng)】1. 反應(yīng)板使用前最好使用清潔液處理后，涼干后再使用。2. 將試劑從冰箱取出后平衡至室溫，充分混勻后進(jìn)行試驗(yàn)。3. 室溫應(yīng)保持在25-30，建議放入28恒溫箱中。4. 結(jié)果判斷應(yīng)嚴(yán)格按操作時(shí)間進(jìn)行。5. 如因運(yùn)輸中有試劑盒倒置或振動，造成部分懸液中的 細(xì)胞粘在瓶蓋上，在操作中切勿將粘在瓶蓋上的細(xì)胞再混入懸液中，否則可能會影響試驗(yàn)結(jié)果。主要用于確證試驗(yàn)（五）梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)（TPPA） 【材料】1.溶解溶液A：用于溶解致敏顆粒C和非致敏

18、顆粒D。2.血清稀釋液B：用于稀釋血清標(biāo)本。3.致敏顆粒C4.非致敏顆粒D5.對照用陽性血清E6.U型反應(yīng)板。 【方法】1.吸取B液100µl加入第1孔，B液25µl分別加入第2至第10孔中。2.血清稀釋，吸取待檢血清25µl放入第1孔，混勻后吸取25µl到第2孔，重復(fù)其稀釋步驟至第10孔時(shí)，混勻后棄去25µl液體;。3.滴加致敏和未致敏顆粒，混勻細(xì)胞工作液，第3孔加25µl未致敏顆粒;第4至第10孔加25µl致敏顆粒；顆粒加入完畢，將反應(yīng)板置微量振蕩器上振蕩30s，置濕盒內(nèi)，15-25孵育2h觀察結(jié)果?！窘Y(jié)果】+ + + + + +：顆粒凝集覆蓋整個(gè)孔底，多邊形膜狀，邊緣粗糙。+： 顆粒凝集呈多邊形性粗糙大環(huán)狀。±： 顆