生物技術(shù)大全

1、一細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)過(guò)程：1、 復(fù)蘇1. 把凍存管從液氮中取出來(lái)，立即投入37水浴鍋中，輕微搖動(dòng)。液體都融化后（大概1-1.5分鐘），拿出來(lái)噴點(diǎn)酒精放到超凈工作臺(tái)里。2. 把上述細(xì)胞懸液吸到裝10ml培養(yǎng)基的15ml的離心管中（用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍，把粘在壁上的細(xì)胞都洗下來(lái)），1000轉(zhuǎn)離心5分鐘。3. 把上清液倒掉，加1ml培養(yǎng)基把細(xì)胞懸浮起來(lái)。吸到裝有10ml培養(yǎng)基的10cm培養(yǎng)皿中前后左右輕輕搖動(dòng)，使培養(yǎng)皿中的細(xì)胞均勻分布。4. 標(biāo)好細(xì)胞種類和日期、培養(yǎng)人名字等，放到CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后換培養(yǎng)基。5. 3天換一次培養(yǎng)基。二、 傳代1. 培養(yǎng)皿中的細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%-90%時(shí)要傳代

2、。2. 把原有培養(yǎng)基吸掉。3. 加適當(dāng)?shù)囊鹊鞍酌福芨采w細(xì)胞就行），消化1-2分鐘。4. 細(xì)胞都變圓后加如入等體積的含血清的培養(yǎng)基終止消化。5. 用移液槍吹打細(xì)胞，把細(xì)胞都懸浮起來(lái)。6. 把細(xì)胞吸到15ml的離心管中，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘。7. 倒掉上清液，加1-2ml培養(yǎng)基，把細(xì)胞都吹起來(lái)。8. 根據(jù)細(xì)胞種類把細(xì)胞傳到幾個(gè)培養(yǎng)皿中。一般，癌細(xì)胞分5個(gè)，正常細(xì)胞傳3個(gè)。繼續(xù)培養(yǎng)。三、 凍存把細(xì)胞消化下來(lái)并離心（同上）。用配好的凍存液把細(xì)胞懸浮起來(lái)，分裝到滅菌的凍存管中，靜止幾分鐘，寫明細(xì)胞種類，凍存日期。4 30min，-20 30min，-80過(guò)夜，然后放到液氮灌中保存。凍存液的配制： 70

3、%的完全培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO. DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。要注意的就是無(wú)菌操作！二PCR技術(shù)過(guò)程：PCR技術(shù)操作程序和優(yōu)化方法典型的PCR操作      (一)  試劑       (1)引物根據(jù)待擴(kuò)增DNA不同，引物亦不同。       (2)耐熱DNA聚合酶：此酶是從耐熱細(xì)菌中分離出來(lái)的，能耐受高溫(93100)。       (3)10x PCR緩沖液：  500mm01

4、L KCl；  100mmolL Tris一HCl(pH8.4，  20)，150mmolL MgCl2，  lmgm1明膠。       (4)5mmo1L dNTP貯備液：將dATP，dCTP，dGTPT和dTTP鈉鹽各100mg合并，加3m1滅菌去離子水溶解，用NaoH調(diào)pH至中性，分裝每份300v1， (-) 20保存dNTP濃度最好用uv吸收法精確測(cè)定。另外?，F(xiàn)在已有中性dNTP溶液商品供應(yīng)(Sigma公司和Pharmacia公司等).      

5、; (5)標(biāo)本處理試劑：不同標(biāo)本所需試劑不同，根據(jù)具體情況而定.       (二)  操作程序      利用PcR擴(kuò)增的操作程序基本相同，只是根據(jù)引物與靶序列的不同，選擇不同的反應(yīng)體系與循環(huán)參數(shù)(見本章第：節(jié))o基本的操作是將PcR必需反應(yīng)成分加入一微量離心管中，然后置于一定的循環(huán)參數(shù)條件下進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室或每個(gè)人都有不同的操作習(xí)慣，但需遵守一定的操作規(guī)范。      我們推薦下述操作程序，因這樣操作可最大程度地增加反應(yīng)的成功率。 

6、    (1)向一微量離心管中依次加入：      ddH20    補(bǔ)至終體積(終體積50100ul)      10 x PCR緩沖液    110體積      dNTP    各200umolL      引物    各1umolL      DNA模板   

7、10*10一10*10*10*10*10拷貝      混勻后，離心15s使反應(yīng)成分集于管底。(2)加石蠟油50100ul于反應(yīng)液表面以防蒸發(fā)。置反應(yīng)管于97c變性7min(染色體DNA)或5min(質(zhì)粒DNA).       (3)冷至延伸溫度時(shí)，加入15U Taq DNA聚合酶，在此溫度作用1min.      (4)于變性溫度下使模板DNA變性適當(dāng)時(shí)間。      (5)在復(fù)性溫度下使引物與模板雜交一定時(shí)間。  

8、0;   (6)在延伸溫度下使復(fù)性的引物延伸合適的時(shí)間。      (7)重復(fù)(4)一(6)步2530次。每次即為一個(gè)PcR循環(huán)o      (8)微量瓊脂德凝膠電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物(見本章第7節(jié))o      上述過(guò)程可以用PcR自動(dòng)熱循環(huán)儀進(jìn)行，也可以設(shè)定3個(gè)恒溫水浴鍋手工操作.第二節(jié)  PCR條件的優(yōu)化      PCR必需具備下述基本條件：模板核酸(DNA或RNA)；人工會(huì)成的寡核苷酸引物；合

9、適的緩沖體系；Mg2+；三磷酸脫氧核苷酸；耐熱DNA聚合酶；溫度循環(huán)參數(shù)(變性、復(fù)性和延伸的溫度與時(shí)間以及循環(huán)數(shù))o另外，還有一些其它因素，如二甲基亞砜、甘油、石蠟油、明膠或小牛血清白蛋白等也影響某些特定PCR。下面分別討論這些因素在PCR反應(yīng)中的作用及其對(duì)PCR的影響。      一、模扳核酸      PcR可以以DNA或RNA為模板進(jìn)行核酸的體外擴(kuò)增。不過(guò)RNA的擴(kuò)增需首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后才能進(jìn)行正常PCR循環(huán)。核酸標(biāo)本來(lái)源廣6t可以從純培養(yǎng)的細(xì)胞或微生物中提取，也可以從臨床標(biāo)本(血、尿、糞便、體腔積液、嗽

10、口水等)、犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本(血班、毛發(fā)、精斑等)和病理解剖標(biāo)本(新鮮的或經(jīng)甲醛固定石蠟包埋組織)以及考古標(biāo)本中直接提取。無(wú)論標(biāo)本來(lái)源如何，待擴(kuò)增核酸都需部分純化使核酸標(biāo)本中不合DNA聚合酶抑制劑。      PcR反應(yīng)中模板加入量一般為10*10一l0*10*10*10*10拷貝的靶序列。1ug人基因組DNA相當(dāng)于3xl0*10*10*10*10個(gè)單拷貝的靶分子；10ng酵母DNA相當(dāng)1：3xl0*10*10*10*10靶分子，1ng大腸桿菌DNA相當(dāng)于3xl0*10*10*10*10靶分子；1的M13噬菌斑相當(dāng)于 10*l0*10*10*10*10靶分子。

11、因此，擴(kuò)增不同拷貝數(shù)的靶序列時(shí)，加入的合靶序列的DNA量亦不同。如真核rRNA基因有200500拷貝，反應(yīng)中僅需加入0.52ng人基因組DNA即可。      以質(zhì)粒DNA或染色體DNA為模板時(shí)的擴(kuò)增最適條件是不同的。前者所需的酶量少，循環(huán)數(shù)夕，溫度不如染色體DNA要求嚴(yán)格。擴(kuò)增染色體DNA時(shí)至少需2530循環(huán)，如在第15循環(huán)后補(bǔ)加一些Taq酶會(huì)獲得更好的擴(kuò)增效果。      擴(kuò)增靶序列的長(zhǎng)度根據(jù)不同目的而不同。用于檢測(cè)目的的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度一般為500bp以內(nèi)，以100一300bp為最好。用Taq DNA聚合酶在合適

12、條件(較長(zhǎng)延伸時(shí)間)下，可擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)10一20kb的片段。      二、引物      PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小是山特異引物限定的。因此，引物的設(shè)計(jì)與合成對(duì)PCR的成功與否有著決定性的意義。      (一)  引物合成的質(zhì)量      合成的引物必須經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或反向高壓液相層析(HPLC)純化。因?yàn)楹铣傻囊镏袝?huì)有相當(dāng)數(shù)量的“錯(cuò)誤序列”，其中包括不完整的序列和脫膘吟產(chǎn)物以及可檢測(cè)到的堿基修飾的完整鏈和高分子量

13、產(chǎn)物。這些序列可導(dǎo)致非特異擴(kuò)增和信號(hào)強(qiáng)度的降低。因此，PCR所用引物質(zhì)量要高且需純化。凍干引物干20至少保存3224個(gè)月，液體狀于-20可保存6個(gè)月。引物不用時(shí)應(yīng)存20保存。      (二)  引物的設(shè)計(jì)原則      遵循一些簡(jiǎn)單的規(guī)則有助于沒計(jì)PcR引物，通過(guò)微機(jī)的幫助更有利于PCR的成功。關(guān)于引物的詳細(xì)設(shè)計(jì)原則與方法詳見本章第三節(jié)。      (三)  引物的用量及其計(jì)算      一般P

14、CR反應(yīng)中引物的終濃度為021umolL，在此范圍內(nèi)，PCR產(chǎn)物量基本相同。但引物低于0.2umolL時(shí)，則產(chǎn)物量降低。引物濃度過(guò)高會(huì)促進(jìn)引物的錯(cuò)誤引導(dǎo)非特異產(chǎn)物合成，還會(huì)增加引物二聚體的形成。非特異產(chǎn)物和引物二聚體也是PCR反應(yīng)的底物，與靶序列競(jìng)爭(zhēng)DNA聚合酶，dNTP底物，從而使靶序列的擴(kuò)增量降低。      引物濃度的計(jì)算可按下面的方法進(jìn)行：摩爾淬滅系數(shù)（Em)是lcm光程比色杯中測(cè)定1molL寡核苷酸溶液在UV 260nm下的光密度0D)值。Em可按下式計(jì)算：EMa(16000)十b12000)十c(7000)十d(9600) 

15、60;   其中，a、b、c和d分別代表寡核苷酸中A、G、C和T的個(gè)數(shù)。      例如，  純化的20mer寡核苷酸溶于0.1ml水中，取10ul稀釋至10mL，測(cè)其0D0.76。原液的0D為0.76x100=76。若此寡核苷酸堿基組成為A5，G5，C5*T5，其EM為：      EM5(16000)十5(12000)十5(7000)十5(9600)223000      因此，原液個(gè)寡核苷酸的摩爾濃度為：   

16、   762230003.4x10-4moIL=340nmolL      三、緩沖液      目前最為常用的緩沖體系為1050mmolL TrisHCl(pH8.38.8、20c)o Tris是一種雙極性離子緩沖液，20時(shí)其pKa值為8.3，pKa值為-0.021。因此，20mmol/L Tris一HCl(pH8.3, 20)在實(shí)際PCR中，PH變化于6.878之間。改變反應(yīng)液的緩沖能力,如將Tris濃度加大到50mmolL，pH 8.9，有時(shí)會(huì)增加產(chǎn)量。反應(yīng)混合液中50mmolL以內(nèi)的KC

17、l有利于引物的退火，50mm01L NaCl或50mmolL以上的KCl則抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反應(yīng)液中以NH4+代K+,其濃度為16.6mmolL。反應(yīng)中加入小牛血清白蛋白(100ugml或明膠(0.01)或Tween20(0.05一0.1)有助于酶的穩(wěn)定，  反應(yīng)中加入5mmolL的二巰蘇醇DTT)也有類似作用，尤其在擴(kuò)增長(zhǎng)片段(此時(shí)延仲時(shí)間長(zhǎng))比加入這些酶保護(hù)劑對(duì)PCR反應(yīng)足有利的。      四、Mg2+，      Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的。因此，反應(yīng)中優(yōu)

18、化Mg2+濃度是非常有益的。Mg2+濃度除影響酶活性與忠實(shí)性外，也影響著引物的退火，模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，產(chǎn)物的特異性，引物二聚體的形成等。Mg2+濃度過(guò)低時(shí)，酶活力顯著降低；過(guò)高時(shí)，則酶催化非特異的擴(kuò)增。需指出的是，PcR混合物中的DNA模板、引物和dNTP的磷酸基因均可與Mg2+結(jié)合，降低Mg2+實(shí)際濃度。Taq DNA聚合酶需要的是游離Mg2+。因此，PCR中Mg2+的加入量要比dNTP濃度高0.22.5mmolL。最好對(duì)每種模板，每種引物均進(jìn)行Mg2+濃度的優(yōu)化。另外還需注意引物和模板DNA原液中如含EDTA等螯合劑也會(huì)影響游離Mg2+濃度。    

19、  優(yōu)化Mg2+濃度法：首先須知模板DNA量，引物和dNTP濃度和設(shè)定的PcR循環(huán)參數(shù)。反應(yīng)中的PcR緩沖液中不加Mg2+。Mg2+是從10mmolLMg2+貯存液中逐一加入反應(yīng)管中。開始以05mmolL遞增(0.5，1.0，1.5，2.0，2.55.0mmolL)，在確定了Mg2+大概濃度以后，再在該濃度上下，以0.2mmolL遞增和遞減幾個(gè)濃度來(lái)精確確定Mg2+的最適濃度。      五、三磷酸脫氧核苷酸（dNTP)      貯備dNTP液應(yīng)用NaoH調(diào)pH至中性，其濃度用分光光度計(jì)測(cè)定。貯備液為5

20、10mmolL，分裝后20保存。在PcR的重復(fù)熱循環(huán)過(guò)程中共熱穩(wěn)定性應(yīng)為：50循環(huán)后約有50仍為dNTP。反應(yīng)小練種dNTP(dATP，dGTP，dTTP和dCTP)的終濃度為20-200umolL，在此范圍內(nèi)，PCR產(chǎn)物量、特異性與合成忠實(shí)性間的平衡最佳。所用的四種dNTP終濃度應(yīng)相等，以使錯(cuò)誤摻入率降至最低。開始發(fā)明PcK時(shí)，以K1enow片段催化DNA的合成，其dNTP濃度要求1.5mmolL，而耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使dNTP的使用濃度明顯降低，這可減少在非靶位點(diǎn)的錯(cuò)誤引導(dǎo)和降低dNTP的錯(cuò)誤摻入，從而改善了PCR的特異性與忠實(shí)性。最低的適宜dNTP濃度可根據(jù)特定靶序列長(zhǎng)度和堿基組成來(lái)

21、確定。如在100ul反應(yīng)液中，每種dNTP若為20umolL，理論上足以合成26ugDNA或10pmol的400bp序列。有報(bào)道應(yīng)用每種州20umolL可成功地?fù)斐?0*10*10*10*10*10*10拷貝DNA分子中一個(gè)ras點(diǎn)突變。但如此低濃度的dNTP在常規(guī)PCR中應(yīng)避免。因?yàn)楸３炙姆NdNTP的濃度均在按種dNTPKm值(10-15umolL)以上，對(duì)保持堿基摻入忠實(shí)性是很重要的。dNTP終濃度大于50mmolL時(shí)會(huì)抑制TaqDNA聚合酶活性。另外，dNTP的類似物也可摻入PCR產(chǎn)物(參考本章第十節(jié)）。      六、耐熱DNA聚合酶 

22、     自從耐熱Taq DNA聚合酶引入PCR后，  又有多種耐熱DNA聚合酶(VENT和Tth等)相繼用于PcR。關(guān)于各種耐熱DNA聚合酶的性質(zhì)詳見本章第四節(jié)，但目前仍以TaqDNA聚合酶應(yīng)用較多。不同來(lái)源聚合酶制備條件、測(cè)定方法和(或)單位定義有所不同，使用時(shí)需加以注意。下面討論的酶使用情況是以PEcetus公司生產(chǎn)的Taq聚合酶為依據(jù)的。在其它參數(shù)最佳時(shí)，每100ul反應(yīng)液中含12.5U(比活性為20Upmol)TaqDNA聚合酶為佳。然而，酶的需要量可根據(jù)不同的模板分子或引物而變化。當(dāng)優(yōu)化PcR時(shí)，最好在每100ul反應(yīng)體積中加入0.

23、5-5U酶的范圍內(nèi)試驗(yàn)最佳酶濃度。如果酶濃度太高，則瓊脂糖凝膠電泳中會(huì)出現(xiàn)非特異擴(kuò)增帶；過(guò)低時(shí)，則靶序列產(chǎn)量很低。       PCR后可通過(guò)下述方式之一滅活Taq DNA聚合酶：(1)99100C加熱10min(2)加入EDTA Na2至10mmolL整合Mg2+；(3)酚一氯仿抽提、乙醇沉淀PCR產(chǎn)物。     七、溫度循環(huán)參數(shù)      (一)  變性溫度與時(shí)間      PCR的變性一步很重要。此步若不能使靶

24、基因模板和(或)PcR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。典型的變性條件是9530s，或9715s，更高的溫度可能更有效，尤其是對(duì)富合G十C的靶基因。DNA在其鏈分離溫度(strand separation temperature響酶活性。最簡(jiǎn)單的方法是在加Taq聚合酶前先使模板在97變性710min,在以后的循環(huán)中，將模板DNA在94或95變性1min，對(duì)PCR的成功亦有益處。環(huán)狀質(zhì)粒DNA模板最好酶切線性化，因環(huán)狀DNA復(fù)性極快。在擴(kuò)增短片段(100一300bp)時(shí)，可用簡(jiǎn)便、快速的兩步PcR法，同時(shí)在510個(gè)循環(huán)后，將變性溫度降至8790可改善PCR產(chǎn)量。具體降低程度則根據(jù)共體反應(yīng)和使用的

25、PCR儀而定。       (二)  復(fù)性溫度與時(shí)間      如果說(shuō)變性溫度對(duì)PCR反應(yīng)的成敗是關(guān)鍵，那么復(fù)性溫度則決定著PcR的特異性。引物復(fù)性所需的溫度與時(shí)間取決于引物的堿基組成、長(zhǎng)度和濃度。合適的復(fù)性溫度應(yīng)低于擴(kuò)增引物在PcR條件下真實(shí)Tm值的5。根據(jù)下式計(jì)算最適復(fù)性溫度(Taopt)有助于PCR的成功。      Taopt =0.3Tm1十0.7Tm2-14.9      其中，Tm1為引物的Tm值，Tm

26、2為產(chǎn)物的Tm值。      實(shí)際上，由于模板量呈指數(shù)增加，PCR每一個(gè)循環(huán)中的Taopt均不同。因此，采用變化的Taopt (第一循環(huán)為Taopt -8，以后每隔一循環(huán)增加1)，對(duì)擴(kuò)增質(zhì)粒模板中小于1kb的靶片斷是有益的 (產(chǎn)量增加，循環(huán)數(shù)減少)，尤其對(duì)300bp以內(nèi)片段的擴(kuò)增更為有效。這種變化Taopt法似乎對(duì)長(zhǎng)片斷和染色體DNA的擴(kuò)增影響不大。但前幾個(gè)循環(huán)在低Ta值下進(jìn)行，然后再于Taopt下擴(kuò)增，可增加從染色體DNA中擴(kuò)增靶序列的量。      對(duì)未知序列的擴(kuò)增很難預(yù)知其G十c含量，因此，無(wú)法計(jì)算上式中的T

27、m2，不免暴露了上述估算法的缺陷。另一種更簡(jiǎn)便的方法是通過(guò)引物的有效長(zhǎng)度(1n)來(lái)信算。在此，還需引入另一概念，即有效啟動(dòng)溫度(effective priming temperature，Tp)。 Tp是最佳引物介導(dǎo)擴(kuò)增發(fā)生時(shí)的最高溫度。Tp在一定范圍(20一35個(gè)核苷酸)內(nèi)與Ln呈直線相關(guān)。      Lp22十1.46(1M)    (6)      其中Ln2(G十C)十(A十T)    (7)      最適復(fù)性溫度為Tp +o

28、r-25。      該法估算的最適復(fù)性溫度較上法高些。Tp值較引物模板的Tss倪高5-10，這是因?yàn)橐飶?fù)性后，DNA聚合酶很快發(fā)生聚合反應(yīng)，在引物3端加上數(shù)個(gè)堿基使引物模板更穩(wěn)定，易于在較高溫度下發(fā)生廷伸。      研究表明，引物的復(fù)性是受動(dòng)力學(xué)因素控制的，而不是受熱力學(xué)參數(shù)控制的。它取決于引物解離與延伸效率間的平衡。Tp不僅是PcR的最適復(fù)性溫度，也是PcR最佳特異性溫度，在等位基因特異PCR(AsPCR)時(shí)，決定Tp很重要。      Tp值基本上不受Mg2+濃度影

29、響，當(dāng)Mg2+由15mmolL升至10mmolL時(shí)，Tp才升高3。      確定了復(fù)性溫度后，復(fù)性時(shí)間并不是關(guān)鍵因素。但復(fù)性時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)增加非特異的復(fù)性。復(fù)性時(shí)間也不能太短(30s)。如用手控溫度反應(yīng)，從復(fù)性狀態(tài)移至延伸狀態(tài)的時(shí)間不能太長(zhǎng)，耽擱過(guò)長(zhǎng)會(huì)增加非特異復(fù)性。      (三)  延伸溫度與時(shí)間      引物延伸溫度一般為72(較復(fù)性溫度高10左右)。不合適的延伸溫度不僅會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，也會(huì)影響其產(chǎn)量。72時(shí)，核苷酸的摻人率為35100個(gè)核

30、苷酸s，這取決于緩沖體系、pH、鹽濃度和DNA模板的性質(zhì)。72延伸1min對(duì)于長(zhǎng)達(dá)2kb的擴(kuò)增片段是足夠的。然而，延伸時(shí)間決定于靶序列的長(zhǎng)度與濃度。34kb的靶序列需34min延伸，延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。PCR中前幾個(gè)循環(huán)延伸時(shí)間應(yīng)足夠長(zhǎng)以使靶序列延伸完全，對(duì)很低濃度底物的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要長(zhǎng)些。          (四)  循環(huán)數(shù)          循壞數(shù)決定著擴(kuò)增程度。在其它參數(shù)都已優(yōu)化條件下，最適循環(huán)數(shù)取決于靶序列的初始濃度。過(guò)多的循環(huán)

31、會(huì)增加非特異擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量和復(fù)雜性(見平臺(tái)效應(yīng))。當(dāng)然，循環(huán)數(shù)太少，PCR產(chǎn)物就會(huì)極低。在初始靶序列為3x105，1.5x104，1x103和50拷貝分子時(shí)其循環(huán)數(shù)可分別為2530，30一35，3540和40一45個(gè)循環(huán)。      除循環(huán)數(shù)外，擴(kuò)增效率也是決定擴(kuò)增程度的重要因素。實(shí)驗(yàn)表明，以染色體DNA為模板時(shí)，第2530個(gè)循環(huán)過(guò)程中，擴(kuò)增DNA量明顯增加。擴(kuò)增程度(Y)、起始DNA量(A)、擴(kuò)增效率(R)和循環(huán)數(shù)(n)間的關(guān)系為：      YA(1十R)n   (8)  

32、0;   效率為100時(shí)，25個(gè)循環(huán)后，Y225A33554432A，而效率R90，n25時(shí)，Y1.9259307649A，擴(kuò)增產(chǎn)物減少72，由此可見擴(kuò)增效率對(duì)擴(kuò)增程度的影      八、其它因素    一)  高溫起動(dòng)hot start)      由于Taq DNA聚合酶在低溫下仍具有活性。因此在一般PcR反應(yīng)的開始加熱變性DNA后再加酶的過(guò)程中，引物可與模板發(fā)生非特異復(fù)性，這些非特異復(fù)性在達(dá)到72前就由Taq聚合酶在其3端聚合上幾個(gè)堿基并穩(wěn)定了這種非

33、特異復(fù)性引物。因此，可出現(xiàn)非特異延伸和擴(kuò)增。采用高溫起動(dòng)法便可克服這一缺點(diǎn)，即使Taq聚合酶僅在反應(yīng)達(dá)到較高溫度（大于70)時(shí)才發(fā)揮作用。這可通過(guò)在高溫(70)下加入某些必需因子(DNA聚合酶，模板DNA，Mg2+或引物等)來(lái)控制。這種方法不僅可增加PcR的特異性，還能增加其敏感性，并可減少引物二聚體的形成和引物的自我復(fù)性。這是因?yàn)樵跀U(kuò)增前加熱可促進(jìn)引物的特異復(fù)性與延伸，因此增加了有效引物的長(zhǎng)度。      (二)  PCR促進(jìn)刑      1二甲基亞風(fēng)(DMSO)：許多耐熱DNA聚合酶廠家推薦

34、在PCR反應(yīng)中加入10DMSO，這可能是DMSO有變性DNA的作用。DMSO的使用對(duì)大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段是有益的，但對(duì)Taq DNA聚合酶有抑制作用，一般反應(yīng)中應(yīng)盡量不用DMSO。不過(guò)，在復(fù)合PCR中可以用。      2甘油：有報(bào)道，反應(yīng)中加入5一20寸油有助于PCR反應(yīng)的復(fù)性過(guò)程，尤其對(duì)G十C含量高和二級(jí)結(jié)構(gòu)多的靶序列以及擴(kuò)增長(zhǎng)片段(大于l 500bp)更適用。應(yīng)注意的是，DMSO和甘油并非對(duì)所有PCR均有益，因此，是否加這些試劑應(yīng)根據(jù)具體情況而定，也需要操作者的探索。      3氯化四甲

35、基銨（TMAC)： 在反應(yīng)中加入1x10-4一1x10-5molL的TMAC可促進(jìn)PcR，去除非特異擴(kuò)增，而不抑制Taq聚合酶。      4T4噬菌體基因32蛋白質(zhì)(gp32) ：加入0.51ul的gp32(1nmolL，Pharmacia)可使Taq聚合酶對(duì)長(zhǎng)片段DNA的擴(kuò)增改善至少10倍。      (三)  石蠟油      反應(yīng)中所用石蠟油質(zhì)量要高，不能含抑制Taq DNA聚合酶活性的雜質(zhì)。加石蠟油目的是防止反應(yīng)液蒸發(fā)后引起的冷卻與反應(yīng)成分的改變

36、。石蠟油的有無(wú)對(duì)反應(yīng)影響較大(表22)。但現(xiàn)在PECetus公司又研制了一種新型PCR儀9600型基因擴(kuò)增PCR系統(tǒng)免除了加石蠟油的步驟。       石蠟油對(duì)PcR產(chǎn)物的影響       石蠟油    產(chǎn)物(Hg)     cv           +       2013       6

37、0;          -        405       72       擴(kuò)增條件：100uI, 94，1min； 37, 2min,72min, 3min      九、PCR儀      由第一臺(tái)PCR儀問(wèn)世以來(lái)，已有不同加熱冷卻機(jī)理的PcR儀相繼誕生。不同儀器由于溫控精度不同對(duì)PCR反應(yīng)有一定影響

38、，閱此，優(yōu)化PcR反應(yīng)時(shí)要注意不同儀器間的差別。       十、平臺(tái)效應(yīng)(plateau effect)“平臺(tái)效應(yīng)”是描述PCR后期循環(huán)產(chǎn)物對(duì)數(shù)積累的趨于飽和，并伴隨0.31pmol靶序列的累積。根據(jù)反應(yīng)條件和熱循環(huán)，下列因素可能與平臺(tái)效應(yīng)有關(guān)：dNTP和引物快速摻入底物中，濃度降低；隨產(chǎn)物增加，酶與模板的比例下降；由于變性溫度高(9395)和溫度循環(huán)，酶活力和dNTP的穩(wěn)定性逐漸下降；非特異產(chǎn)物或引物二聚體與反應(yīng)物的競(jìng)爭(zhēng)；產(chǎn)物在高濃度時(shí)變性不完全，影響引物的延伸；產(chǎn)物濃度高于10-8molL時(shí)，可能降低Taq聚合酶的延伸與加工能力(processiv

39、ity)或引起產(chǎn)物鏈的分支遷移和引物轉(zhuǎn)換；酶與PCR產(chǎn)物的結(jié)合，使酶分子減少。       十一、忠實(shí)性      反應(yīng)中dNTP濃度明顯低于Km值(小于1umolL)或某一dNTP的濃度低于其它三種的濃度時(shí)會(huì)增加錯(cuò)誤摻入。因此，PcR反應(yīng)中應(yīng)使用較高濃度的dNTP，且四種dNTP濃度一樣。由于Taq DNA聚合酶缺乏35 外切酶活性，因此，不能象K1enow聚合酶那樣校正錯(cuò)誤摻入的堿基，錯(cuò)誤摻人有利于鏈的終止，這是因?yàn)槊笇?duì)錯(cuò)誤終端的延伸主要依賴于Km值的差別。研究表明，酶對(duì)AT配對(duì)的延伸速率分別比GT，CT和TT

40、錯(cuò)誤快200，1400和2500倍。這種鏈終止限制了缺陷分子的擴(kuò)增，而有助于保持反應(yīng)的忠實(shí)性。當(dāng)dNTP濃度過(guò)高(大于1mmolL)時(shí)，會(huì)促進(jìn)錯(cuò)配堿基的延伸。在每種dNTP濃度為10一50umolL時(shí)，高溫復(fù)性與延伸會(huì)最大程度地保持反應(yīng)的忠實(shí)性。(from:三RT-PCR過(guò)程RNA提取（-70保存）1. 組織剪碎加入1ml Trizol，冰上勻漿（邊勻漿邊暫停）2. 轉(zhuǎn)入一新EP管中（1.5ml），室溫保存5min3. 加氯仿0.2ml，振蕩混合（手搖劇烈），室溫放置5min4. 10000 rpm 4離心15min5. 轉(zhuǎn)移上層水相（吸70%）到一新EP管中，加異丙醇0.5ml,振蕩混合，室

41、溫保存10min6. 12000rpm 4 離心15min7. 倒掉上清，加1ml 75%無(wú)水乙醇（4保存），振蕩混合，10000rpm 4 離心5min8. 倒掉上清，室溫或37放置20min(EP管倒置在濾紙上)使RNA沉淀干燥9. 加20ul DEPC水至EP管中10. 在60孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解測(cè)RNA濃度調(diào)零：750ul DEPC水測(cè)量：745ul DEPC水 + 5ul RNA總RNA濃度= OD260×40×稀釋倍數(shù)（150倍）ug/ml = OD260×40×150 ug/ml = OD260×

42、;6 ug/ulA1/A2應(yīng)在1.8-2.0之間逆轉(zhuǎn)錄（cDNA：一周內(nèi)-20保存，長(zhǎng)期-70保存）以Fernentas試劑盒為例，反應(yīng)體系20ul1. RNA短暫離心2. 將11ul的DEPC水和RNA（1ug）放入EP管內(nèi)，置于冰上，使RNA終濃度為0.5ug/ul,再加入Oligo(dt) 1ul,輕輕混合均勻，短時(shí)間離心(RNA=1/總RNA濃度=1/ OD260×6 ；DEPC水=11-RNA)3. 將反應(yīng)液置于65 5min 冰上1min,短時(shí)間離心4. 按順序加入：5×buffer 4ul200ul核糖核苷酸酶抑制劑 1ul 10mm dNTP MIX 2ul

43、 M-Mulu逆轉(zhuǎn)錄酶 1ul 輕輕混合均勻，短時(shí)間離心5. 將混合物置于42，60min6. 70加熱5min,中止上述反應(yīng)，置于冰上注意事項(xiàng)1. RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄時(shí)所用器具均應(yīng)在1DECP水中避光浸泡過(guò)夜，再高壓烘干2. DECP水配制（先加DEPC，再加水，避光過(guò)夜，然后高壓）3. 75%無(wú)水乙醇配制（DEPC水：無(wú)水乙醇=1:3）4. RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄時(shí)應(yīng)全程佩戴一次性手套和口罩聚合酶鏈反應(yīng)PCR(產(chǎn)物-20保存)15ul的反應(yīng)體系，冰上操作，稍后短時(shí)間離心Template 1ul/3ulPrimer 1 1ulPrimer 2 1ul2×Master 12.5ulddH

44、2O 補(bǔ)至25ul (9.5ul/7.5ul)2.PCR循環(huán): 94 5min 94 45s Tm+4 45s 72 45s 2 29-34 (從第2步開始循環(huán)30-35個(gè)循環(huán)) 72 7min 4 12hPCR結(jié)束后-20保存或置于冰上開始電泳引物稀釋方法1. 引物先離心，后用DEPC水或雙蒸水稀釋成10倍母液2. 再取5ul母液，加45ulDEPC水或雙蒸水稀釋10倍成操作液凝膠電泳加樣樣本孔：上樣緩沖液6×Loading Buffer 2ul+ PCR產(chǎn)物 10ul（Loading Buffer：PCR產(chǎn)物=1:5，可自行調(diào)整劑量）Mark孔：取0.5ul Mark,或根據(jù)電泳

45、結(jié)果自行調(diào)整圖像保存及處理Live preview - exposure - freeze保存后，圖像-調(diào)整-曲線 進(jìn)行調(diào)整0.5×TBE溶液配制方法1.先配5×TBE溶液：Tris 27g,硼酸 13.75g,EDTA·Na·2 H2O 2.059g（或EDTA 1.86g）,先用400ml ddH2O溶解，調(diào)節(jié)PH至8.3，然后定容至500ml2.再稀釋成0.5×TBE溶液：50ml 5×TBE溶液+ 450ml ddH2O 凝膠配置方法40ml 0.5×TBE +0.6g 瓊脂 置于100ml燒杯中，保鮮膜或錫紙封口，

46、開小孔，中火，2min 冷卻至60，加 goldview 2ul，振蕩混勻倒入干凈的電泳槽中，30min后拔梳，加樣，開始電泳四 高效液相色譜過(guò)程高效液相色譜儀操作步驟：1) 過(guò)濾流動(dòng)相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜(0.45um)。2) 對(duì)抽濾后的流動(dòng)相進(jìn)行超聲脫氣10-20分鐘。3) 打開HPLC工作站（包括計(jì)算機(jī)軟件和色譜儀），連接好流動(dòng)相管道，連接檢測(cè)系統(tǒng)。4) 進(jìn)入HPLC控制界面主菜單，點(diǎn)擊manual，進(jìn)入手動(dòng)菜單。5) 有一段時(shí)間沒用，或者換了新的流動(dòng)相，需要先沖洗泵和進(jìn)樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽取。沖洗進(jìn)樣閥，需要在manual菜單下，先點(diǎn)擊purge，再點(diǎn)擊star

47、t，沖洗時(shí)速度不要超過(guò)10 ml/min。6) 調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動(dòng)相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過(guò)2000。點(diǎn)擊injure，選用合適的流速，點(diǎn)擊on，走基線，觀察基線的情況。7) 設(shè)計(jì)走樣方法。點(diǎn)擊file，選取select users and methods，可以選取現(xiàn)有的各種走樣方法。若需建立一個(gè)新的方法，點(diǎn)擊new method。選取需要的配件，包括進(jìn)樣閥，泵，檢測(cè)器等，根據(jù)需要而不同。選完后，點(diǎn)擊protocol。一個(gè)完整的走樣方法需要包括：a.進(jìn)樣前的穩(wěn)流，一般2-5分鐘；b.基線歸零；c.進(jìn)樣閥的loading-inject轉(zhuǎn)換；d.走樣時(shí)間，隨不同

48、的樣品而不同。8) 進(jìn)樣和進(jìn)樣后操作。選定走樣方法，點(diǎn)擊start。進(jìn)樣，所有的樣品均需過(guò)濾。方法走完后，點(diǎn)擊postrun，可記錄數(shù)據(jù)和做標(biāo)記等。全部樣品走完后，再用上面的方法走一段基線，洗掉剩余物。9) 關(guān)機(jī)時(shí)，先關(guān)計(jì)算機(jī)，再關(guān)液相色譜。10) 填寫登記本，由負(fù)責(zé)人簽字。注意事項(xiàng)：1) 流動(dòng)相均需色譜純度，水用20M的去離子水。脫氣后的流動(dòng)相要小心振動(dòng)盡量不引起氣泡。2) 柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要讓液體過(guò)柱子。3) 所有過(guò)柱子的液體均需嚴(yán)格的過(guò)濾。4) 壓力不能太大，最好不要超過(guò)2000 psi。 液相色譜法簡(jiǎn)介 作者： dujinx 正文 氣相色譜不能由色譜圖直接給出未知

49、物的定性結(jié)果，而必須由已知標(biāo)準(zhǔn)作對(duì)照定性。當(dāng)無(wú)純物質(zhì)對(duì)照時(shí)，定性鑒定就很困難，這時(shí)需借助質(zhì)譜、紅外和化學(xué)法等配合。另外大多數(shù)金屬鹽類和熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)還不能分析。此缺點(diǎn)可高效液相色譜法來(lái)克服。 在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論與技術(shù)，在70年代初建立了高效液相色譜分析法（以HPLC表示）。在常壓下操作的液相色譜，分離一個(gè)樣品往往長(zhǎng)達(dá)幾小時(shí)至幾十小時(shí)，因此工作效率很低。人們?cè)鴮?duì)這種經(jīng)典液相色譜法試用了柱前加壓或柱后減壓的辦法來(lái)提高流速，以縮短分離時(shí)間，但是結(jié)果失敗了。根據(jù)液相色譜理論，因?yàn)殡S著載液（流動(dòng)相）流速的提高，板高則增大，所以柱效會(huì)顯著降低。隨著生產(chǎn)技術(shù)的提高，人們制成了細(xì)小

50、（<10m）而高效的填充物，從而使柱效大大提高。但是隨著填充物粒度的減小，柱壓降顯著增大，為了得到合理的載液流速，使用了高壓；輸液泵，使流速達(dá)到110mL/min。從而使分析一個(gè)多組分樣品只需幾分鐘到幾十分鐘時(shí)間。隨著高效固定相、高壓泵和高靈敏度檢測(cè)器以及電子技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的應(yīng)用，70年代以業(yè)逐步實(shí)現(xiàn)了液相色譜分析的高效、高速、高靈敏和自動(dòng)化操作。因此人們常稱它為高效液相色譜或現(xiàn)代液相色譜，以區(qū)別于經(jīng)典液相色譜。 高效液相色譜法的分類與經(jīng)典液相色譜法一致。按固定相的聚集狀態(tài)不同分為液固色譜法和液液色譜法。按分離原理不同分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠色譜法四類。 高效液相色譜

51、所用基本概念：保留值等色譜分析有關(guān)術(shù)語(yǔ)，以及分配系數(shù)、分配比、塔板高度、分離度、選擇性等方面均與氣相色譜相一致；高效液相色譜所用基本理論：塔板理論與速率理論也與氣相色譜一致。因液相色譜以液體代替氣相色譜中的氣體作流動(dòng)相，則速率議程H=A+B/+C。式中：縱向擴(kuò)散項(xiàng)（分子擴(kuò)散項(xiàng)）B/對(duì)板高的影響與氣相色譜不同，由于液相色譜中組分分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)Dm僅為氣相色譜中的萬(wàn)分之一，因此縱向擴(kuò)散項(xiàng)對(duì)板高的影響可以忽略不計(jì)。于是影響液相色譜的主要因素是傳質(zhì)項(xiàng)Cu。由圖14可知，氣相色譜（GC）的流動(dòng)相流速u增大時(shí)，板高H顯著增大（即柱效顯著降低），而液相色譜（LC）的流速增大時(shí)，板高增大不顯著（即柱

52、效降低不顯著）。這說(shuō)明高效液相色 譜也有很高的分離效能，此外，氣相色譜的載氣權(quán)數(shù)種，其性質(zhì)差別也不大，對(duì)分離效果影響也不大。而液相色譜的載液種類多，性質(zhì)差別也大，對(duì)分離效果影響顯著。因此流動(dòng)相的選擇很重要，并且在選擇流動(dòng)相對(duì)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：流動(dòng)相對(duì)樣品有適當(dāng)?shù)娜芙舛?，但不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，也不與固定液互溶；流動(dòng)相的純度要高（至少分析純）、粘度要小，以免帶進(jìn)雜質(zhì)和組分在流動(dòng)相中擴(kuò)散系數(shù)下降；流動(dòng)相應(yīng)與所用檢測(cè)器相匹配，不應(yīng)對(duì)組分檢測(cè)產(chǎn)生干擾作用。 高效液相色譜不但具有高效、高速、高靈敏度的特點(diǎn)，還由于它的流動(dòng)相（載液）種類比氣相色譜的流動(dòng)相（載氣）多，因此可選用兩種或多種不同比例的液體作流動(dòng)相

53、，從機(jī)時(shí)可提高選擇性。此外，液相色譜的餾分比氣相色譜易于收集。便于為紅外、核磁等方法確定化合物結(jié)構(gòu)提供純樣品。 由于高效液相色譜法具有以上特點(diǎn)，它適于分離、分析沸點(diǎn)高、熱穩(wěn)定性差、分子量大（大于400）的氣相色譜法不能或不易分析的許多有機(jī)物和一些無(wú)機(jī)物，而這些物質(zhì)占化合物總數(shù)的7580%。因此它已廣泛用于核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、糖類、脂類、甾類化合物、激素、生物堿、稠環(huán)芳烴、高聚物、金屬螯合物、金屬有機(jī)化合物以及多種無(wú)機(jī)鹽類的分離和分析。 但是，高效液相色譜的固定相的分離效率、檢測(cè)器的檢測(cè)范圍以及靈敏度等方面，目前還不如氣相色譜法。此外對(duì)于氣體和易揮發(fā)物質(zhì)的分析方面也遠(yuǎn)不如氣相色譜法，因

54、此高效液相色譜法和氣相色譜法配合使用可互相取長(zhǎng)補(bǔ)短，相輔相成。 1分離原理 凝膠色譜，又稱空間排阻色譜。它是利用某些凝膠對(duì)混合物各組分因分子量不同，其阻滯作用也不同而進(jìn)行分離、分析的方法。 凝膠色譜的分離要理和其它色譜法不同，它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑要比分子篩大得多，一般為幾百至幾千埃。色譜柱內(nèi)填充具有一定大小孔穴的凝膠。當(dāng)樣品進(jìn)入色譜柱后，不同大小的樣品分子（圖142中以黑點(diǎn)表示）隨流動(dòng)相沿凝膠顆粒（圖142中以空心圈表示）外部間隙和凝膠孔穴旁流過(guò)，體積在的分子因不能滲透到凝膠孔穴里而得到排阻，因此較為順利地通過(guò)凝膠柱而較早地被流動(dòng)相沖洗出來(lái)。中等體積的分子產(chǎn)生部分滲透作用，小分子

55、可滲透到凝膠孔穴里去而受阻滯，因有一個(gè)平衡過(guò)程而較晚地被流動(dòng)相沖洗出來(lái)。這樣，試樣組分基本上按分子大小受到不同阻滯而先后流出色譜柱，從而實(shí)現(xiàn)分離目的。 光凝膠色譜采用水溶液作流動(dòng)相進(jìn)，稱為過(guò)濾凝膠色譜（HFC），而用有機(jī)溶劑為流動(dòng)相時(shí)，稱為凝膠滲透色譜（GPC）。 2固定相 凝膠色譜的固定相凝膠，是含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，是一種經(jīng)過(guò)交聯(lián)而具有立柱網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。 根據(jù)凝膠的交聯(lián)程度和含水量的不同，分了軟質(zhì)、半硬質(zhì)和硬質(zhì)三種。軟質(zhì)凝膠（如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等）交聯(lián)度低，膨脹度大，容量大，可壓宿，不能用于高壓（使用壓力低于3.5kg/2或更低），主要用于含水體系的常壓

56、凝膠色譜，半硬質(zhì)凝膠（如苯乙烯一二乙烯基苯交聯(lián)共聚凝膠），容量中等，滲透性較高，壓力可用到70kg/2。適用于非水溶劑流動(dòng)相；硬質(zhì)凝膠（如多孔硅膠、多也玻球等），膨脹度小，不可壓縮，滲透性好，可耐高壓，適于高流速下操作。 3流動(dòng)相 在凝膠色譜中，為提高分率效率，多采用低粘度、與樣品折光指數(shù)相差大的流動(dòng)相。常用的流動(dòng)相有苯、甲苯、鄰二氯苯、二氯甲烷、1，2一二氯乙烷、氯仿、水等。 島津液相色譜儀注意事項(xiàng) 作者： 孔桂昌 正文 1.流動(dòng)相必須用HPLC級(jí)的試劑，使用前過(guò)濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)(使用0.45um或更細(xì)的膜過(guò)濾)。2.流動(dòng)相過(guò)濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫后使用。3

57、.不能用純乙腈作為流動(dòng)相，這樣會(huì)使單向閥粘住而導(dǎo)致泵不進(jìn)液。4.使用緩沖溶液時(shí)，做完樣品后應(yīng)立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時(shí)，然 后用甲醇(或甲醇水溶液)沖洗40分鐘以上，以充分洗去離子。對(duì)于柱塞桿 外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20ml以上。5.長(zhǎng)時(shí)間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用有機(jī)相(如甲醇等)，因?yàn)榧兯组L(zhǎng)霉。6.每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑清洗進(jìn)樣器。7.C18柱絕對(duì)不能進(jìn)蛋白樣品，血樣、生物樣品。8.堵塞導(dǎo)致壓力太大，按預(yù)柱混合器中的過(guò)濾器管路過(guò)濾器單向閥檢查 并清洗。清洗方法；以異丙醇作溶劑沖洗：放在異丙醇中間用超聲波清 洗

58、；用10稀硝酸清洗。9.氣泡會(huì)致使壓力不穩(wěn)，重現(xiàn)性差，所以在使用過(guò)程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡。10.如果進(jìn)液管內(nèi)不進(jìn)液體時(shí)，要使用注射器吸液：通常在輸液前要進(jìn)行流動(dòng)相 的清洗。11.要注意柱子的PH值范圍，不得注射強(qiáng)酸強(qiáng)堿的樣品，特別是堿性樣品。12.更換流動(dòng)相時(shí)應(yīng)該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動(dòng)邊靖洗，然后插入新的 流動(dòng)相中。更換無(wú)互溶性的流動(dòng)相時(shí)要用異丙醇過(guò)渡一下。以上是我參考了相關(guān)資料，并結(jié)合在安裝使用液相色譜儀中的經(jīng)驗(yàn)得出的，可能存在某些片面性，如有不當(dāng)之處請(qǐng)多提寶貴建議。 島津LC_10ATvp液相色譜儀的故障現(xiàn)象及處理措施現(xiàn) 象主要原因措 施輸液不穩(wěn)定泵的脈流大1。泵頭內(nèi)進(jìn)入氣泡。按p

59、ump ，驅(qū)出氣泡。排液管連接口連接注射器抽出氣泡。2。泵頭內(nèi)存有以前的流動(dòng)相。按 pump ，將舊流動(dòng)相完全清洗出去3吸濾器的管內(nèi)進(jìn)入氣泡。按 pump ，將舊流動(dòng)相完全清洗出去。震動(dòng)吸濾器，驅(qū)出氣泡。吸濾器網(wǎng)眼堵塞時(shí)，用超聲濾清洗。超聲濾清洗無(wú)效時(shí)，需更換。(檢查吸濾器網(wǎng)眼堵塞的方法 取出過(guò)濾部分，記錄壓力波形。 如果取出后壓力波形不正常，則吸濾器網(wǎng)眼堵塞。 )對(duì)流動(dòng)相脫氣。4。單向閥工作不正常輸送異丙醇，清洗單向閥。清洗無(wú)效時(shí)，用超聲波清洗單向閥，或更換單向閥.5泵頭與泵頭座之間的縫隙，或清洗液出口漏液更換柱塞密封圈。更換柱塞密封圈后仍漏液時(shí)，更換柱塞。6流路的連接處漏液用力擰緊公螺母。

60、擰緊后仍漏液時(shí)，更換公螺母和箍環(huán)。7流路堵塞，或?qū)⒁氯?。管道過(guò)濾器用超聲波清洗，或更換過(guò)濾器。找出堵塞的部件，更換新部件。8。柱塞密封圈的使用壽命將到極限更換柱塞。流量比設(shè)定值小1單向閥工作不正常。輸送異丙醇，清洗單向閥清洗后仍無(wú)效時(shí)，用超聲波清洗單向閥，或更換單向閥。2吸濾器網(wǎng)眼堵塞。(*2) 用超聲波清洗吸濾器。超聲波清洗無(wú)效時(shí)，更換吸濾器。保留時(shí)間的再現(xiàn)性不良1單向閥工作不正常。清洗仍無(wú)效時(shí)，更換單向閥，或用超聲波清洗。高壓梯度時(shí)2臺(tái)輸液泵的壓力表示不一致(相差在±05MPa(5kSfcm2)或±2以內(nèi)屬于正常)1壓力傳感器的零點(diǎn)未對(duì)準(zhǔn)。用輔助功能"ZER

61、。 ADJ"，調(diào)整零點(diǎn)2。其中1臺(tái)輸液泵的管道過(guò)濾器網(wǎng)眼堵塞。用超聲波清洗管道過(guò)濾器，或更換管道過(guò)濾器。3。2臺(tái)輸液泵的流路合流之前，流路有堵塞的地方找出堵塞的部件，更換部件壓力上不去1排液閥開著關(guān)閉排液閥。2。流路連接處漏液 擰緊公螺母 擰緊后仍無(wú)效時(shí)，更換公螺母和箍環(huán)壓力上升過(guò)高(取下柱確認(rèn))1管道過(guò)濾器堵塞。管道過(guò)濾器用超聲波清洗，或更換2流路堵塞找出堵塞的部件，更換。3配管的內(nèi)徑過(guò)細(xì)使用指定的管子氣相色譜操作規(guī)程及注意事項(xiàng)：1. 氣相色譜儀簡(jiǎn)單操作流程1.1 反時(shí)針方向開啟載氣鋼瓶閥門，減壓閥上高壓壓力表指示出高壓鋼瓶?jī)?nèi)貯氣壓力。1.2.順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)減壓調(diào)節(jié)螺桿，使低壓壓力

62、表指示到要求的壓力數(shù)。1.3開啟主機(jī)電源總開關(guān)，主機(jī)的觸摸式熒光屏顯示儀器正在自檢，柱室內(nèi)鼓風(fēng)馬達(dá)運(yùn)轉(zhuǎn)。1.4打開與氣相色譜儀連接的電腦，并運(yùn)行氣相色譜儀工作軟件，待軟件與儀器連接成功后，即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.5在氣相色譜儀工作軟件里分別設(shè)定載氣流量、檢測(cè)器溫度、進(jìn)樣口的溫度，柱箱的初始溫度及升溫程序等。設(shè)定完后，各區(qū)溫度開始朝設(shè)定值上升，當(dāng)溫度達(dá)到設(shè)定值時(shí)，READY燈亮。1.6查看儀器基線是否平穩(wěn)，待基線平直后，即可進(jìn)樣測(cè)試。1.7實(shí)驗(yàn)完畢后，先關(guān)閉檢測(cè)器電源，再停止加熱，待色譜柱、進(jìn)樣口的溫度降至80以下時(shí)，依次關(guān)閉色譜儀電源開關(guān)，計(jì)算機(jī)電源，最后關(guān)閉載氣減壓閥及總閥。1.8登記儀器使用情況，做好實(shí)驗(yàn)室的整理和清潔工作，并檢查好安全后，方可離開2 測(cè)試條件的設(shè)定：色譜條件的設(shè)定要根據(jù)不同化合物的不同性質(zhì)選擇柱子，一般情況極性化合物選擇極性柱。非極性化合物選擇非極性柱。色譜柱柱溫的確定主要由樣品的復(fù)雜程度決定。對(duì)于混合物一般采用程序升溫法。柱溫的設(shè)定要同時(shí)兼顧高低沸點(diǎn)或溶點(diǎn)化合物.可根據(jù)不同的化合物任意改動(dòng)，其目的要達(dá)到在最短的時(shí)間里，使每個(gè)化合物的組份完全分離。3 注意事項(xiàng)：3.1操