農(nóng)殘分析農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測(cè)定

1、農(nóng)殘分析農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測(cè)定6.1 酶抑制分析測(cè)定法酶抑制分析測(cè)定法 1951年年,Giang與與Hall應(yīng)用有機(jī)磷和氨基甲酸應(yīng)用有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥在體外對(duì)膽堿酯酶具有抑制作用的機(jī)理來(lái)酯農(nóng)藥在體外對(duì)膽堿酯酶具有抑制作用的機(jī)理來(lái)測(cè)定其含量測(cè)定其含量. 1968年年Mendoza利用薄層利用薄層-酶抑制技術(shù)測(cè)定酶抑制技術(shù)測(cè)定10種有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥種有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥,最小檢出量可達(dá)納最小檢出量可達(dá)納克水平克水平. 1975年年Kramer與與Gamson用一種與靛酚乙酸用一種與靛酚乙酸酯相似的化合物酯相似的化合物,測(cè)定測(cè)定110g的各種有機(jī)磷酸酯的各種有機(jī)磷酸酯化合物化合物,

2、與此同時(shí)與此同時(shí),Zweig等也測(cè)定了甲萘威等農(nóng)藥等也測(cè)定了甲萘威等農(nóng)藥. 進(jìn)入進(jìn)入20世紀(jì)世紀(jì)80年代年代,人們開(kāi)始以來(lái)源豐富人們開(kāi)始以來(lái)源豐富,取取材和制備都十分方便的材和制備都十分方便的植物酶源植物酶源,建立薄層建立薄層-植物植物酯酶抑制方法酯酶抑制方法,為酶抑制法的進(jìn)一步推廣和應(yīng)用創(chuàng)為酶抑制法的進(jìn)一步推廣和應(yīng)用創(chuàng)造了條件造了條件.6.1.2 酶法檢測(cè)原理酶法檢測(cè)原理 有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥 對(duì)參與神經(jīng)生理傳對(duì)參與神經(jīng)生理傳遞過(guò)程的乙酰膽堿酯酶遞過(guò)程的乙酰膽堿酯酶AChE具有抑制作用具有抑制作用,使該酶使該酶的分解作用不能正常進(jìn)行的分解作用不能正常進(jìn)行,從而導(dǎo)致

3、底物乙酰膽堿的從而導(dǎo)致底物乙酰膽堿的積累積累,影響動(dòng)物正常的神經(jīng)傳導(dǎo)影響動(dòng)物正常的神經(jīng)傳導(dǎo),引起中毒或死亡引起中毒或死亡. 可將這一昆蟲(chóng)毒理學(xué)原理應(yīng)用到農(nóng)藥殘留檢測(cè)可將這一昆蟲(chóng)毒理學(xué)原理應(yīng)用到農(nóng)藥殘留檢測(cè)中中,如果農(nóng)產(chǎn)品樣品提取液中不含有或含有很低的有如果農(nóng)產(chǎn)品樣品提取液中不含有或含有很低的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥,酶的活性就不被抑制酶的活性就不被抑制,試樣試樣中加入的基質(zhì)就被酶水解中加入的基質(zhì)就被酶水解,或少部分水解或少部分水解, 水解產(chǎn)物水解產(chǎn)物與加入的顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色與加入的顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色;反之反之,如果試樣提取液如果試樣提取液中含有一定量的有機(jī)磷或氨基甲酸酯

4、類(lèi)農(nóng)藥中含有一定量的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥, 酶的活酶的活性就被抑制性就被抑制,試樣中加入的基質(zhì)就不被酶水解試樣中加入的基質(zhì)就不被酶水解, 從而從而不顯色或顏色很淺不顯色或顏色很淺,用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值,計(jì)算計(jì)算出抑制率出抑制率,就可判斷出樣品中農(nóng)藥殘留情況就可判斷出樣品中農(nóng)藥殘留情況.6.1.3 酶源選擇與提取酶源選擇與提取 酶源選擇是生物酶技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ)酶源選擇是生物酶技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ),其其性質(zhì)的好壞性質(zhì)的好壞,特異性大小特異性大小,穩(wěn)定與否直接關(guān)系穩(wěn)定與否直接關(guān)系到檢測(cè)的結(jié)果到檢測(cè)的結(jié)果. 在酶抑制檢測(cè)的技術(shù)中在酶抑制檢測(cè)的技術(shù)中,既有應(yīng)用既有應(yīng)用AChE的的

5、,也有應(yīng)用非特異性酯酶的也有應(yīng)用非特異性酯酶的,其來(lái)源其來(lái)源既有動(dòng)物的既有動(dòng)物的,也有植物的也有植物的.6.1.4 底物和底物和 顯色劑顯色劑 酶抑制劑顯色反應(yīng)可使用的底物和顯酶抑制劑顯色反應(yīng)可使用的底物和顯色劑很多色劑很多,大致可分為以下幾類(lèi)大致可分為以下幾類(lèi):(1)乙酰膽堿乙酰膽堿-溴百里酚藍(lán)顯色溴百里酚藍(lán)顯色;(2) 乙酸乙酸-萘酯萘酯-固藍(lán)固藍(lán)B鹽顯色反應(yīng)鹽顯色反應(yīng);(3)乙酸羥基吲哚顯色法乙酸羥基吲哚顯色法;(4)乙酸靛酯顯色法乙酸靛酯顯色法;6.1.5 檢測(cè)方法檢測(cè)方法(1)比色法比色法: 我國(guó)農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所利用酶抑我國(guó)農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所利用酶抑制產(chǎn)生的顯色反應(yīng)制產(chǎn)生的顯色反應(yīng),通

6、過(guò)分光光度計(jì)比色測(cè)通過(guò)分光光度計(jì)比色測(cè)定酶的抑制率定酶的抑制率,以測(cè)定有機(jī)磷和氨基甲酸酯以測(cè)定有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留量類(lèi)農(nóng)藥殘留量.(2)酶片法酶片法: 酶片即為浸漬有膽堿酯酶或其他敏感酶酶片即為浸漬有膽堿酯酶或其他敏感酶類(lèi)的濾紙或類(lèi)似載體物質(zhì)類(lèi)的濾紙或類(lèi)似載體物質(zhì).(3)固相酶速測(cè)技術(shù)固相酶速測(cè)技術(shù)6.2 免疫檢測(cè)技術(shù)免疫檢測(cè)技術(shù) 免疫分析概述免疫分析概述 當(dāng)細(xì)菌、病毒和有害物等病原入侵時(shí)當(dāng)細(xì)菌、病毒和有害物等病原入侵時(shí),能產(chǎn)生能產(chǎn)生抵御外來(lái)物的抗體，這就是動(dòng)物的免疫反應(yīng)，致抵御外來(lái)物的抗體，這就是動(dòng)物的免疫反應(yīng)，致病的外來(lái)物稱(chēng)為抗原。病的外來(lái)物稱(chēng)為抗原。 免疫分析是以抗原與抗體的特異

7、性、可逆性免疫分析是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)。結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA) 原理是在測(cè)定過(guò)程，樣品提取液中的農(nóng)藥與原理是在測(cè)定過(guò)程，樣品提取液中的農(nóng)藥與已知數(shù)量的酶聯(lián)劑競(jìng)爭(zhēng)有限數(shù)量的抗體吸附位點(diǎn)。已知數(shù)量的酶聯(lián)劑競(jìng)爭(zhēng)有限數(shù)量的抗體吸附位點(diǎn)。 為了觀察測(cè)定結(jié)果，往往加入底物和顯色劑，為了觀察測(cè)定結(jié)果，往往加入底物和顯色劑，以產(chǎn)生顏色變化。根據(jù)樣品顏色和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)顏色以產(chǎn)生顏色變化。根據(jù)樣品顏色和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)顏色的吸光度之差就可計(jì)算出樣品中農(nóng)藥的含量的吸光度之差就可計(jì)算出樣品中農(nóng)藥的含量. 農(nóng)藥殘留免疫分析方法的建立，一般包括待

8、農(nóng)藥殘留免疫分析方法的建立，一般包括待測(cè)農(nóng)藥的選擇、半抗原合成、人工抗原合成、抗測(cè)農(nóng)藥的選擇、半抗原合成、人工抗原合成、抗體制備和樣品前處理方法等幾個(gè)步驟體制備和樣品前處理方法等幾個(gè)步驟.(1)直接直接ELISA原理原理: 是在抗原與抗體發(fā)生反應(yīng)后，直接進(jìn)行顯色是在抗原與抗體發(fā)生反應(yīng)后，直接進(jìn)行顯色的非均相固相反應(yīng)免疫分析方法。的非均相固相反應(yīng)免疫分析方法。 1類(lèi)類(lèi):首先將抗原固定在聚苯乙烯反應(yīng)板孔內(nèi)壁，首先將抗原固定在聚苯乙烯反應(yīng)板孔內(nèi)壁，然后加入然后加入待測(cè)抗原待測(cè)抗原和和酶標(biāo)記酶標(biāo)記抗體，固相抗原與待抗體，固相抗原與待測(cè)游離抗原競(jìng)爭(zhēng)測(cè)游離抗原競(jìng)爭(zhēng)有限量有限量的酶標(biāo)記抗體，反應(yīng)后洗的酶標(biāo)記

9、抗體，反應(yīng)后洗去可溶性的游離抗原與抗體的結(jié)合物，加入酶作去可溶性的游離抗原與抗體的結(jié)合物，加入酶作用底物，測(cè)定固相抗原與抗體結(jié)合物上的酶活性，用底物，測(cè)定固相抗原與抗體結(jié)合物上的酶活性，便可得到待測(cè)抗原的量。酶反應(yīng)活性與待測(cè)抗原便可得到待測(cè)抗原的量。酶反應(yīng)活性與待測(cè)抗原的量呈負(fù)相關(guān)的量呈負(fù)相關(guān).2類(lèi): 首先固定抗體，然后同時(shí)加入待測(cè)抗原和酶標(biāo)首先固定抗體，然后同時(shí)加入待測(cè)抗原和酶標(biāo)記抗原，待測(cè)抗原與酶標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)記抗原，待測(cè)抗原與酶標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)有限量有限量的固的固相抗體，反應(yīng)后測(cè)定固相抗體與酶標(biāo)記抗原結(jié)合相抗體，反應(yīng)后測(cè)定固相抗體與酶標(biāo)記抗原結(jié)合物上的酶活性，便可得到待測(cè)抗原的量。物上的酶活性

10、，便可得到待測(cè)抗原的量。 酶活性酶活性強(qiáng)度與待測(cè)抗原呈負(fù)相關(guān)。強(qiáng)度與待測(cè)抗原呈負(fù)相關(guān)。(2) 間接間接ELISA原理原理 首先固定抗原，然后加入待測(cè)抗原和抗體，首先固定抗原，然后加入待測(cè)抗原和抗體，固相抗原與待測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)有限的第一輪抗體，反固相抗原與待測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)有限的第一輪抗體，反應(yīng)后洗去游離的結(jié)合物，再加入酶標(biāo)記的第二抗應(yīng)后洗去游離的結(jié)合物，再加入酶標(biāo)記的第二抗體體(以第一抗體為抗原的酶標(biāo)記抗體以第一抗體為抗原的酶標(biāo)記抗體)，反應(yīng)后吸，反應(yīng)后吸取酶標(biāo)記的游離抗體，測(cè)定結(jié)合物上的酶活性。取酶標(biāo)記的游離抗體，測(cè)定結(jié)合物上的酶活性。酶活性與待測(cè)抗原濃度呈負(fù)相關(guān)。酶活性與待測(cè)抗原濃度呈負(fù)相關(guān)。(3)

11、半抗原的制備 抗原是指一切能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體和致敏淋抗原是指一切能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細(xì)胞，并能與之結(jié)合發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的物巴細(xì)胞，并能與之結(jié)合發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的物質(zhì)。質(zhì)。 抗原具有抗原具有免疫原性免疫原性和和反應(yīng)原性反應(yīng)原性。 免疫原性免疫原性是指能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體或能誘導(dǎo)是指能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體或能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)；機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)； 而而反應(yīng)原性反應(yīng)原性是指能與其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體或致是指能與其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)的特性。敏淋巴細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)的特性。 既具有免疫原性反又具有反應(yīng)原性的抗原稱(chēng)既具有免疫原性反又具有反應(yīng)原性的抗原稱(chēng)為為完全抗原完全抗原, 而只具有

12、而只具有反應(yīng)原性反應(yīng)原性而沒(méi)有免疫原性而沒(méi)有免疫原性的抗原稱(chēng)為的抗原稱(chēng)為不完全抗原不完全抗原,也稱(chēng)也稱(chēng)半抗原半抗原.(4)人工免疫抗原的合成人工免疫抗原的合成 首先將半抗原活化，然后通常是在條件溫和首先將半抗原活化，然后通常是在條件溫和的水溶液中將半抗原與載體蛋白共價(jià)結(jié)合。的水溶液中將半抗原與載體蛋白共價(jià)結(jié)合。 如半抗原分子含有羧基，可用碳二亞胺法或如半抗原分子含有羧基，可用碳二亞胺法或混合酸酐法，如具有羥基活性基團(tuán)則采用琥珀酸混合酸酐法，如具有羥基活性基團(tuán)則采用琥珀酸酐法酐法.(5)農(nóng)藥抗體制備農(nóng)藥抗體制備 農(nóng)藥抗體是經(jīng)由小分子農(nóng)藥與大分子載體偶農(nóng)藥抗體是經(jīng)由小分子農(nóng)藥與大分子載體偶聯(lián)后的聯(lián)

13、后的復(fù)合物復(fù)合物免疫動(dòng)物使機(jī)體產(chǎn)生抗農(nóng)藥的抗體，免疫動(dòng)物使機(jī)體產(chǎn)生抗農(nóng)藥的抗體，并取其免疫動(dòng)物血清，然后進(jìn)行分離、鑒定其特并取其免疫動(dòng)物血清，然后進(jìn)行分離、鑒定其特異性而得到的。農(nóng)藥抗體的產(chǎn)生一般可采用兩種異性而得到的。農(nóng)藥抗體的產(chǎn)生一般可采用兩種途徑途徑.1)多克隆抗體技術(shù)多克隆抗體技術(shù) 多克隆抗體是由許多多克隆抗體是由許多B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的混合抗體淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的混合抗體.2)雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單抗雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單抗 單克隆抗體是指由一個(gè)單克隆抗體是指由一個(gè)B淋巴細(xì)胞分化增殖的漿細(xì)胞淋巴細(xì)胞分化增殖的漿細(xì)胞產(chǎn)生的針對(duì)單一抗原決定簇的抗體產(chǎn)生的針對(duì)單一抗原決定簇的抗體.(6)ELISA方法的

14、選擇方法的選擇分為五種類(lèi)型分為五種類(lèi)型:1)酶標(biāo)抗原直接競(jìng)爭(zhēng)抑制法酶標(biāo)抗原直接競(jìng)爭(zhēng)抑制法;2)酶標(biāo)抗體直接競(jìng)爭(zhēng)抑制法酶標(biāo)抗體直接競(jìng)爭(zhēng)抑制法;3)酶標(biāo)抗體間接競(jìng)爭(zhēng)抑制法酶標(biāo)抗體間接競(jìng)爭(zhēng)抑制法;4)抗體夾心法抗體夾心法; 5)間接夾心法間接夾心法(7)實(shí)驗(yàn)條件的選擇實(shí)驗(yàn)條件的選擇 必須注意以下幾個(gè)方面必須注意以下幾個(gè)方面: 1)確定酶結(jié)合的最適濃度確定酶結(jié)合的最適濃度. 2) 確定包被物質(zhì)的最適濃度確定包被物質(zhì)的最適濃度. 3)樣品往往會(huì)產(chǎn)生交叉反應(yīng)樣品往往會(huì)產(chǎn)生交叉反應(yīng). 4)樣品前處理時(shí)樣品前處理時(shí),使用的溶液必須考慮其影響抗體使用的溶液必須考慮其影響抗體對(duì)分析物識(shí)別的可能性對(duì)分析物識(shí)別的可能

15、性.(8)ELISA法的特點(diǎn)法的特點(diǎn): 1)適用現(xiàn)場(chǎng)快速篩選適用現(xiàn)場(chǎng)快速篩選; 2)適用常規(guī)方法難以檢測(cè)的農(nóng)藥適用常規(guī)方法難以檢測(cè)的農(nóng)藥; 3)適用環(huán)境監(jiān)控適用環(huán)境監(jiān)控.6.3 生物傳感器在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用6.3.1 生物傳感器的原理生物傳感器的原理 生物傳感器是指由一種生物敏感部件與轉(zhuǎn)換生物傳感器是指由一種生物敏感部件與轉(zhuǎn)換器緊密配合器緊密配合,對(duì)特定種類(lèi)物質(zhì)或生物活性物質(zhì)具有對(duì)特定種類(lèi)物質(zhì)或生物活性物質(zhì)具有選擇性和可逆響應(yīng)的分析裝置選擇性和可逆響應(yīng)的分析裝置. 傳感器的生物敏感層與復(fù)雜樣品中特定的目傳感器的生物敏感層與復(fù)雜樣品中特定的目標(biāo)分析物之間標(biāo)分析物之間,如酶與底物如酶與底物,抗原與抗體抗原與抗體,外源凝集外源凝集素與糖素與糖,核酸與其互補(bǔ)片段之間的識(shí)別反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生核酸與其互補(bǔ)片段之間的識(shí)別反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生一些物理化學(xué)信號(hào)的變化一